žalúdok zdravie > žalúdočné Cancer > Ploche ONE: Resveratrol spomaľuje rast rakoviny žalúdka vyvolaním G1 fázy zatknutie a starnutia v SIRT1 závislá Manner

Ploche ONE: Resveratrol spomaľuje rast rakoviny žalúdka vyvolaním G1 fázy zatknutie a starnutia v SIRT1 závislá Manner


abstraktné

Resveratrol, prirodzene sa vyskytujúce polyfenolické zlúčeniny, bola hlásená vyvíjať protinádorový účinok ovplyvnením rôzne molekulárnej ciele. V tejto štúdii sme skúmali účinky a základné mechanizmy resveratrolu o rakovine žalúdka. Zistili sme, že resveratrol inhibuje proliferáciu buniek karcinómu žalúdka v spôsobom závislým od dávky. V koncentrácii 25 a 50 uM, resveratrol inhibuje životaschopnosť buniek a zmenšil klonogenní potenciál buniek karcinómu žalúdka. Liečba resveratrol zadržaný buniek karcinómu žalúdka v G1 fáze a viedol k starnutie miesto apoptózy. Regulátory bunkového cyklu a starnutie ciest, vrátane cyklin D1, cyklin-dependentnej kinázy (CDK4 a 6), p21 a p16, boli ich poškodeniu pôsobením resveratrol. Inhibičné účinky resveratrolu na rakovinu žalúdka boli overené in vivo
pomocou modelu nahých myší xenoštěpem. Resveratrol (40 mg /kg /d) pôsobí inhibičnej aktivity na rozvoj rakoviny žalúdka a výrazne znížila frakcií Ki67-pozitívnych buniek v nádorových vzorkách z nahých myší. Po ošetrení resveratrol, indukcia starnutia a zmeny v expresii regulačných orgánov zapojených do dráh bunkového cyklu a starnutie boli podobné tomu, čo sme pozorovali in vitro
. Avšak, vyčerpanie Sirtuin (SIRT) 1 reverznej vyššie opísané účinky resveratrolu ako in vitro stroje a in vivo
. Naše údaje naznačujú, že resveratrol inhibuje rakovinu žalúdka spôsobom SIRT1 závislým a poskytne podrobné dôkazy o možnosti uplatnenia resveratrol v žalúdku prevenciu a liečbu rakoviny

Citácia :. Yang Q, Wang B, Zang W, Wang X , Liu Z, Li W, et al. (2013) Resveratrol spomaľuje rast rakoviny žalúdka vyvolaním G1 fázy Zatknutie a Starnutie v SIRT1 spôsobom závislým. PLoS ONE 8 (11): e70627. doi: 10,1371 /journal.pone.0070627

Editor: Dominique Heymann, faculté de médecine de Nantes, Francúzsko

prijatá: 20. marca 2013; Prijaté: 19.června 2013; Publikované: 21. novembra 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený národná prírodná Science Foundation Číny (No. 81101869, 81100103, 81171536 a 81000868), národné Základný výskumný program Číny (973 programov, č 2012CB911202) a nezávislé inovácie Foundation Shandong University (2012TS108) .v investori nemal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

konkurenčné záujmy: .. autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

rakovina žalúdka (GC) je štvrtou najčastejšou rakovinou a druhou najčastejšou príčinou úmrtia súvisiace s rakovinou na svete. Podľa celosvetového odhadu celkovo 989,600 nových prípadov GC boli diagnostikované a minimálne 738,000 pacientov zomrelo na túto chorobu v roku 2008, čo predstavuje 10% z celkového počtu úmrtí na rakovinu [1]. Aj keď je výskyt GC klesá po celom svete, je stále vysoká v rozvojových krajinách, najmä v Číne [1], [2]. Predchádzajúce štúdie ukázali, intímny vzťah medzi chronickej gastritídy spôsobenej Helicobacter pylori infekcie stroje a vývoj GC [3]. Okrem toho, hostiteľskej genetické, životného prostredia, diétne a ďalšie faktory, ktoré boli zapojené do žalúdka onkogénne proces [1]. Vzhľadom k tomu, je stále ťažké vykonať včasnú diagnózu pre GC, väčšina pacientov je diagnostikovaná v pokročilom štádiu. Aj napriek zlepšeniu konvenčnú liečbu pokročilého GC, vrátane chirurgia, chemoterapia a rádioterapia, dĺžku alebo kvality života pacientov s pokročilým GC sú stále nedostatočné, [2], [4]. Preto je naliehavo potrebné skúmanie nových preventívnych liekov alebo terapeutických cieľov GC.

spotreba čerstvého ovocia a zeleniny prispieva k zníženiu výskytu rakoviny, vrátane GC [2], [5]. Klinické aplikácie tiež naznačujú, že niektoré bioaktívne diétne molekuly majú schopnosť inhibovať viac onkogénnych kroky [5] - [7]. Resveratrol (Res, 3,5,4'-trihydroxystilbon) je prirodzene sa vyskytujúci polyfenolické zlúčeniny prítomné v takmer 70 druhov rastlín, vrátane kože červených hrozna, arašidy, jahody a ďalšie [6] - [8]. Res bol prvýkrát zaznamenaná, aby vyvinula protinádorovej aktivity v roku 1997 [8]. Neskoršie správy ukázali, že Res prepožičiava inhibičné účinky na niekoľkých typov rakoviny, ako je rakovina hrubého čreva, rakovina prsníka a lymfómu, a má vplyv na rôzne molekulárnej ciele [9] - [11]. Sirtuin 1 (SIRT1), trieda III nikotínamid adenín nukleotidu (NAD +) - závislé na Histon /proteín Deacetylase, bola hlásená ako kľúčový cieľ Res v niekoľkých nádorových modeloch [9], [10]. Avšak, niektoré údaje ukazujú, ktoré sú v rozpore výsledky naznačujú, že Res vykazuje chemoprotektívne účinky nezávislé na SIRT1 [11]. Inhibičné účinky Res na GC a podkladovým mechanizmu nie sú dobre preštudovaný.

V tejto štúdii sme ukázali, že Res inhibuje proliferáciu buniek GC in vitro
. Liečba res indukované zastavenie bunkového cyklu vo fáze G1 a viedlo k bunkové starnutie. Tieto účinky rezolúcie boli vrátené podľa vyčerpania SIRT1. Inhibičnej aktivity SIRT1 závislé na OZE na GC buniek boli tiež overené in vivo
. Celkovo vzaté, naše výsledky naznačujú, že Res vykazuje inhibičné účinky SIRT1 závislé na GC a navrhuje terapeutickú úlohu pre OZE v GC.

materiáloch a metódach

Ethics Prehlásenie

Všetko štúdie na zvieratách boli schválené etickou komisiou Shandong University School of Medicine (No. 001 v roku 2011 na Animal Ethics schválenie) a bolo vyvinuté všetko úsilie, aby sa minimalizovalo utrpenie.

bunkové línie, Kultúra podmienky a Res Liečba

Human GC bunkové línie AGS (získaná z buniek Resource Center, Shanghai ústavu biochémie a bunkovej biológie na Chinese Academy of Sciences), BGC-823 a SGC-7901 (zakúpené z Číny Center for Type Culture Collection, Wuhan, Čína) boli použité v tejto štúdii. Bunky boli kultivované v F12 (AGS) alebo RPMI 1640 (BGC-823 a SGC-7901) s obsahom 10% FCS, 100 jednotiek /ml penicilínu a 2 mmol /L L-glutamínu pri 37 ° C vo zvlhčenej atmosfére obsahujúcej 5% CO 2. Vysoká čistota Res bol zakúpený od firmy Sigma (St. Louis, MO, USA), sa rozpustí v DMSO a pridaná do kultivačného média v uvedenom spojení. Všetky experimenty boli vykonávané 24 hodín po Res doplnení, pokiaľ nie je uvedené inak.

Malé Interference RNA transfekcia

Chemicky modifikované malé interferujúce RNA (siRNA), ktoré cielia SIRT1 a kontrolné siRNA boli zakúpené od GenePharma (Shanghai , Čína). Sekvencia SIRT1 siRNA bola 5'-CCAUCUCUCUGUCACAAAUTT-3 '. Bunky boli inkubované cez noc a potom transfekovány siRNA použitím Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) podľa protokolu výrobcu. Štyridsať osem hodín po transfekciu siRNA, boli bunky ošetrené 50 uM Res po dobu 24 hodín predtým, než ďalšie štúdium.

testu životaschopnosti buniek

proliferácia bola hodnotená za použitia Cell titer 96 ® vodná Riešenie test proliferácie buniek (Promega, Madison, WI, USA). Stručne, 2 x 10 3 bunky boli schovať na 96-jamkové doštičky a nechali sa rásť po dobu 24 hodín. Dvadsaťštyri hodín neskôr sa 20 ul MTS (3- (4,5-dimetyl-thiazol-2-yl) -5- (3-karboxy-metoxyfenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium) bol pridaný do každej dobre. Po inkubácii po dobu 3 hodín pri teplote 37 ° C sa absorbancia pri 490 nm bola zaznamenávaná na Varioskan Flash lamelová Reader (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Životaschopnosť buniek bola vypočítaná podľa tohto vzorca: Relatívna životaschopnosť buniek = (priemerná absorbancia liečenej skupiny - priemerná absorbancia blanku) /(priemerná absorbancia ovládacieho prvku skupinu- priemernej absorbancie blanku). Testy boli vykonávané v triplikátech a opakuje trikrát.

Colony Formation Test

Bunky boli vrúbľovať do 6-jamkových doštičiek (300 alebo 500 buniek na jamku) a inkubované po dobu 10 dní, kým kolónie boli dostatočne veľká, aby sa jasne rozoznať. Bunky boli fixované metanolom a zafarbené kryštálovou violeťou a počet kolónií s viac ako 50 buniek bol počítaný ručne. Experimenty boli vykonávané v triplikátech a opakuje trikrát.

Cell Cycle Analysis

Bunky boli zozbierané, pevne s vopred chladeného 70% etanolu pri teplote 4 ° C cez noc a potom zafarbené propidiumjodidom (Beyotime , Jiangsu, Čína), obsahujúci RNase A pri teplote 37 ° C počas 30 minút v tme. Distribúcia bunkového cyklu bola stanovená za použitia prietokového cytometra (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) a dáta boli analyzované pomocou software multicycle (Systems Phoenix Flow, San Diego, CA, USA). Experimenty boli vykonané nezávisle trikrát.

Apoptóza Assay

Detekcia a kvantifikácia apoptózy boli vykonávané značenie DNA zlomov za použitia in situ bunkovú smrť Detection Kit, TMR červená (Roche Applied Science, Bazilej, Švajčiarsko). Bunky alebo parafínové rezy xenoimplantátů boli značené pomocou TUNEL podľa pokynov výrobcu. Pre bunky, liečba s 0,2 mM H 2O 2 po dobu 12 h slúžila ako pozitívna kontrola. Na parafínových rezoch, pozitívne kontroly boli získané od Millipore (Billerica, MA, USA). Jadrá boli kontrastne DAPI (Beyotime) a diapozitívy alebo úseky boli zobrazené pomocou fluorescenčnej mikroskopie (Olympus, Tokyo, Japonsko) pomocou softvéru cellSens rozmer. Experimenty boli vykonané nezávisle trikrát.

β-galaktozidázy farbenie

Starnutie bola hodnotená za použitia starnutie beta-galaktozidázu Farbenie Kit (Beyotime). V stručnosti, bunky alebo mrazené rezy xenoimplantátů boli fixované a potom inkubované s čerstvo pripraveným beta-galaktozidázy (β-gal) Farbiace roztok pri teplote 37 ° C cez noc. Experimenty boli vykonané nezávisle trikrát.

Stabilné lentivirálním-krátka vlásenka RNA (zhrnieme) GC buniek

lentivirálním vektory, obsahujúce ovládač alebo SIRT1 zhrnieme boli postavené GenePharma a použitej na transfekciu BGC-823 buniek. Efektívne Vyradenie SIRT1 bola overená pomocou Western Blot. Pre stabilné transdukciu, ovládacieho lentivirus infikovaných alebo SIRT1 zhrnieme lentivirus infikovaných BGC-823 bunky boli kultivované v kompletnom médiu dodávané s 2 ug /ml puromycinu počas štyroch týždňov a považované za LV-C a NN-S, v danom poradí.

nahým myšiam modeli xenoimplantátu

Žena athymických Balb /c nahých myší (6 ~ 8 týždňov) boli zakúpené z Peking University (Peking, Čína) a boli udržiavané za špecifických podmienok bez patogénov na kľúč laboratórium kardiovaskulárne Prestavba a funkcie výskumu, Qilu nemocnice, Shandong University. Myši boli náhodne rozdelené do štyroch skupín (8 myší pre každú skupinu): skupina I a II, BGC-823 bunky (1 x 10 6 buniek na injekcie do 0,1 ml PBS) sa subkutánnou injekciou do boku oblasti nahých myší; skupina III, LV-C (BGC-823 buniek) bol injekčne; a skupina IV, LV-S (BGC-823 buniek) bol injekčne. Po implantácii, nahé myši zo skupín II, III a IV sa liečilo Res (40 mg kg -1 v 0,1 ml rastlinného oleja, podávané žalúdočnou sondou, raz denne). Podkožný veľkosť nádoru bola meraná posuvným meradlom a objem nádoru sa vypočíta podľa vzorca (dĺžka) x (šírka 2) /2. Myši boli usmrtené štyri týždne neskôr. Nádory boli zozbierané a spracované pre Western blot a imunochemických štúdií.

Real Time-kvantitatívnej PCR (RT-qPCR)

Celková RNA v bunkách bola izolovaná za použitia TRIzolu činidla (Invitrogen) a prevedie na cDNA s použitím reagenčnej súpravy PrimeScript ™ RT (Takara, Tokio, Japonsko). RT-qPCR bola vykonaná pre gény, vrátane cyklin D1, cyklin-dependentnej kinázy 4 (CDK4), p21 a beta-aktínu, ako bolo opísané skôr [12]. Sekvencie amplifikačních primérov sú uvedené v tabuľke S1. Expresia mRNA cyklin D1 CDK4 a p21 je normalizované na beta-aktínu vzhľadom na kontrolu za použitia 2 -ΔΔCt metódy. Každý experiment bol opakovaný trikrát.

Western Blot

Celkový proteín z buniek alebo nádorových vzoriek bola extrahovaná RIPA lyzačním pufra (Beyotime), ako je popísané [12]. Koncentrácia proteínu bola stanovená pomocou BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Membrána bola sondovania s protilátkami proti SIRT1 (abca, Cambridge, MA, USA), bcl-2, Bax, kaspázy-3, cyklin D1, CDK4 a 6 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), p16 a p21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Sekundárne protilátka bol použitý s chrenovou peroxidázou (HRP) konjugovanou anti-králičie alebo myšou protilátky. Proteínové pásy boli vizualizované za použitia systému ECL (Pierce). β-aktínu (Cell Signaling) slúžila ako kontrola nanášania.

Imunohistochémia

Nádorové vzorky z nahých myší boli zbavené parafínu, rehydratované a antigén vyvolané. Rezy boli inkubované s protilátkou proti Ki67 (1: 500, abca) cez noc pri 4 ° C. HRP-konjugovaná anti-králičie IgG a DAB farbenie boli použité pre vizualizáciu protilátky Ki67. Sklíčka bola kontrastne nakoniec hematoxylínom. Sklíčka boli zobrazené pomocou svetelného mikroskopu Olympus (Tokyo, Japonsko) pomocou softvéru cellSens rozmer. Tieto Ki67-pozitívne bunky boli počítané manuálne a percento Ki67-pozitívnych buniek bolo hodnotené na poli. Päť samostatných polí boli počítané pre každú sekciu.

Štatistické analýzy

Údaje boli vyjadrené ako priemer ± SD. Štatistická analýza bola vykonaná pomocou štatistický balík pre spoločenských vied (SPSS, verzia 16.0, Chicago, IL, USA) jednocestným ANOVA s Tukom testom post-hoc. P-hodnoty menšie ako 0,05 boli považované za štatisticky významné.

Výsledky

Res inhibuje životaschopnosť GC buniek v SIRT1 spôsobom závislým na

Tri GC bunkové línie (AGS, BGC-823 a SGC-7901) boli skúmané v našich experimentoch. Kultiváciu buniek vo vozidle (0,1% DMSO) neovplyvňuje životaschopnosť buniek (dáta nie sú ukázaná). Avšak, ak sa nechajú reagovať s rôznymi koncentráciami Res po dobu 24 hodín, bola proliferácia buniek v závislosti na dávke inhibovaný na 25, 50, 100 a 200 uM Res (obrázok 1A). Za zmienku stojí, množenia AGS zrejme inhibovaná, keď boli ošetrené 10 uM Res, ktoré neboli pozorované v ďalších dvoch bunkových línií (1A). Vo všetkých troch bunkových línií, za prítomnosti 100 uM Res bolo dostatočné pre indukciu inhibícia viac ako 50% rast (56,78% pre AGS, 54,87% pre BGC-823 a 52,16% pre SGC-7901, v danom poradí). Z tohto dôvodu, 25 a 50 uM Res boli použité pre ďalšie experimenty. Ak chcete zistiť funkčné úlohu SIRT1 v zaobchádzaní Res sme zrazil SIRT1 vyjadrenie pomocou špecifickej siRNA. Účinné inhibícia SIRT1 expresie bola potvrdená metódou Western blot (obrázok 1B). Výsledky testu ukázali, že v MTS SIRT1-ochudobneného buniek, Res neinhibuje proliferáciu buniek (obrázok 1C). Tieto dáta ukazujú, že Res je schopný inhibovať proliferáciu buniek, a GC, že inhibičný účinok môže byť zachránená vyčerpanie SIRT1.

Res znižuje klonovacích potenciálu GC buniek v SIRT1 spôsobom závislým na
< p> nádorových buniek, sa zistilo, že je oveľa citlivejší ako parameter životaschopnosti pre posúdenie účinku lieku tvorby kolónií. Tak, úsilie bolo potom ktorého cieľom je určiť vplyv Res na klonogenní potenciálu GC buniek. Res, pri koncentrácii 25 uM, viedlo k významnému zníženiu ložísk, číslami a veľkostí v GC buniek. Po ošetrení 50 um Res je klonogenní potenciál ďalej znížená. Avšak, porazený z SIRT1 pred liečbou Res zvýšil počet ložísk na úroveň porovnateľnú so skupinou vozidla (obrázok 2).

Res indukuje akumuláciu GC buniek v G1 fáze spôsobom, ktorý je závislý na SIRT1

Ak chcete skontrolovať inhibičný účinok Res na GC buniek, sme vykonali analýzu bunkového cyklu. Pozorovali sme, že 25 a 50 um Res zvýšil podiel buniek vo fáze G1 v oboch BGC-823 a SGC-7901 buniek (obr 3a a 3b). Indukcia G1 fáza zatknutie Res bola tiež závislá na dávke. Res v koncentrácii 50 uM vykazovali silnejší účinok, než tomu bolo pri 25 uM. Zvýšenie počtu buniek v G1 fáze bol sprevádzaný poklesom bunkových populácií najmä vo fázach S. Vyčerpanie SIRT1 pred liečbou Res zmenšil indukciu G1 fázy rezolúcie (obrázky 3A a 3B). Za účelom potvrdenia vyššie uvedených výsledkov, sme skúmali expresiu regulátorov bunkového cyklu vo fáze G1, vrátane cyklin D1, CDK4, CDK6, p21 a p16 v BGC-823 buniek. Ako je ukázané na obrázku 3C, v Res ošetrených BGC-823 bunky, hladiny proteínové aktivátory G1 /S prechode (cyklin D1, CDK4 a CDK6) znížila, zatiaľ čo hladiny proteínové inhibítory CDK (CDKIs) (p21 a p16) zvyšuje. Naproti tomu, tieto zmeny neboli nájdené v SIRT1-ochudobneného BGC-823 buniek, ktoré boli ošetrené 50 uM Res. Podobné výsledky boli získané z RT-qPCR cyklin D1, CDK4 a p21 (obrázok 3D).

Nedostatok sub-G1 bunky ukázali, že liečba Res nespúšťa apoptózu v GC buniek (obrázok 3A) , čo bolo v súlade s výsledkami experimentov TUNEL označovaní z BGC-823 bunkách (obr S1A). Úrovne proteínové molekuly apoptózy súvisiace, ako je Bcl-2, Bax a kaspázy-3, z každej skupiny boli porovnateľné (obr S1B). Celkovo vzaté, naše výsledky ukazujú, že Res indukuje zástavu G1 fázy v GC buniek spôsobom závislým SIRT1 a neindukuje apoptózu.

Res indukuje Starnutie z GC buniek spôsobom, ktorý je závislý na SIRT1

v našich rukách, Res má za následok zastavenie rastu skôr ako zvýšenej apoptózy. Preto sme urobili ďalšie úsilie s cieľom preskúmať, či Res by mohlo vyvolať starnutie v GC buniek. beta-Gal farbenie, špecifickým markerom pre cicavčie starnúcich buniek, bol použitý. Po ošetrení Res sme mali zvýšenia frakcie buniek boli zafarbené s beta-Gal. Avšak, predbežná úprava s SIRT1 siRNA zablokované Res-indukovanej bunkové starnutie (obrázok 4). Podobné výsledky boli získané z oboch BGC-823 a SGC-7901 bunky, čo naznačuje, že Res závislých osôb na SIRT1 k vyvolaniu bunkovej starnutie v GC buniek.

Res inhibuje rast nádoru in vivo v SIRT1 spôsobom závislým na

Ďalej, ďalšie štúdie boli vykonané na stanovenie účinkov na Res BGC-823 xenoimplantáty rast v nahých myšiach. Pre in vivo
štúdii boli použité stabilné transdukovaných lentivirovým-zhrnieme BGC-823 buniek. Zo štyroch SIRT1 zhrnieme lentivirů, LV-1 a LV-4 vyvíjaný zjavné umlčanie účinky na SIRT1 výrazu (obr S2). Po štyroch týždňoch skríningu, expresia SIRT1 bola udržiavaná na zníženie hladiny v stabilnej lentivirovým-zhrnieme BGC-823 bunkách (obr S2). Stabilné LV-1 lentivirovým-zhrnieme bunky BGC-823 bol použitý v následných štúdiách xenografe, pretože silnejší inhibičné účinky na SIRT1 expresiu v porovnaní s LV-4. Všetky zvieratá prežili až do konca našich experimentov, a žiadny zjavný rozdiel vo svojej telesnej hmotnosti (dáta nie sú uvedené). Štyri týždne po implantácii, meranie objemu nádorov ukázala, že liečba Res významne znížila rast BGC-823 xenografe (RES versus kontrola: 0.5728 ± 0,2276 cm 3 vs 1.4288 ± 0,1741 cm 3, P 0,001) , Stabilné transdukcie kontrolného zhrnieme lentivirus nijako významne ovplyvniť objem nádoru (Res vs Res + Ci: 0.5728 ± 0,2276 cm 3 vs 0,68 ± 0,0672 cm 3, P = 0,603). Avšak, v SIRT1-vyčerpaných xenoimplantátov, inhibičné účinky Res na rast nádoru bolo zachránených (Res + Si vs Res + CI: 1.2313 ± 0,1777 cm 3 vs 0,68 ± 0,0672 cm 3, P & lt; 0,001, Res + Si vs ovládanie: 1.2313 ± 0,1777 cm 3 vs 1,4288 ± 0,1741 cm 3, P = 0,123) (Obrázok 5A). V Res ošetrených xenoimplantátech, proliferáciu markeru, Ki67, výrazne znížil (obrázok 5B) (% z Ki67-pozitívnych buniek, Res versus kontrola: 3 ± 1,8 vs 44,67 ± 3,79, P 0,001). Starnutie bolo pozorované v xenografe z Res-ošetrených myší označených β-gal farbenie (obrázok 5B). Avšak, žiadny zrejmý apoptóza bola vyvolaná Res v xenografe (obr S1D) a neboli pozorované žiadne zmeny v regulátory apoptózy, ako je Bcl-2, Bax a kaspázy-3 (Obr S1C). Tieto výsledky boli v súlade s in vitro
experimentov. Navyše zmeny v expresii regulátorov bunkového cyklu, vrátane cyklin D1, CDK4, CDK6, p21 a p16 boli podobné tomu, čo sme pozorovali in vitro
(obrázok 5C). Všetky zmeny pozorované v Ki67, beta-Gal a regulátorov bunkového cyklu boli obrátené SIRT1 vyčerpania (obr 5B a C) (% z Ki67-pozitívnych buniek, Res + Si vs Res + CI: 46,32 ± 6,03 vs 2,65 ± 1,53, P & lt; 0,001, Res + si vs ovládanie: 46,32 ± 6,03 vs 44,67 ± 3,79, p = 0,946)

Diskusia

Res, prírodné polyfenolov, je v súčasnej dobe hodnotená ako sľubná protinádorových. agentom. Aj keď bolo preukázané, že prepožičiavajú antiproliferatívny účinky na niekoľko typov rakoviny a to ako v bunkovej kultúre a xenograftových modelov [9] - [11], jeho chemoprevence účinky na GC a základný mechanizmus neboli dobre preštudovaný. V tejto štúdii sme preukázali, že Res inhibuje proliferáciu bunkových línií GC (AGS, BGC-823 a SGC-7901). Aktivita anti-rast bol pozorovaný po bunky boli ošetrené 25 uM Res po dobu 24 hodín, a inhibičný účinok bol závislý od dávky. Pri koncentrácii 50 uM Res inhibícia pomery pre tieto tri bunkové línie boli 41%, 34% a 32%, v uvedenom poradí. Ak je koncentrácia Res ďalej zvýšil, bola posilnená inhibičné účinky. Ako 100 a 200 um Res inhibuje rast o viac ako 50% v porovnaní so skupinou s nosičom. Okrem toho, že čím vyššia dávka Res je príliš veľká pre dosiahnutie in vivo stroje a preto nemá žiadny zmysel v klinickom prostredí [13], [14]. Z tohto dôvodu sa spodná účinné koncentrácie 25 a 50 um Res boli použité v nasledujúcich štúdiách. Inhibícia aktivity rastu Res zdá byť bunkovo ​​špecifický, ako IC 50 sa líši v závislosti od typu buniek a pohybuje sa od 27 pM do 180 uM, [9], [10], [15], [16]. Niektoré z týchto štúdií ukázali, že Res vykazuje inhibičné účinky v závislosti na čase [15], [16]. Koncentrácia a trvanie liečby Res použité v našej štúdii boli v súlade s väčšinou správ z ďalších skupín, [8], [9], [16]. Za in vivo
štúdii, spôsob podávania sme použili, je sondou, pretože to je spôsob, ktorý sa bežne používa u myší, ako alternatíva k intraperitoneálna injekcia [15], [17]. Okrem toho, štúdie na myšiach ukázali, že je Res vstrebať po perorálnom podaní a môžu byť nájdené v tele [17], [18]. Pri použití in vivo
Res výrazne znížila proliferáciu buniek, ako je charakterizovaný Ki67 výrazu, ktorý je v súlade s výsledkami z našich in vitro
experimenty v.

Res moci spomaliť proliferáciu nádorových buniek prostredníctvom rôznych mechanizmov, medzi ktoré patrí, regulácia bunkového cyklu je dôležitá [9], [15], [19]. Náš in vitro
dáta ukázali, že liečba GC buniek s Res indukuje fáze G1 zatknutie. G1 fáze je prvou zo štyroch fáz bunkového cyklu, ktorá sa koná v eukaryotické bunkové delenie. G1 je obzvlášť dôležité fázy bunkového cyklu, pretože to je bod, v ktorom sa bunka sa zaväzuje k kola rozdelenie. Progresia cez G1 fáze vyžaduje vznik a pôsobenie cyklin D-CDK4 alebo -CDK6 komplexov. Tieto komplexy potom fosforyluje retinoblastóm, čo vedie k uvoľneniu E2F transkripčných faktorov a nadväzujúcim transkripcie génov zapojených do progresie S fázy. Činnosť cyklin D-CDK komplexy sú upravené proti prúdu inhibítory, vrátane členov INK (p15, p16 a P18) a CIP rodín (p21, p27 a p57) [20], [21]. V rovnakom duchu, v sprievode s G1 fázy zatknutie, sme pozorovali down-reguláciu cyklin D1 CDK4 a CDK6 a upregulaci p21 a p16 v Res-ošetrených GC buniek. Naše in vivo
výsledky expresných hladín týchto regulátorov bunkového cyklu v nádorových vzorkách sú v súlade s in vitro
výsledky. Naše výsledky sú tiež v súlade s tými predchádzajúcimi štúdiami [15], hoci niektorí iní hlásili, že S fáza zástava je vyvolaná Res [9], [19]. Pretrvávanie zastavenie rastu môže viesť k apoptóze alebo starnutia v bunkách. Vzhľadom k tomu, ako P21 a P16 signálne dráhy podieľať na progresiu Senescence sprostredkované rôznymi typmi stresu [22], [23], sme vykonali beta-Gal farbenie. Liečba res výrazne zvýšila frekvenciu zostárnutých GC bunkách spôsobom závislým od dávky. Bunková Senescence Program predstavuje významnú bariéru proti začatiu rakoviny a vývoj [24], [25]. Hoci predchádzajúce štúdie ukazujú, že napriek útlm oxidatívneho stresu a zlepšenie metabolizmu, Res vykazuje anti-aging účinky ako in vitro stroje a in vivo
[26] - [28], opačné účinky bolo preukázané, že u rakoviny. Bolo zistené, res vyvolať inhibíciu rastu starnutia, rovnako ako v niekoľkých typov rakoviny [29], [30]. Dvojaký role Res v bunkovej starnutie, spomaľujúce starnutie v normálnych tkanivách a urýchľuje starnutie v nádoroch, z neho robí ideálneho kandidáta pre prevenciu a liečbu rakoviny.

Apoptóza je ďalší spoločný efekt, ktorý je zvyčajne pozorované v Res ošetrených rakovinové bunky [9], [11], [15], [16]. Experimentálne dôkazy naznačujú, že apoptóza môže byť sprostredkovaný niekoľkými rôznymi cestami a radu regulačných molekúl. Medzi týmito regulátory sú proteíny zahŕňajúce rodinu bcl-2 sú dôležité. Tam sú obaja anti-apoptotické proteíny (Bcl-2, Bcl-xl) a pre-apoptotické proteíny (Bax, zlý, Bak a Bcl-xs) v tejto rodine. Zvýšenie bcl-2 pomeru proapoptotický Bax /anti proapoptotický zvyšuje priepustnosť mitochondriálnej membrány, spôsobuje uvoľňovanie cytochrómu c z mitochondrií do cytosolu a zase vedie k aktivácii kaspázy-9 a následný zamerať kaspasy-3 [31]. Aj cez tento vnútorný apoptotické dráhy, pre-apoptotické ligandy, ako je napríklad FasL, väzbou na ich receptory, spôsobí aktiváciu kaspázy-8 a následnými efektory, ako kaspázy-3. Aktiváciu efektorových kaspázy indukuje štiepenie mnohých bunkových substrátov a priamo spôsobuje apoptózu [31] - [33]. Aj keď početné predchádzajúce správy ukázali, že apoptóza bola zodpovedná za Res-indukovanej inhibícia rastu, sme nespozorovali zrejmú apoptózu v Res-ošetrených GC buniek. Táto absencia apoptózy môže byť vzhľadom na koncentráciu a dobe trvania liečby Res upravený v experimente, pretože štúdie z rôznych skupín ukazujú, že Res pôsobí dávkovacie a trvanie závislé účinky [34], [35]. Okrem toho, ako účinky Res sú tiež bunky a špecifické [36] - [38], sa GC bunky použité v našej štúdii môžu byť rezistentné k Res-indukovanej apoptózy

Res má niekoľko cieľov .; medzi ktorými triede III NAD + - závislý Deacetylase SIRT1 je najčastejšie študovaný. Aj keď biochemické štúdia preukázala, že Res nie je priamym aktivátor SIRT1 [39], Res doteraz bola považovaná za klasický agonista SIRT1. Početné štúdie ukazujú, že Res vykazuje rôzne účinky v rôznych modeloch takým spôsobom, SIRT1 závislé [40], [41]. V našom experimente, SIRT1-vyčerpania zvrátiť inhibíciu rastu Res obaja in vitro stroje a in vivo
. G1 fázy zatknutie a Senescence vyvolaná pôsobením Res boli zachránení SIRT1-vyčerpania. Tieto výsledky ukazujú, že inhibičné účinky Res na GC závisí na SIRT1. V súlade s predchádzajúcimi štúdiami, môžu SIRT1 regulovať expresiu génu dvoma rôznymi mechanizmami. Po prvé, priamo, SIRT1 priamo sprostredkováva deacetyláciou proteínu a zvyšuje jeho ubikvitinace a následná degradácia ubikvitin proteazómu [42]. Po druhé, nepriamo, SIRT1 vykazuje aktivitu Deacetylase ovplyvňujúce potvrdenie chromatínu alebo potláčanie aktivity transkripčných faktorov a reguluje transkripciu génov [43] - [45]. Ako molekúl (cyklin D1, CDK4, CDK6, p21 a p16), zistených v našich experimentoch neboli hlásené ako priame ciele SIRT1, sme sa špekuluje, že SIRT1 môže regulovať expresiu týchto génov predovšetkým prostredníctvom nepriamo mechanizmu. Výsledky RT-qPCR tiež podporujú túto hypotézu.

vzaté, naše výsledky naznačujú, že Res inhibuje ako proliferáciu buniek GC in vitro stroje a rast xenografe in vivo
. Liečba res indukuje zástavu G1 fázy v GC buniek a vedie k starnutiu miesto apoptózy. SIRT1-vyčerpania zachráni zhora popísané účinky Res obaja in vitro stroje a in vivo
. Naša práca ukazuje, že Res inhibuje GC spôsobom SIRT1 závislým a poskytuje podrobné dôkazy o možnosti uplatnenia OZE v prevencii a terapii GC.

Podporné informácie
Obrázok S1.
Res vykazuje žiadny vplyv na apoptózy BGC-823 buniek. (A) Apoptóza bola uvedený na označenie TUNEL (červená) a BGC-823 bunky boli kontrastne zafarbený s DAPI (modrá). Liečba H 2O 2 slúžila ako pozitívna kontrola. Pôvodný zväčšenie: x 200. Scale bary, 50 um. (B) regulátory apoptózy v BGC-823 buniek, vrátane bcl-2, Bax a kaspázy-3 boli analyzované pomocou Western Blot. (C) regulátory apoptózy v xenoimplantátů vrátane bcl-2, Bax a kaspázy-3 boli analyzované pomocou Western Blot. Pre detekciu štiepené kaspázy-3, BGC-823 buniek ošetrených H 2O 2 slúžila ako pozitívna kontrola (znázornené na pravom paneli). (D) Apoptóza v xenografe bola detekovaná TUNEL značenie (červená) a rezy boli kontrastne zafarbený s DAPI (modrá). Rezy z samica hlodavcov mliečnej žľazy získané 3 ~ 5 po odstavení mláďatá potkanov (Millipore) slúžil ako pozitívna kontrola. Pôvodný zväčšenie: x 200. Scale bary, 50 um. 'R' predstavuje resveratrol, "Ci" predstavuje kontrolu siRNA, a "Si" predstavuje SIRT1 siRNA
doi :. 10,1371 /journal.pone.0070627.s001
(TIF)
Obrázok S2.
Vyradenie SIRT1 o zhrnieme lentivirus. (A) BGC-823 bunky boli transfekovány ovládanie alebo SIRT1-špecifických zhrnieme lentivirů. Účinnosť transfekcia bola hodnotená s fluorescenčným mikroskopom. Pri multiplicitě infekcie (MOI) 50, viac ako 90% buniek boli transfekovány zhrnieme lentivirus. Po štyroch týždňoch sa skríning puromycin, všetky živé bunky boli transdukovány. Zväčšenie: × 100, bar 200 um. (B) Bunky boli zozbierané 4 dni po infekcii a 28 dní po puromycin screening. Účinnosť umlčanie SIRT1 bola potvrdená westernovým prenosom
doi :. 10,1371 /journal.pone.0070627.s002
(TIF)
tabuľke S1.
Primery pre experimenty RT-qPCR vykonaných v tejto štúdii
doi: 10,1371. /journal.pone.0070627.s003
(DOC)

Other Languages