Stomach Health > žalúdok zdravie >  > Gastric Cancer > žalúdočné Cancer

Ploche ONE: Exome Sekvenovanie Identifikuje Včasné karcinóm žalúdka ako ranom štádiu pokročilého žalúdočné Cancer

abstraktné

žalúdočné karcinóm je jednou z hlavných príčin úmrtnosti súvisiacej s rakovinou po celom svete. Včasná detekcia a liečba vedie k vynikajúcej prognózou u pacientov so skorými rakovinou žalúdka (EGC), zatiaľ čo prognóza pacientov s pokročilou rakovinou žalúdka (AGC) je stále nedostatočná. Nie je jasné, či egcs a AGCS sú zreteľné entity, alebo či egcs sú počiatočných fázach AGCS. Vykonali sme celú exome sekvenovania zo štyroch vzoriek od pacientov s EGC a porovnal výsledky s tými z AGCS. V oboch egcs a AGCS celkom 268 génov boli bežne zmutoval a nezávislé mutácie boli naviac nájdené v egcs (516 génov) a AGCS (3104 génov). Vyššia frekvencia C > G prechody bolo pozorované u črevnej typu v porovnaní s difúznou typu karcinómu ( P
= 0.010). DYRK3, GPR116, MCM10, PCDH17, PCDHB1, RDH5 stroje a UNC5C
gény sú opakovane zmutoval v egcs a môže sa zúčastniť na začiatku karcinogenézy

Citácia :. Kang G , Hwang WC, Do IG, Wang K, Kang SY, Lee J, et al. (2013) Exome Sekvenčná Identifikuje Včasné karcinóm žalúdka ako ranom štádiu pokročilého rakoviny žalúdka. PLoS ONE 8 (12): e82770. doi: 10,1371 /journal.pone.0082770

Editor: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore

prijatá: 17. júla 2013; Prijaté: 27. októbra 2013; Uverejnené: 23 decembra 2013

Copyright: © 2013 Kang et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Táto štúdia bol podporený grantom od National Research Foundation of Korea (2012-P4KR 003) a grantu Samsung Biomedical Research Institute (# SBRI-SP1B20111). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy :. KW je zamestnaná Pfizer Inc. To však nič nemení vernosť autorovu na všetky politiky ploche jeden na zdieľanie dát a materiálov. Autori vyhlásili, že žiadne iné konkurenčné záujmy existujú.

Úvod

žalúdočné karcinóm (GC) je heterogénne ochorenie s mnohými etiológie v oblasti životného prostredia, alternatívnych ciest karcinogenézy a žiadny známy vysokofrekvenčný onkogénne rozrušenie [1], [2], [3]. Klasifikácia Lauren sa ukázalo ako užitočné pri hodnotení prirodzený priebeh GC, a to najmä s ohľadom na výskyt trendy, patologickým korelácie a etiologických prekurzorov [4]. Lauren zaradený adenokarcinóme žalúdka do čriev a difúznej morfologických vlastností nádoru [4], [5], [6]. Črevné typu karcinómy sú veril vzniknúť následkom chronickej atrofickej gastritídy spojenej s H. pylori stroje a črevné metaplázia [7]. Difúzny typ GC nie sú spojené s črevné metaplázia a môžu vznikať z jednobunkových mutácií v normálnom žalúdočných žliaz [4], [8], [9].

GC je jednou z hlavných príčin pre karcinóm súvisiace úmrtnosti na celom svete. Včasné zistenie a liečbu má za následok vynikajúcu prognózu u pacientov so skorými rakovinou žalúdka (EGC), zatiaľ čo prognóza pacientov s pokročilou rakovinou žalúdka (AGC) je stále nedostatočná. Je však jasné, či egcs a AGCS sú zreteľné entity, alebo sú rovnaké nádor postupuje od skorého do pokročilom štádiu [10]. Molekulárna podpisy rozlišujúce EGC od AGC sú dôležité pre pomoc pri identifikácii nových prognostických markerov a potenciálnych terapeutických cieľov.

V poslednej dobe sa exome sekvenovania v 22 [11] a 15 [12] Vzorky AGC ukázalo časté inaktivujúcich mutácie v bunkovej adhézie a chromatín-remodelácia gény a genetické zmeny líšili medzi podskupín rozdelených podľa Epstein-Barrovej (EBV), alebo H. pylori
stav mikrosatelitních nestabilita (MSI) infekcii a. Ak chcete ďalej skúmať genetické zmeny základnej GCS sme vykonali celú exome sekvenovania v štyroch spárovaných EGC a normálneho tkaniva, a porovnal výsledky s tými z AGCS.

materiáloch a metódach

Príprava vzoriek

nádoru a nenádorových žalúdočné tkaniva boli odobraté z gastrektómii vzoriek. Táto štúdia bola vykonaná po schválení od Institutional Review Board Samsung Medical Center, a všetci pacienti dal písomný informovaný súhlas pred zákrokom. U nádorových vzoriek, masy boli > 4 cm na hrubé kontrole a povrch sliznice z každého nádoru bol zhotovený. Po zapustenie do OCT médiách, bola tkanivo rez a H & E zafarbia. Vzorky > Obsah nádoru 90% boli vybrané pre extrakciu DNA s Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) a liečení RNase A na odstránenie zostávajúcej RNA. DNA bola extrahovaná z i párové neovplyvnené žalúdočné tkaniva, ktorý bol získaný vzdialeného od miesta nádoru a bolo potvrdené bez nádoru. MSI bola analyzovaná s piatimi NCI markerov ako bolo opísané skôr [13]. Prítomnosť EBV bola detekovaná EBV kódovanej RNA in situ hybridizácia
ako bolo popísané vyššie, a iba prípady s silným signálom v takmer všetkých bunkových jadier nádoru boli považované za pozitívny, [14]. Ďalšie podrobnosti pre vzorky EGC sú uvedené v tabuľke 1.

Exome obohatenie a sekvencovania

Exome obohatenia (SureSelect Human All Exon Kit, Agilent Technologies) a Illumina sekvencovania knižnice boli pripravené v súlade s výrobcom inštrukcie. V stručnosti, 3 ug genómovej DNA sa strihaný so systémom Covaris S2; DNA fragmenty boli na konci opravené, rozšírený o "A" základne na 3 'konci, ligován s spárované-end adaptérov a zosilnený (štyri cykly). Exome obsahujúce knižnice adaptér ligu boli hybridizovány po dobu 24 hodín s biotinylovaných oligo-RNA návnad a obohatená o streptavidínom konjugovaným magnetických guľôčok. Konečné knižnice boli ďalej amplifikovaný pomocou 11 cyklov PCR a podrobená Illumina sekvenovania na jednej dráhe sekvenceru HiSeq 2000 s cieľovou veľkosťou inzertu ~ 180 bp. Všetky sekvenovania bola vykonaná s spárovaným konci 65-bp prečíta a bola vykonaná podľa štandardného protokolu Iluminátmi je. V priemere ~ 136.3 miliónov čistota filtrovaného číta boli generované pre každú vzorku. Stredná percento duplikátu číta v dôsledku PCR a optické artefakty bola v našom súbore dát 0%, a ~ 123.7 miliónov jednoznačne mapované číta boli získané pre každú vzorku. V priemere 69,1% z číta v každej vzorke mal aspoň 50% prekrytie s nejakým cielené oblasti ± 100 bp v SureSelect celej knižnice exome návnady. Cieľovými regiónmi v každej vzorke boli radené tak, aby priemernou hĺbkou 113,7 ×, pričom ~ 98.8% dotknutých regiónov zahrnutých do ≥1 ×, ~ 94.3% ≥10 x, ~ 82.4% ≥30 ×, ~ 70.8% ≥ 50 ×, ~ 66.4% ≥60 x, ~ 62.2% ≥70 x, ~ 58.2% ≥80 x, ~ 54.4% ≥90 x a ~ 50.8% ≥100 x. Podrobné súhrny surového kvality dát sú popísané v tabuľke S1. Pre porovnanie, rovnaký algoritmus (SMART), ktorý sa používa v predchádzajúcom dátovom súbore vzoriek AGC [11], bola aplikovaná na tieto dáta na identifikáciu somatických variácií single-nukleotidových a inzercia /delécie (indels) sa vykonali zmeny z údajov krátkodobej čítaných sekvenčných. Dátový súbor bol uložený v Európskej nukleotidov archíve a môžu byť prístupné na http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB 4850.

Mutácie zistené exome sekvenovania boli ďalej overená pomocou PCR a sekvenovanie Sanger. V stručnosti, priméry sú navrhnuté za použitia softvéru Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu), a sekvencie sú uvedené v tabuľke S3. PCR-amplifikovanej produkty boli potom sekvencovania za použitia BigDye Terminátor v3.1 Cycle Sequencing Kit a ABI 3700 automatizovaného sekvenátoru (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Výsledky

Somatická zmeny v egcs

v celkom 2,389 somatické mutácie boli zistené v štyroch EGC vzoriek, z ktorých 1117 došlo v oblasti kódujúce alebo podstatnej zostrihu (627 missense, 32 nezmysel, 10 nevyhnutné mieste zostrihu, 169 a 279 indels synonymické) (Obrázok 1 a Tabuľky 2 a S2). Jeden GC s MSI-high mal 727 non-tiché mutácie vrátane nesúlad opravy génov ( MSH6 stroje a MSH3
), zatiaľ čo tri mikrosatelitním stabilné (MSS) vzorky mali v priemere 37, je rozdiel vo výške približne 20-krát. Tieto nonsynonymous-to-synonymické pomery v rakoviny MSS tendenciu byť vyššia, než je MSI-vysokej rakoviny, ale rozdiel nebol štatisticky významný. C > T a G > A prechody boli najčastejšie mutácie (61%) v egcs, a nebol zistený žiadny významný rozdiel v zmenám jednotlivých párov báz medzi MSI-high a rakoviny MSS (obrázok 2A a tabuľka S4). 784 génov, ktoré nesú non-tiché mutácie, 13 bola vykonaná mutácia v dvoch alebo viacerých vzoriek. Patrili medzi ne gény známe, že sa podieľa na žalúdočné karcinogenéze (
TP53) a je zaznamenané v Katalógu somatické mutácie v rakovine (kozmickej), ktoré majú byť zmutovaný v GC ( DYRK3, MCM10, PCDH17
a UNC5C
) (tabuľka 3). Génov vybraných pre overenie, PCDH17
mutácie sa s najväčšou pravdepodobnosťou nie je overená metódou Sanger z dôvodu nízkej frekvencie mutantný alely (Tabuľka S3). Je zaujímavé, že v difúznej typu EGC s MSI-high, čo EGFR
(c.2224G > A, p.V742I). Mutácia bola identifikovaná

Porovnanie EGC a AGC

Pre porovnanie našich výsledkov na EGC s tými AGCS, boli použité dva nedávno publikované údaje sekvenovania celej exome [11], [12]. Wang et al
. zistená 164 non-tichý a 48 synonymické mutácie v priemere v 22 vzorkách AGC s 116 x priemernej hĺbke krytia [11]. Zang et al
. zistený v priemere 50 non-tichý a 16 synonymom somatických mutácií v 15 vzorkách AGC s 96 × priemernou hĺbkou krytie [12]. V priamom porovnaní medzi štyrmi egcs a 37 AGCS, nebol zistený žiadny významný rozdiel v počte typ mutácie (Obrázok 1). K zmenám jednotlivých párov báz v egcs boli podobné ako v predchádzajúcej správe Wang et al
. [11], čo ukazuje výrazne vyšší počet C > T a G > A prechody v oboch MSS a MSI vysokými nádorov (obrázok 2A a tabuľka S4). Je zaujímavé, že C > G prechody boli častejšie u črevnej typu ako difúzny typu GC naprieč všetkými vzorkami MSS, ktorý zahŕňal tri egcs a 18 AGCS (Wilcoxonův rank suma test, P
= 0,010) (obrázok 2B a tabuľka S4).

v 37 AGC a 4 vzoriek EGC, non-tiché mutácie (missense, nonsense, esenciálne mieste zostrihu a indels) boli zistené v 3,372 a 784 génov, resp. V oboch egcs a AGCS, 268 génov boli bežne mutantného; BCORL1, LRP2, LRP12, MACF1, PRKCI stroje a TP53
gény boli mutované najmenej v dvoch vzorkách EGC a ACVR2A, CCNL1, CTNNB1, FMN2, Ptení, RPL22 stroje a TTN
gény, rovnako ako ostatné, boli významne spojené s AGCS s falošným zisťovanie miery < 0,2 [11], [12] (obrázok 3). Funkčná analýza anotácie s použitím David (http://david.abcc.ncifcrf.gov) skúmať gény nájdené prekrývania medzi týmito dvoma sadami vzoriek bolo zistené, že významne obohatené pojmy zahrnuté záväzný aktínu, cytoskelet, bunkovej projekcie a bunka-bunka križovatky (Tabuľka S5).

Diskusia

Hoci celý exome sekvenovania bola zaznamenaná u 37 vzoriek AGC [11] [12], došlo k žiadne také štúdie zamerané na zhodnotenie skorej karcinogenéze na genetickej úrovni. Ak chcete preskúmať kompletný repertoár somatických mutácií v egcs sme vykonali celú exome sled štyroch párových vzoriek EGC, a našiel zreteľné a spoločné genetické podpisov medzi egcs a AGCS, ktoré by mohli identifikovať gény zapojené do začiatku roka karcinogenéze a následné progresiu.

Epiteliálne nádory majú často variabilné mutácie spektra ukazujúce na konkrétne mutagénne podnety [15] [16]. Napríklad vysoká miera A > C a C > T prechody boli pozorované v pažeráku adenokarcinómov a slnkom vystavené melanómov, v uvedenom poradí, čo naznačuje, že tieto mutácie sú spôsobené gastroezofageálny reflux a expozícii ultrafialovému žiareniu [15], [17]. Predchádzajúce celého genómu sekvenovania štúdie v dvoch žalúdočných adenokarcinómov ukázalo časté C >, A a T > A zmeny v porovnaní s normálnymi genómu [18]. Tu sme zistili, že častou C >G prechody v črevnej typu karcinómov v porovnaní s difúznou typu GCS po vylúčení MSI vysokými GC. Naša jedinečná pozorovacie poskytuje záruku budúcej štúdie, ktoré definujú špecifické etiológie, ktoré potenciálne prispieva k pochopeniu zložitých a zle pochopil molekulárnych dráh črevnej typu GC.

Prostredníctvom porovnávacie analýzy sme identifikovali 268 prekrývajúce sa gény s non-tichých mutácií zdieľaných ako egcs a AGCS (obrázok 3). Asi jedna tretina non-tichých mutácií v egcs sú zdieľané s AGCS a 8% non-tichých mutácií nájdených v AGCS sú zdieľané s egcs. Predchádzajúce štúdie s analýza génovej expresie ukázala, že väčšina zmien spojených s egcs sú zachované v AGCS a ďalšie zmeny expresie označiť prechod z EGC AGC [10]. Celkovo tieto výsledky ukazujú, že EGC reprezentuje skorú molekulárnej fázy AGC, a bežne mutované gény hrajú dôležitú úlohu v progresii z EGC do AGC. reconfirmed sme, že TP53
je najčastejšie mutovaný gén GC, s TP53
mutácie nájdené v polovici EGC a dve tretiny vzoriek AGC. Medzi prekrývajúcich génov, AKAP9, CAMTA1, COL1A1, CTNNB1, KDM5A stroje a RPL22
boli zaznamenané ako onkogény, zatiaľ čo ATM, FBXW7, MSH6, NF1, Ptení, SETD2
a TP53
boli tumor supresorové gény podľa Sanger Gene sčítania (http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/census~~HEAD=pobj). Génov Rakovina sčítanie ľudu, najprv identifikovali EGFR
mutácie (c.2224G > A, p.V742I) v difúznym typu EGC s MSI-high. V nedávnej štúdii o 63 MSI vysokého GC, EGFR
mutácia bola priamym sekvenovania kinázovej doméne (exóny 18, 19, 20 a 21) [19] neidentifikuje. Rovnaký V742I mutácia bola hlásená u pacienta s rakovinou endometria a v gliómu bunkové línie [20], [21]. Klinický význam tejto vzácnej mutácie musí byť overená v blízkej budúcnosti.

Aj keď je výskyt mutácií v opakujúcich sa egcs bola relatívne nízka, 13 génov bola vykonaná mutácia v aspoň dvoch vzorkách, a mal veľmi málo synonymum, intronové a /alebo nepreložené mutácie. Z týchto 13 génov, DYRK3, GPR116, MCM10, PCDH17, PCDHB1, RDH5 stroje a UNC5C
môžu byť špecifické pre ranej fáze GC, čo naznačuje možnú úlohu v skorej rakoviny. V našom seriáli, PCDH17
mutácie došlo v črevnej typu GC s MSS, vrátane jedného EBV-pozitívna vzorka. Predchádzajúci globálnej genomické analýzy hrubého čreva a pankreasu rakoviny tiež odhalil missense mutácie v niektorých členoch PCDH
(protokadherin) podčeľade [22], [23]. Avšak mutácie detekované v našich egcs podľa Illumina sekvenovania neboli potvrdené sekvenovaním Sanger, pravdepodobne preto, že mutovaná alela frekvencie boli veľmi nízke. UNC5C
patrí do rodiny funkčnej závislosť receptorov, členmi, z ktorých má schopnosť indukovať apoptózu v neprítomnosti ich ligandy [24], [25]. Aberantne metylácie tohto génu bola popísaná v priebehu žalúdku karcinogenézy, a to metylácie zmizla veľmi pokročilých GC [26]. Pokiaľ ide o zostávajúce gény, ich funkčné relevancie GC zostáva nejasný.

Strata funkcie v bunkových adhéznych molekúl zvyšuje schopnosť nádorových buniek napadnúť okolité tkanivá, a dysfunkcia chromatínu-remodeláciu komplexu podporuje chromozómov nestabilite, ktorá riadi tumorigeneze [27]. Žiadny z našich vzoriek EGC malo mutácie bielkoviny mení chromatínu-prestavbu génov nájdených v AGCS, napríklad ARID1A, MLL3, PBRM1 stroje a MBD2
[11], [12], čo naznačuje chromatínu modifikáciu dochádza neskôr počas postupu GC.

Celkovo sa naša štúdia ukazuje, že EGC a AGC zdieľajú spoločné somatické mutácie, a AGC je spojená s ďalšími kumulatívne genetickými zmenami v bunkovej adhézie a génov, chromatínu-prestavbu. Molekulárna podpisy rozlišujúce EGC od AGC sú dôležité k identifikácii nových prognostických markerov a potenciálnych terapeutických cieľov. Väčšie štúdie sú nevyhnutné pre určenie biologickej významnosti opakovane mutovaných génov v egcs.

Podporné informácie
tabuľke S1.
Zhrnutie celý exome štatistík sekvencovania pre štyri páry žalúdočných vzoriek
doi :. 10,1371 /journal.pone.0082770.s001
(PDF)
Tabuľka S2.
Zoznam všetkých somatických mutácií v skorých karcinómov žalúdka zistených exome sekvenovania
doi :. 10,1371 /journal.pone.0082770.s002
(XLS)
Tabuľka S3.
Primery pre Sanger sekvenovania, alely frekvenciu a výsledky validácie
doi: 10,1371. /journal.pone.0082770.s003
(PDF)
Tabuľka S4.
Porovnanie somatické bodové mutácie spektier v žalúdku rakoviny nádorovými štátu a histologickom typu
doi :. 10,1371 /journal.pone.0082770.s004
(PDF)
tabuľke S5.
DAVID analýza dráha 268 prekrývajúcich sa génov medzi ranej a pokročilej rakoviny žalúdka
doi :. 10,1371 /journal.pone.0082770.s005
(XLS)

Other Languages