Stomach Health > žalúdok zdravie >  > Gastric Cancer > žalúdočné Cancer

Ploche ONE: Mutácie v intronové repetície Ataxia-Telangiectasia mutované (ATM) génu a proteínu ATM Strata v primárnej rakoviny žalúdka s mikrosatelitov Instability

abstraktné

ataxia-teleangiektázia mutovaného (ATM) je Ser /Thr proteín kináza, ktorá hrá dôležitú úlohu pri poškodení DNA indukovanej signalizácie a začatie kontrolného bodu bunkového cyklu signalizáciu v reakcii na poškodzujúcimi DNA činidiel, ako je ionizujúce žiarenie. Už skôr sme popísali straty ATM proteínu imunohistochemicky (IHC), v 16% ľudského karcinómu žalúdka (GC) tkaniva. Predpokladali sme, že ATM
gén intronové mutácie, ktoré sa zameriavajú mikrosatelitních nestability (MSI) spôsobiť stratu Bankomat bielkovín v podmnožine GC. Študovali sme mononukleotidy mutácií v IntronA ATM
gén ATM IHC a MSI v GC. Desať ľudských bunkových línií karcinómu žalúdka boli študované na bankomatu
génovej mutácie u IntronA, RT-PCR, priame sekvenovanie a imunohistochemicky. GC tkaniva 839 pacientov boli analyzované pre MSI a IHC ATM. Medzi nimi, 604 prípady boli analyzované na ATM
mutácie v intronom predchádzajúcich exon 6, exón 10 a exón 20. Dva ľudské GC bunkových líniách (SNU-1 a -638) ukázala ATM
intronom mutácie, delécie v RT-PCR a priame sekvenovanie, a strata bielkovín ATM IHC. Frekvencia ATM
mutácie, MSI, a ATM stratou proteínov bolo 12,9% (78/604), 9,2% (81/882) a 15,2% (134/839), resp. Analýza asociácií medzi MSI, ATM génovej mutácie a straty ATM proteínov odhalilo vysoko čo-existujúce ATM
génové zmeny a MSI. ATM
intronom mutácie a straty ATM proteín boli zistené u 69,3% (52/75) a 53,3% (40/75) MSI pozitívny GC. MSI pozitivita a straty ATM proteín boli prítomné u 68,4% (52/76) a 48,7% (37/76) GC s bankomatom intronové mutácie. ATM
mutácie a proteín ATM strata mala charakteristiky starobe, distálnej umiestnenie nádoru, veľké veľkosti nádoru, a histologické črevnej typu. Naša štúdia by mohlo byť interpretované ako ATM
génová mutácia v IntronA by mohli byť zamerané MSI a viesť k strate ATM proteín vo vybranej skupine GC.

Citácia: Kim HS, Choi SI, Min HL, Kim MA, Kim WH (2013) Mutácie v intronové repetície Ataxia-Telangiectasia mutované (ATM) génu a proteínu ATM Strata v primárnej rakoviny žalúdka s mikrosatelitních nestability , PLoS ONE 8 (12): e82769. doi: 10,1371 /journal.pone.0082769

Editor: Hoguen Kim, Yonsei University College of Medicine, Republic of Korea

prijatá: 21. júla 2013; Prijaté: 27. októbra 2013; Uverejnené: 06.12.2013

Copyright: © 2013 Kim et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Tento výskum bola podporená základná Science Research Program prostredníctvom National Research Foundation of Korea (NRF) financovaného Ministerstvom pre vedu, ICT & Budúce Planning (NRF-2012R1A1A2004648). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

ataxia-telangiectasia zmutovaný (ATM), gén je súčasťou reakcie DNA poškodenia (DDR) a je aktivovaný DNA dvouřetězcových zlomov (DSB), a signalizuje kontrolný bod bunkového cyklu spomaliť priechod buniek cez cyklus pre uľahčenie opravy DNA. Gén je lokalizovaný na chromozóme 11q22-23. ATM
gén je veľmi veľký, klenout genómovej oblasti s veľkosťou 150 kB, skladajúci sa z 66 exónov s kódujúce sekvencií 91668 bp.

ATM je zapojený v odpovediach na DSB, ktoré sa vyskytujú fyziologicky v špecializovaných bunkových typov, ako sú zárodočných buniek a lymfocytov. Proteín ATM pomáha bunky v rozpoznávania poškodený alebo zlomený reťazca DNA. Proteín ATM koordinuje opravy DNA tým, že aktivuje enzýmy, ktoré Oprava poškodeného pramene. Efektívne oprava poškodených vlákien DNA pomáha udržiavať stabilitu genetickej informácie bunky [1].
strata

ATM bola pozorovaná u 16% ľudského GC tkaniva vo veľkej skupine štúdie [2]. Inaktivácia bankomatu
génu môže byť často udalosť v rozvoji rakoviny ľudského žalúdka (GC); Avšak, udalosti spojené so stratou ATM
výraz v GC nebolo možné vysvetliť nízkym výskytom bankomatu
mutácie. Väčšina z ATM
identifikovaných mutácií v primárnych bunkových líniách GC a GC tkanív boli bodové mutácie [3].

Nesúlad opráv DNA (MMR) systém opravuje chyby, ktoré môžu nastať počas replikácie DNA, zatiaľ čo homológnej rekombinácie a non-homológnej koniec spájanie sú zapojené do opravy DNA DSB. Mutácie v DNA opravy DSB génov, ako je napríklad ATM, MRE11, RAD50, NBS1 stroje a ATR
, sú Predpokladá sa, hrajú úlohu vo vývoji gastrointestinálnych malignít s poruchou funkcie MMR. V kolorektálnym karcinómom s poruchou systému MMR, mutácie IntronA mononukleotidy repetíciami v ATM stroje a MRE11
bolo zistené, že za následok aberantne zostrihu, následne redukciou expresie proteínu štandardného typu [4 ].

Približne 10% GC je spojená s mikrosatelitních nestabilita (MSI). MSI sa odkazuje na zmeny v počte nukleotidov v opakovaní mikrosatelitních oblastí umiestnených v kódujúcich oblastí génov, a vedie posunovými mutácií. MSI bol identifikovaný v proteín kódujúcich oblastí známych cieľových génov, vrátane TGF-βRII, IGFIIR, Bax
[5-7] a hRAD50
gény [8]. hRAD50, BLM stroje a BRACA1
gény majú poly (A) mononukleotidy opakuje v kódujúcich regiónoch hMSH6
má (C) 8 traktu, NBS1
má (a) 7 trakt a ATM
má (T) 7 trakt. Frameshift mutácie týchto génov s rôznymi incidencia bola popísaná skôr [9-11].

Okrem množstva mutácií nahromadených v neutrálnych mikrosatelitních sekvencií, MSI tiež generuje mutácie v rakovinových génov, teda v tých génov, ktoré hrajú aktívnu úlohu v viacstupňovým procese karcinogenézy. Aj keď opakované sekvencie v kódujúcej oblasti génov, sú kratšie ako typický mikrosatelitních markery používané na mapovanie génov, ich sklon k podstúpi spontánny chyby sklz počas replikácie je stále vyššie, než je neopakujú sekvencií. Mutácie s intronové opakovania boli hlásené vyvolať zhoršenou expresie MRE11
gén [12,13]. Polypyrimidine opakovanie mutácie v bankomatu
génu môže narušiť správny zostrih mRNA [14]. Avšak, nie je tam žiadny dôkaz, že inzercia /delécie vyskytuje v týchto nekódovacích sekvencií mononukleotidy ovplyvniť normálnu ATM funkcie proteínu v MSI súvisiace s GC. V ľudskom tkanive GC s MSI, frekvenciu ATM
mutácie a združenia so stratou funkcie proteínu nie je jasne pochopil. My sme predpokladali, že zmeny mononukleotidy traktu intronom ATM
gén je spojená so stratou funkcie ATM bielkovín v GC s MSI.

Skúmali sme mutácie v intronové (T) 15 v ATM
génu intervenujúci sekvencie (IVS) predchádzajúce exon 6, ktoré vedú k odstráneniu 22 bp exónu 6 v ľudských nádorových bunkových línií žalúdočných , V tejto štúdii, mutácie bankomatu
génu spolu s prítomnosťou MSI boli skúmané v ľudských GC bunkových línií a primárnych GC tkanív. Naše výsledky ukazujú, že ATM
génu intronom mutácie časté v GC s MSI a bol významne spojené so stratou funkcie ATM proteínu.

Materiály a metódy

Ethics vyhlásenie

Táto retrospektívna štúdia bola vykonaná za použitia vzoriek cez políc po nich stanovená diagnóza, a všetky vzorky boli anonymné pred začatím štúdie. Táto retrospektívna štúdia bola schválená Institutional Review Board of Seoul National University Hospital (H-1010-065-336) s uvoľnením informovaného súhlasu za stavu anonymizácie.

Bunkové línie a tkanivové vzorky

Ten rakovina žalúdka u ľudí bunka lines- SNU-1, SNU-5, SNU-16, SNU-216, SNU-484, SNU-601, SNU- 620, SNU-638, SNU-668 a SNU-719 boli získané z kórejskej bunkové línie Bank (Soul, Kórea). Všetky bunkové línie boli pestované v RPMI1640 doplnenom 10% fetálneho hovädzieho séra (FBS; Hyclone, Lorgan, UT, USA) a antibiotikami (100 U /ml penicilínu G a 100 ug /ml streptomycínu), pri teplote 37 ° C vo zvlhčenej 5% CO 2 inkubátora. Bunková línia tkanivo array snímka z zozbierané a pevných bunkových línií ľudského GC bola získaná pre imunohistochémia (Superbiochips, Kórea).

formalínu pevné, parafínové zaliate vzorky tkaniva GC od 839 pacientov, ktorí podstúpili kuratívny gastrektómii pre primárna liečba rakoviny žalúdka v období od 1. januára 2004 a 31. st decembra 2005 na Seoul National University Hospital boli zhromaždené. Pacienti zahrnutie 577 mužov a 262 žien s priemerným vekom 57,6 rokov (rozmedzie: 4 do 87 rokov). Informácie o umiestnení nádoru bola získaná od 835 prípadoch: hornej tretine v 109, prostredná tretina v 323, dolnej tretine do 383, a celý žalúdka v 20 prípadoch. o klasifikácii Lauren báze uvádzajú rakoviny boli histologicky klasifikované ako črevnú typu v 381, difúzna druhu 327, zmiešaného typu v 123, a neurčený v 8 prípadoch. Z celkového počtu 839 prípadov, 165 boli čoskoro GC a 674 boli pokročilé GC. Lymfatických uzlín bol prítomný v 531 prípadoch a chýba v 308 prípadoch. Dvestoštyridsaťpäť pacientov bolo diagnostikovaných ako javiskový I, 254 ako štádium II, 291 ako štádium III a 85 ako javiskový IV. Adjuvantná chemoterapia po operácii bola vykonaná na 533 pacientov, čo zahŕňa 32 pacientov vo fáze I, 153 v druhej etape, 260 v stupni III a 82 v stupni IV. Priemerná doba sledovania bola 49,3 mesiacov (rozmedzie: 0-85 mesiacov). Lokálne recidíva bolo pozorované u 185 (21,0%), vzdialené metastázy v 85 (9,6%), a smrť akejkoľvek príčiny v 289 von 882 pacientov (32,8%). údaje o pacientovi prežitie, vrátane dátumu a príčin smrti, boli získané z kórejskej centrálnej onkologického registra, Ministerstvo zdravotníctva a sociálnych vecí, Kórea. Štandardné histologické vyšetrenie súčasťou posúdení typu rakoviny a patologickým štádiom tumoru, podľa kritérií stanovených v 7. ročníku AJCC Staging Manual [15].

extrakcie DNA a MSI stanovenie

nádorové tkanivo vzorky na sklíčkach boli skúmané pod svetelným mikroskopom. Oblasť nádoru, v ktorom je percento nádorových buniek prekročila minimálne 50% všetkých buniek v tejto oblasti a spárované plochu normálne slizničnej tkanivo, ktorý neobsahoval žiadne nádorové bunky boli označené a poškriabaný s čepele noža. Oškrabanú tkanivo sa zhromaždia v 1,5 ml mikroskúmaviek s obsahom 50 ul tkanivovej lyzačného pufra (0,5% Tween 20 [Sigma, St. Louis, MO], 100 mM Tris HCl [pH 7,6], 1 mM EDTA a 20 ug proteinázy K [ ,,,0],sigma]). Skúmavky boli inkubované po dobu 24 až 48 hodín pri teplote 55 ° C, dokiaľ nie je lyzačný pufor tkanivo obsahujúce bolo jasné. Proteináza K bola inaktivovaná inkubáciou pri 95 ° C počas 10 minút a extrahovaná DNA bola skladovaná pri teplote -20 ° C až do použitia. MSI bola hodnotená u loci BAT25, BAT26, D2S123, D5S346 a D17S250. Nádory bolo klasifikovaných ako MSI +, keď aspoň 2 (40%) z 5 mikrosatelitních markerov boli spojené s alelami zmenenej veľkosti nádorovej DNA v porovnaní s DNA z non-nádorovom tkanive.

Detekcia mutácií ATM
v intronom mononukleotidy opakuje

PCR amplifikácie bola vykonávaná v objeme 10 ul obsahujúcom 1 ul genómovej DNA, 5 pmol každý z vpred a vzad Nátery, a 5 ul Premix. Tridsať tri cyklov PCR bolo vykonané s parametrom cyklu 95 ° C počas 30 s, 30 s pri teplote žíhaní vhodné pre každý pár primérov a 65 ° C po dobu 1 minúty, nasledované 10 rozšírenie min pri 72 ° C.

Variácie mononukleotidy opakovaní v bankomatu
génu bola detekovaná pomocou testu PCR-based. Genómovej DNA bola amplifikovaná s primers- F-CCTTTTTCTGTATGGGATTATGG, R-TGAACATCTTGTGAAGGTTTCAG pre exon6 (T) 15 (155 bp), F-TCCTTTTAGTTTGTTAATGTGATGGA, R-GCTGTTGGGGTAGAAGCTGA pre exon10 (T) 15 (165 bp), a F-GCCAATGGAAGATGTTCTTGA, R- CATCTTGGTCACGACGATACA pre exon20 (T) 15 (178 bp).

Detekcia aberantne zostrihu v ATM

Celková RNA (2,5 ug) z ľudských nádorových bunkových línií žalúdočných pripravených TRIzolu činidlá (GIBCO-BRL) bola použitá pre syntézu prvého vlákna cDNA s Superscript II reverznej transkriptázy (GIBCO-BRL) a oligo-d (T) 12-18 primeru. Alikvotná časť reakčnej zmesi bola amplifikovaná pomocou PCR syntetizovať rôzne segmenty ATM cDNA.

PCR amplifikácie bola vykonávaná v objeme 20 ul, ktorý obsahuje 1 ul reverznej transkripcii cDNA, 5 pmol každého z primérov vpred a vzad, a 10 ul Premix. Tridsať päť cyklov PCR bolo vykonané s parametrom cyklu 95 ° C počas 30 s, 30 s pri žíhacie teplote vhodné pre každý pár primérov a 72 ° C po dobu 1 min, a následne 10 minút predĺženia pri 72 ° C. PCR produkty boli podrobené elektroforéze v 2% agarózovom géli obsahujúcom Ethidium bromid a vizualizované pod UV svetlom. β-aktínu bol použitý ako vnútorný štandard.

tri RT-PCR páry primérov odvodených od ATM
sekvencie (GenBank NM_000051) boli použité F-TGGTGCTATTTACGGAGCTG a R-TTCGAAAGTTGACAGCCAAA pre detekciu prepisy exónu 5-7 (veľkosť produktu: 347 bp), F-TCCCTTGCAAAAGGAAGAAA a R-TACTGGTGGTCAGTGCCAAA pre exón (veľkosť produktu: 504 bp) 9-11 a F-TGGAGAAGAGTACCCCTTGC a R-GATTGACTCTGCAGCCAACA pre exón 19-22 (veľkosť produktu: 415 bp ).

sekvenčné analýzou

Sekvenovanie bolo vykonané metódou dideoxy reťazca ukončenia použitím súpravy pre sekvencovania DNA (Applied Biosystems) a ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. Amplifikované PCR produkty boli purifikované s použitím enzymaticky presequencing kitu (Amersham Life Science, Cleveland, OH, USA), podľa inštrukcií výrobcu, a potom sa priamo sekvenované metódou BigDye terminačná (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sekvenačnej reakcie boli vykonávané na ABI 3100 automatizovaného sekvenátoru (Applied Biosystems, Biosystems, Foster City, CA, USA) a boli analyzované pomocou sekvenčné analýzou DNA 3.7 softvér dáta (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Nové dáta bola uložená v GenBank (prístupové číslo: KF704396)

Imunohistochémia

Reprezentatívny tumor-blokové úseky a bunka-Line Array rezy s hrúbkou 4 um sa deparafinizovány a rehydrated v odstupňovaná. alkohol. Antigén vyhľadávanie bolo dosiahnuté tlaku -cooking vzoriek v 0,01 mol /l citrátového pufru po dobu 5 minút. Králičie monoklonálne protilátky (klon Y170 získané z Epitomics, Burlingame, CA, USA) bola použitá pre imunohistochémia. ATM bola farbená v jadre normálnej žalúdočnej sliznice, stromálne bunky a lymfocyty. Intenzita bola hodnotená ako 0 (úplne negatívny), ± (nejednoznačný farbenie, signál pozorovali iba pri high-power mikroskopia s x 40 okulárom), + /3 (slabo pozitívna), ++ /3 (mierne pozitívny) a +++ /3 (silne pozitívne, takmer rovná lymfocytov a neutrofilov). Kritériá pre negatívnych prípadoch boli stanovené za menej ako 10% buniek zafarbených ako slabo pozitívna (+ /3) alebo vyššou intenzitou, to znamená viac ako 90% buniek vykazuje úplne negatívne (0) alebo nejednoznačné farbenie (±) [2 ].

Štatistická analýza

balíček SPSS 15.0 bol použitý pre štatistické analýzy. Boli použité Chi-kvadrát test a Cox modelu proporcionálneho rizika. Všetky P-hodnoty sú obojstranné a P hodnoty. ≪ 0,05 boli považované za významné pre štatistické metódy v tejto štúdii

Výsledky

mutácie u intronom mononukleotidy opakovania génu ATM v ľudskom žalúdku rakovina bunkové línie

Medzi 10 ľudských nádorových bunkových línií žalúdka, SNU-1 a SNU-638 boli charakterizované ako MSI pozitívne, bankomatu
génových mutácií pozitívne a ATM stratu, ktorú IHC. V SNU-1 a SNU-638, 22 delécie párov báz exónu 6, bola detekovaná pomocou RT-PCR a bolo potvrdené, v následnej analýze sekvencie (obrázok 1). SNU-5, SNU-16, SNU-484, SNU-601, SNU-620, SNU-668 a SNU-719 boli MSI negatívne a mali divoký typ ATM
gen. Aj keď SNU-216 bol MSI negatívny, to kryl mutácie v bankomatu
génu, a mal silnú expresiu Bankomat zistená IHC (tabuľka 1).
MSI
ATM
génová mutácia intronové mononukleotidy opakuje
ATM
sekvenovania
ATM
RT-PCR
ATM IHC
Bat 26
Bat 25
IVS 6
IVS 10
IVS 20
Exon 6
Exon 10
Exon 20
Exon 6
Exon 10
Exon 20
SNU-1 +++++ 22 bp delnono22-bp delnonoNegativeSNU-5 ----- nonononononoPositiveSNU-16 ----- ndndndnononoPositiveSNU-216 - +++ nononono nonoPositiveSNU-484-----ndndndnononoPositiveSNU-601-----ndndndnononoPositiveSNU-620-----ndndndnononoPositiveSNU-638+++++22-bp delnono22 bp del nonoNegativeSNU-668 ----- ndndndnononoPositiveSNU-719 ----- ndndndnononoPositiveTable 1. mikrosatelitov stav nestabilita a ATM
génovej profily ľudských nádorových bunkových línií žalúdka.
IVS, intervenujúce sekvencie; IHC, imunohistochémia. CSV na stiahnutie vo formáte CSV

mutácie v intronom mononukleotidy opakovaniami bankomatu
génu a mikrosatelitních nestabilita v žalúdočnej rakoviny tkaniva

Frekvencia intronové mutácie v ATM
gén bol stanovený ako 12,9% (78/604). Frekvencia ATM
génová mutácia bol 9,3% (50/540) v intronom predchádzajúcich IVS 6; 11,0% (59/534) v intronom predchádzajúcich IVS 10 a 8,8% (46/523) v intronom predchádzajúcich IVS 20; medzi nimi, IVS 6 a IVS 10 prekrývali v 39, 10 a IVS IVS 20 v 35, 10 a IVS IVS 20 do 34, IVS 6, IVS 10 a 20 IVS v 31 prípadoch (tabuľka 2). Frekvencia MSI pozitivity bola 9,2% (81/882) a ATM straty bielkovín bola 15,2% (134/839) v našej štúdii GC. V 596 prípadoch boli analyzované asociácie medzi MSI (obrázok 2A), ATM génová mutácia (2B) a strata ATM proteín (obrázok 3). ATM
intronom mutácie a straty ATM proteín boli zistené u 69,3% (52/75) a 53,3% (40/75) MSI pozitívny GC. MSI pozitivita a straty ATM proteín boli prítomné u 68,4% (52/76) a 48,7% (37/76) GC s bankomatom intronové mutácie. MSI pozitivita a ATM intronom mutácie boli zistené v 35,7% (40/112) a 33,0% (37/112) GC so stratou proteínov ATM (tabuľka 3). Frekvencia výsledkov ATM IHC vykazoval významne vyššiu stratu Bankomat v podskupine MSI pozitívne a ATM
mutácie pozitívny GC (obrázok 4A). Tridsať tri zo 596 prípadov (5,5%), majú všetky tri molekulárne vlastnosti (Obrázok 4b).
Umiestnenie
Opakovanie (divokého typu)
IntronA mutácie v GC
IntronA mutácie v MSI pozitívny GC
IntronA mutácie v ATM IHC negatívne GC
em <> ATM
IVS 6 (T) 1550/540 (9,3%) 42/50 (84,0%) 29/111 (26,1%) ATM
IVS 10 (T) 1559/534 (11,0%) 47/59 (78,7%) 29/111 (26,1%) ATM
IVS 20 (T) 1546 /523 (8,8%) 34/46 (73,9%) 22/107 (20,6%) ATM
IVS 6 alebo IVS 10 alebo 20 IVS (T) 1578/604 (12,9%) 53/76 (69,7%) 37/112 (33,0%) Tabuľka 2. Incidencies na ATM
génová mutácia intronom v žalúdočných rakovín (GC)
IVS, intervenujúce sekvencie .; MSI, mikrosatelitních nestabilita; IHC, imunohistochémia. CSV k stiahnutiu CSV
ATM IHC
MSI
ATM
mutácie
N
Negatívny
Pozitívne
NegativeNegative49768 (13,7 %), 429 (86,3%) Positive244 (16,7%), 20 (83,3%) Subtotal52172 (13,8%), 449 (86,2%) PositiveNegative237 (30,4%), 16 (69,6%) Positive5233 (63,5%), 19 (36,5%) Subtotal7540 (53,3 %) 35 (46,7%) Negative52075 (14,4%), 445 (85,6%) Positive7637 (48,7%), 39 (51,3%) Total596112 (18,8%), 484 (81,2%) Tabuľka 3. frekvencia expresie proteínu ATM v podskupín podľa mikrosatelit nestabilita (MSI), stav a ATM
intronom mutácie.
CSV na stiahnutie vo formáte CSV

patologickým korelácia ATM
génovej mutácie v GC

pacientov s GC ATM
génová mutácia boli spojené so starobou, veľké veľkosti nádoru, distálnej umiestnenie, typu čriev, hlbší invázie a nižšie recidívy. Pacienti GC s negatívnym ATM IHC boli spojené so starobou, veľké veľkosti nádoru, dobre sa stredne diferencovaného typu a črevné typu Lauren klasifikácie (tabuľka S1). Chi-kvadrát test bola vykonaná ATM
stav génovej mutácie v ATM IHC negatívne a pozitívne skupín s patologickým premenných. V negatívnom skupine ATM IHC, ATM
mutácie pozitívny GC boli spojené s vysokým vekom (p = 0,032) a distálnej polohe (p = 0,045). V kladnom skupine ATM IHC, ATM
génová mutácia bola spojená s dobre alebo stredne diferencovaný typ GC (p = 0,022) (tabuľka S1).

Analýza prežitie

Coxov pomerného rizika model bol použitý v oboch jednorozmerné a testy s viacerými premennými. Univariantní Cox regresná analýza celkové prežitie a prežitie ochorení voľného ukázala významnú prediktívnu hodnotu niektorých zavedených prognostické faktory, ako sú lymfatických uzlín, hĺbka nádoru a Lauren klasifikácie histologickom typu. Skupina pacienta, ktorý dostal adjuvantnej chemotherpy mali významne vysoké relatívne riziko celkovo (OS) a ochorenie prežívanie bez známok (DFS) (P < 0,001, relatívne riziko = 3,82 [95,0% interval spoľahlivosti, 2,81 až 5,18] pre OS a P < 0.001, relatívne riziko = 5,63 [95,0% CI, 3,69-8,58] za DFS). Avšak žiadne významné trendy relatívneho rizika (RR) bolo pozorované u ATM
intronom mutácie, straty MSI alebo IHC ATM. Analýza s mnohými premennými pomocou premennej hĺbky nádoru, stav lymfatických uzlín, Lauren klasifikácia histologické typu, adjuvantnej chemoterapie, ATM
bola vykonaná intronom mutácie, a výraz ATM proteín. ATM intronom mutácia má nižšie relatívne riziko s hraničné význam pre celkové prežívanie (p = 0,05, relatívne riziko = 0,60, [95,0% CI 0,36 až 1,00]) (tabuľka 4).
Celkové prežitie

Prežívanie bez známok ochorenia
Relatívne riziko
95,0% CI
hodnota P
N
relatívneho rizika
95,0% CI
hodnota P
N
Advanced Žalúdočné Cancer8.263.00-22.750.005965.051.81-14.130.00544Lymph uzla typu positive6.663.47-12.770.005963.201.58-6.480.00544Diffuse histology1.431.06 -1.940.025961.611.09-2.360.02544Adjuvant chemotherapy0.990.57-1.730.985962.171.00-4.720.05544 ATM
intronom mutation0.600.36-1.000.055960.560.29-1.080.08544ATM proteín loss1.190.82-1.730 .355961.100.67-1.810.70544Table 4. Multiviariačnou Cox regresnej analýzy.
CSV na stiahnutie vo formáte CSV

Diskusia

Naše výsledky ukázali, že mutácia IntronA opakovanie v bankomatu
génu vyústiť v aberantne zostavovanie, čo vedie k odstráneniu 22 bp a ATM bielkovín stratou expresie v GC bunkových línií. Tieto výsledky sú v súlade s predchádzajúcou správou [13], pokiaľ ide o identifikáciu defektu zostrihu v MRE11
predzvesť prepis spojená s mutáciou poly (T) 11 opakovaní v rámci intervenujúci sekvencie 4 (IVS-4), výlučne v MMR-deficitom nádorových bunkových línií a primárnych nádorov. Naše výsledky odhalili, že ATM straty bielkovín v GC významne koreluje s prítomnosťou intronom génových mutácií na ATM
.

U pacientov, ataxia-teleangiektázia, 70% -90% z ATM
mutácie sú nezmysel, posun rámu, alebo zostrih mutácie, ktoré skrátia proteín [16]. Podľa VESMÍRU databáz (http://www.sanger.ac.uk/cosmic), mutácie v kódujúce oblastí ATM
gén boli zistené u 5% (433 z 9249) z rôznych druhov rakoviny. Medzi ne patrí rakovina žalúdka ukázalo mutáciu iba v 1,35% (1 z 74). Aj keď ATM
génovej mutácie na GC bola popísaná skôr [3,9], podrobne vysvetlené bola obmedzená nízkou frekvenciou mutácie a relatívne vysoký výskyt funkčnú stratu ATM [2]. V našej štúdii, asi 70% MSI pozitívny GC ukázala významný ATM
génu intronové mutácie spojené so stratou proteínovej ATM. Naše výsledky silne podporujú, že intronové mutácie ATM
s podkladovým MSI je jedným z hlavných mechanizmov straty ATM v ľudskom GC. ATM strata je pripočítaný aberantne zostrihu IntronA spojené s skrátenie v MSI pozitívnych bunkových línií hrubého čreva rakovine. Ejima et al. Hľadali ATM
génové mutácie s použitím 62 párov oligonukleotidovými priméry, zodpovedajúce oblasti v rozmedzí od exónu 4 až exónu 65 ATM
a jej sprievodnými IntronA. Skrátenie mononukleotidy plochami ATM
intronom predstavoval 34 (87%) z 39 IntronA zmien. Tridsať jedna z nich sa nachádza v 5-hrubého čreva nádorových bunkových línií, ktoré majú MSI (LS180, HCT15, HCT116, SW48, a Lovo). Oni tiež ukázal nízku expresiu proteínu ATM v MSI pozitívny kolorektálneho karcinómu bunkových línií [14]. Výraz ATM je výrazne znížená v mnohých karcinómov prsníka, a nájdený žiadny ATM
mutáciu v tejto bunkovej línii [17]. To znamená, rôzne funkcie ATM
génové zmeny medzi gastrointestinálne a prsníka.

Okrem mutácií, nádorové supresorové gény môžu byť inaktivované metyláciou cytosinové zvyšky v CPG ostrovy, ktoré sa nachádzajú v promótor z mnohých génov. ATM
gén je nový cieľ pre epigenetické umlčanie pomocou nevhodné metylácie jeho proximálnej promotorové oblasti koreluje so zvýšenou radiosenzitivity a nízku expresiu proteínu v ľudskej kolorektálny nádorové bunkové línie [18] a ľudského gliómu bunkové línie [18]. bez akýchkoľvek ATM
génových mutácií.

MSI zacielenie na bankomatu
génu predstavujú spojenie medzi MSI a opravy DNA v GC. Niektoré štúdie ukazujú, že funkčné strata ATM sa zvyšuje v MSI a ľudský ATM
gén je hlavný cieľ pre inaktiváciu v MSI pozitívny GC bunkových líniách a tkanivách [19,20]. Dôvodom prekvapivo vysoký výskyt ATM
génu intronom mutácie v MSI pozitívny GC môže byť vzhľadom k mononukleotidy opakovania (T) 15, a s dĺžkou 13 nukleotidov alebo viac boli obzvlášť citlivé na tento cielené skrátenie [14 ]. Frekvencia ATM
génu frameshift mutácie (T) v exóne 7 6 kódujúce sekvencie v MSI pozitívny GC bolo hlásené, že iba 6% (2/36) [8], ktorá je oveľa nižšia ako naše pozorovania.

Uvádza sa, že nedostatok ATM zvyšuje citlivosť buniek na rastové inhibičné účinky inhibítora PARP, olaparib, v nádorových bunkách žalúdku so zníženou bankomatu
expresie [21]. Poly (ADP-ribóza) polymerázy, inhibítory sú v súčasnej dobe v klinických skúškach na rôznych rakovín, vrátane karcinómu hrubého čreva [22]. V GC, nedostatok ATM je známe, že prediktorom odpovede na inhibítor PARP [23-25]. Marker homologické rekombinácie, Rad 51, je známe, že prediktívne marker neoadjuvantnej chemoterapii anthracylcine založenú karcinómu prsníka [26], ako aj inhibítor PARP v GC [24].

Naše výsledky ukazujú, že ATM straty bielkovín nie je agresívny faktor GC, aj keď je významne spojená s nepriaznivým trendom HR v MSI negatívnom GC. To je porovnateľné s inými štúdiami, ktoré zostavujú stratu proteínu ATM ako nepriaznivý prognostický faktor [20]. V našich štúdiách, ATM
mutácie a ATM negatívne GC mali rozdielne klinické jednotky vlastnosti; Avšak, táto skupina nepreukázal žiadny rozdiel prežitie s ostatnými. V MSI negatívne skupine, HR GC so stratou proteínov ATM bola značne vysoká, však, v MSI pozitívnej skupiny, HR v GC so stratou proteínov ATM nebol významný. To znamená, že MSI je potenciálny molekulárnej faktorom, ktorý ovplyvňuje biologické správanie GC. Tak, naše štúdie podporujú tento štatút MSI by mohli ovplyvniť citlivosť na inhibítory PARP tým, že ovplyvňujú stav poškodenia DNA expresiu proteínu odozva cez mononukleotidy opakuje zmeny.

V súhrne možno konštatovať, ATM
génovej mutácie v GC je 12,9% a 33,0% z GC s ATM
génová mutácia je spojená so stratou ATM bielkovín. MSI pozitívny GC ukázala ATM
mutáciu v 69,7%. Naše výsledky naznačujú, že výsledok straty ATM a citlivosť na chemoterapeutickej látky, olaparib, by mohlo byť lepšie dohodnutý ak prípady sú stratifikované založené na ATM
status génová mutácia alebo MSI.

Závery

Naša štúdia ukázala, ATM
génu intronom mutácie je prítomná u 69% MSI pozitívny GC a 49% bankomatu
intronom mutácie je spojená so stratou bielkovín ATM. Tie naznačujú, že ATM
génu intronom mutácie zameraný mikrosatelitních nestabilita je spojená so stratou proteínov ATM v podskupine ľudského karcinómu žalúdka.

Podporné informácie
tabuľke S1.
patologickým korelácia karcinómu žalúdka sa génové mutácie ATM a prejavu ATM bielkovín.
doi: 10,1371 /journal.pone.0082769.s001
(DOCX)

Other Languages