Ploche ONE: Mycoplasma hyorhinis Aktivuje NLRP3 inflamazóm a podporuje migrácie a invázie na žalúdočné rakovinu buniek

abstraktné

Pozadie

Mycoplasma hyorhinis
( M.hyorhinis, M.hy
) je spojené s rozvojom rakoviny žalúdka a prostaty. NLRP3 inflamazóm, je proteínový komplex riadenia zrenia dôležitých pre-zápalové cytokíny interleukín (IL) -1β a IL-18, sa tiež podieľa na vzniku nádorov a metastáz rôznych druhov rakoviny.

Metodické /hlavných zistení

na objasnenie, či M.hy
podporil vývoj nádoru cez inflamazóm aktivácia sme analyzovali monocytov pre IL-1 a IL-18 produkcie na M.hy
výzvu. Ak sú vystavené M.hy
ľudských monocytoch vykazoval rýchlu a robustný IL-1 a sekréciu IL-18. Ďalej sme zistili, že lipid spojený membránový proteín (LAMP) zo M.hy
bol zodpovedný za IL-1 indukcie. Uplatnenie kompetitívnych inhibítorov, gén špecifický zhrnieme a gén cielené myši, máme overené, že M.hy
indukovanej sekrécie IL-1β bola NLRP3 závislá na in vitro stroje a in vivo
, Katepsin B činnosť, K ^{+ výtok, Ca 2+ príliv a produkcia ROS boli všetci potrebné pre aktiváciu inflamazóm NLRP3 o M.hy
. Dôležité je, že je IL-1β, ale nie IL-18 vyrobené z makrofágov vystavených M.hy
podporoval žalúdočné migráciu a inváziu nádorových buniek.}

Závery

Naše dáta naznačujú, že aktivácia NLRP3 inflamazóm o M.hy
môže byť spojená s podporou žalúdočnej nádorových metastáz, a anti- M.hy
terapia alebo obmedzenie NLRP3 signalizácie môže byť efektívny prístup k riadeniu žalúdočné postupe rakoviny

Citácia :. Xu Y, Li H, Chen W, Yao X, Y Xing, Wang X, et al. (2013) Mycoplasma hyorhinis
Aktivuje NLRP3 inflamazóm a podporuje migráciu a inváziu žalúdočné rakovinové bunky. PLoS ONE 8 (11): e77955. doi: 10,1371 /journal.pone.0077955

Editor: Suresh Yenugu, University of Hyderabad, India

prijatá: 05.06.2013; Prijaté: 06.09.2013; Uverejnené: 06.11.2013

Copyright: © 2013 Xu et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený dotáciou zo 100 Talent programu čínskej akadémie vied, Natural Science Foundation Číny (91029707, 31170868), Shanghai Natural Science Foundation (11ZR1442600), Novo Nordisk-CAS Research Foundation, sA-SIB Štipendijný program, rovnako ako granty z Národného kľúčových programov na infekčné choroby (2012ZX10002007-003). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

Mycoplasma sú pleomorfní, nástenné, bez prokaryotické organizmy, ktoré sú umiestnené buď na eukaryotických bunkových membrán, alebo vo vnútri buniek, a sú najmenšie organizmy, ktoré sú schopné samostatnej replikácie [1]. K dnešnému dňu aspoň 16 mykoplazmy boli izolované z ľudí [2]. Mycoplasma hyorhinis
( M.hy
) bol považovaný za nepatogénny pre človeka, ako to zvyčajne infikuje ošípané čo vedie k ochoreniu dýchacích ciest a zápaly kĺbov hrudníka a [3], [4] , Avšak, hromadia dôkazy naznačujú, že M.hy
infekcie u ľudí nemá za následok klinické výsledky. M.hy
bola nájdená u 56% karcinómu žalúdka, 55% karcinómov hrubého čreva a 52,6% biopsiou pľúcneho karcinómu [5]. Navyše, 36% mužov s benígna hyperplázia prostaty (BPH) a 52% mužov s rakovinou prostaty sú M.hy
sero-pozitívne. Tieto klinické nálezy naznačujú možnú súvislosť medzi M.hy
expozície s žalúdočnými, hrubého čreva, pľúc a prostaty [5], [6].

Upon mikrobiálne infekcií, hostiteľ Rozpoznávanie receptory ( PRR), ako je napríklad TLR zmysel patogény a spúšťať syntézu prozápalových cytokínov, ako sú pre-IL-1 a pre-IL-18 cez aktiváciu NF-kB. V rovnakej dobe, iná skupina PRRS vrátane NLRP3 regrutovať adaptéra proteín ASC a viesť k aktivácii kaspázy-1, ktorá je aktívna proteázy, ktorý štiepi prekurzor forma cytokínov, vrátane pre-IL-1 a pre-IL-18 do zrelé, vylučované formy [7]. Patogény alebo náročné činidlá spôsobujú eflux draselný, poškodenie mitochondrií mitochondriálneho uvoľnenie DNA, produkcie ROS, intracelulárne zvýšenie vápnika alebo mobilnej pokles cyklického AMP v vrodených imunitných buniek, ktoré sú zapojené do kaspázy-1 aktiváciu [8], [9], [10 ], [11], [12], [13]. V priebehu tohto procesu sa NLRP3, ASC a pre-kaspázy-1 tvorí molekulárnej platforma s názvom inflamazóm. Tak ďaleko, rad inflamazóm bola identifikovaná, z nich, NLRP3 inflamazóm bolo zistené, vývojom nádoru [14], [15], aj keď existuje spor z rôznych modelov [16], [17]. Avšak, IL-1β bolo hlásené, aby podporovali rast nádorových buniek a metastáz indukciou niekoľkých pre-metastatické génov, ako sú matrix metaloproteinázy a endotelových adhéznych molekúl, ako aj TGF-p, chemokiny a rastových faktorov [18]. V kórejskej populácie, že kombinácia zvýšeného slizničnej úrovne IL-1 a homozygosity pre IL-1β -31T jednonukleotidové polymorfizmus (SNP) sú spojené so zvýšeným rizikom rakoviny žalúdka [18]. Okrem toho, Tú et al. zistené, že žalúdok špecifická expresie ľudského IL-1 v transgénnych myší viedla k spontánnej žalúdočnej zápalu a rakoviny [19], ďalej naznačuje, že IL-1β môže podporovať ľudský žalúdočné karcinogenéze. Na rozdiel od IL-18 zvyšuje aktivitu NK buniek, znižuje tumorigenezi, indukuje apoptózu a inhibuje angiogenézu v nádorových bunkách vyvíjať anti-nádorové účinky [20], [21]. Okrem toho sa zistilo, že nevhodné produkcia IL-18 prispieva k patogenéze rakoviny a môže mať vplyv na klinický výsledok u pacientov [22]. IL-18 bol zaznamenaný stimuluje matrix metaloproteinasy-9 produkciu, čo vedie k zvýšenej migrácii a invázii v vencovité tepny buniek hladkého svalstva a HL-60 leukemických buniek myeloidnej [23], [24]. Bolo tiež oznámené, že sérum IL-18 na úrovni v skupine pacientov s karcinómom žalúdka bola významne vyššia ako v skupine žalúdočného vredu pacientov [25] a IL-18 môže zvýšiť metastázy a imunitný úniku rakoviny žalúdka cez down-reguláciu CD70 a údržba CD44 v rakovina žalúdka u bunkové línie NCI-N87 a SNU16 [26]. To je tiež kritickým mediátorom VEGF zvyšuje migráciu v ľudských nádorových bunkových línií žalúdočné SNU-601 [27]. Uvedené zistenia naznačujú, že Mycoplasma hyorhinis
môžu podporovať migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka aktiváciou inflamazóm.

K dnešnému dňu, široké spektrum mikroorganizmov vrátane vírusov, baktérií, plesní a prvokov boli identifikovať aktivovať NLRP3 inflamazóm [28]. Nedávna štúdia ukázala, že Mycoplasma pneumoniae
bol tiež schopný vyvolať produkciu IL-1 v ľudských bunkách [29]. Avšak, či M.hy
, čo je dôležitým faktorom v rozvoji rakoviny žalúdka, ako je uvedené vyššie [5], [30], [31], aktivuje NLRP3 inflamazóm a či je táto aktivácia prispieva k rakovine žalúdka vývoj zatiaľ nie je známy. V tejto štúdii sme zistili, že M.hy
spúšťa sekréciu IL-1 v NLRP3 inflamazóm spôsobom závislým a výsledná indukovanej migrácie IL-1β a invázie buniek karcinómu žalúdka.

výsledky

M.hy
Triggers IL-1β a IL-18 Výroba v THP-1 bunky

Ak chcete zistiť, či M.hy
indukuje IL -1β výroba z vrodených imunitných buniek, sme sledovali zrelé IL-1 hladiny v ľudskej monocytární bunkovej línie THP-1 bunky infikované rôznymi množstvami M.hy
. V tomto experimente, silná indukcia IL-1 v spôsobom závislým od dávky bola pozorovaná (Obrázok 1A). Ďalej sme merali pre-IL-1β hladiny mRNA v bunkách a zrelých hladiny proteínu IL-1β v supernatantu kultúry v rôznych časových bodoch po M.hy
výzvu. Bolo zistené, že hladiny IL-1β mRNA dosiahla vrchol 3 hodiny po infekcii (obr 1B) a zrelého IL-1 (obrázok 1C), a na úrovni proteínu IL-18 (obrázok 1D) dosiahol vrchol v 12 hodín po infekcii. Okrem toho, THP-1, odvodené makrofágy tiež vykazoval silnú sekréciu IL-1, IL-18, rovnako ako iné zápalové cytokíny, ako je IL-6 a IL-8 (obrázok 1E, obr S1). Pre potvrdenie vyššie uvedených zistení v THP-1 bunkovej línie, sme skúmali produkciu IL-1 v primárnych ľudských monocytov od zdravých darcov vystavených M.hy
, kde IL-1β bola tiež silne indukovaná (obrázok 1F) , Tieto údaje naznačujú, že M.hy
vyvolalo silnú IL-1 a sekréciu IL-18 z ľudských myeloidných buniek.

LAMP odvodený od M.hy
je zodpovedný za IL -1β Indukčné cez TLR2

Ďalej sme skúmali, či bolo nutné replikáciu M.hy
pre IL-1 produkciu v monocytoch. Ako je ukázané na obrázku 2A, M
.hy
inaktivuje vykurovania alebo ultrafialovým (UV) ošetrenie indukovanej rovnako IL-1 sekrécia z THP-1 buniek, ako živé M .hy
. To ukazuje, že niektoré tepla a UV žiareniu odolná súčasť M.hy
bol zodpovedný za indukciu IL-1 sekrécie. Lipidov spojené membránový proteín (LAMP) je hojne exprimovaný na povrchu M.hy
[32], a predchádzajúce štúdia zistila, že membránové lipoproteíny z iných druhov mykoplazmy indukovanej IL-1β sekréciu [33]. preto sme sa špekulovalo, že M.hy
odvodené LAMP (MLAMP), môžu byť zodpovedné za indukciu IL-1 v bunkách THP-1. potom sa extrahuje LAMP z M.hy
(obrázok 2B) a testované na schopnosť indukovať MLAMP sekréciu IL-1β v bunkách THP-1. Zistili sme, že MLAMP jasne indukovanej sekrécie IL-1 v závislosti na dávke závislým, zatiaľ čo vodná fáza M.hy
extrakt nebola schopná urobiť (2c). Pre vylúčenie možného RNA a /alebo DNA kontaminácie v MLAMP, sme liečili na MLAPMs s RNázou a DNázy a zistil, že MLAMP bol hlavnou zložkou IL-1 pre indukciu (obr S2).

Bolo oznámené, že MLAMP najmä aktiváciu NF-kB prostredníctvom TLR2 a TLR6 [34], [35]. Preto sme najprv použili TLR2 neutralizačných protilátok T2.5 blokovať signál TLR2, s ConT2 slúži ako izotypovo kontroly [36]. Ako je znázornené na obrázku 2D, T2.5 kompletne blokuje sekréciu IL-1 stimulovanej TLR2 agonisty P3CSK4 ale nie ligand LPS TLR4. Dôležité je, že IL-1β sekrécia z M.hy
infikovaných buniek bola silne znížená T2.5, čo naznačuje, že TLR2 bola zapojená do MLAMP spúšťa sekréciu IL-1 v ľudských monocytoch. Je zaujímavé, že IL-1β sekrécia z M.hy
infikovaných buniek bola úplne blokovaná T2.5 (obrázok 2D), ktoré naznačujú, že TLR2 nezávislé signálne dráhy bol tiež zapojený do MLAMP spúšťa sekréciu IL-1, ktorá si zaslúži ďalšie skúmanie v budúcnosti.

M.hy
indukuje IL-1β sekrécia prostredníctvom aktivácie NLRP3 inflamazóm

Ak chcete otestovať, či M.hy
indukovanej sekrécie IL-1β cez inflamazóm aktivácie, sme sa prvýkrát využitý LPS náterom THP-1 odvodené makrofágy skontrolovať, či M.hy
možno aktivovať inflamazóm ako ATP alebo MsÚ, ktoré sú známe inflamazóm aktivátory. Ako je znázornené na obrázku 3A, M
.hy
bol schopný indukovať uvoľňovanie IL-1 v aktivovaných bunkách. Ďalej sme skúmali štiepenie kaspázy-1 a oligomerizace ASC, dva dôležité tvorcovia pre aktiváciu inflamazóm. Zistili sme, že M.hy
podporoval štiepenie kaspázy-1 a oligomerizace ASC (obrázok 3B), čo svedčí o priamej aktivácii inflamazóm pomocou M.hy.

Ďalej sme testovali, či M.hy
indukovanej sekrécie IL-1β bola závislá na určitých komponentov inflamazóm. Po prvé, sme zistili, že konkrétne kaspázy-1 inhibítor AC-YVAD-CHO znížila sekréciu IL-1 v bunkách THP-1 v spôsobom závislým od dávky (obrázok 3C). Ďalej, keď sa špecifické zhrnie použitý na umlčanie expresie kaspázy-1 a ASC (obrázok 3D), produkcia IL-1β sa silne znížil na M.hy
výzvou (obrázok 3E), čo ukazuje, že M.hy
indukovanej sekrécie IL-1β bola závislá na kaspázy-1 a ASC.

Potom sme testovali, či NLRP3 bol vyžadovaný pre M.hy
indukovanej sekrécie IL-1β. Po prvé, sme zistili, že inhibítor NLRP3 Glybenclamide potlačená M.hy
indukovanej sekrécie IL-1β v spôsobom závislým od dávky (obrázok 3F) [37]. Keď bol špecifický zhrnieme použitá na umlčanie expresie NLRP3 (obrázok 3G), produkcia IL-1β bola silne poklesla na M.hy
výzva (obrázok 3H), čo naznačuje, že M.hy
indukovanej sekrécie IL-1β bola závislá na NLRP3. To bolo ďalej potvrdené imuno-blottingom, v ktorých je produkcia kaspázy-1 aktiváciu a IL-1β boli oba NLRP3 závislú (obr 3I). Navyše sme zistili, že ďalej MLAMP bol hlavnou zložkou zodpovedný za aktiváciu NLRP3 inflamazóm o M.hy
(obr S2C). Okrem toho AIM2 inflamazóm bola hlásená byť aktivovaný DNA [38], a zistili sme, že M.hy
DNA indukovanej sekrécie IL-1β cez AIM2 inflamazóm (obr S3A). Je zaujímavé, že M.hy
indukovanej sekrécie IL-1β bola závislá hlavne na NLRP3, zatiaľ čo AIM2 bol len čiastočne zapojený (obr S3A). Dohromady tieto výsledky jasne preukázali, že M.hy
indukovanej sekrécie IL-1β cez aktiváciu inflamazóm NLRP3 v ľudských bunkách monocytární.

mechanizmy M.hy
spúšťa NLRP3 inflamazóm Aktivácia

Aktivácia NLRP3 inflamazóm rôznymi podnetmi, závisí na tom, kathepsin B aktivitu, k ^{+ vylučovanie vápnika, prílivu a /alebo produkciu reaktívnych foriem kyslíka (ROS) [11], [ ,,,0],12], [13], [39]. Ak chcete preskúmať mechanizmy základnej IL-1 uvoľňovania v reakcii na M.hy
výzva, sme sa prvýkrát aplikovaná kathepsin B-špecifický inhibítor CA-074 Me a zaznamenali značný útlm sekrécie IL-1 na M .hy
výzvu. Pri koncentrácii 100 uM, CA-074 Me úplne blokovaný IL-1β uvoľnenie (obr 4A). Táto inhibícia nebola v dôsledku akéhokoľvek toxického účinku na bunky, ako IL-8 sekrécie ovplyvnenej tohto inhibítora bol veľmi mierne (obrázok 4E). Dôležité je, keď boli bunky ošetrené kathepsinu K Inhibitor I, pokles sekrécie IL-1 nebolo zrejmé vôbec (obrázok 4B a 4F), čo naznačuje, že kathepsin B aktivita bola špecificky podieľa na aktiváciu NLRP3 inflamazóm v M .hy
výzvu. Okrem toho, keď sa zablokovanie K + efluxu zvýšením extracelulárnej K + koncentrácie, IL-1 sekréciu THP 1 buniek upon M.hy
výzva bola významne znížená v dávke spôsobom závislým od dávky (obrázok 4C). Opäť platí, že neexistuje žiadny toxický účinok od KCI ako produkcia IL-8 z tých istých buniek bolo normálne (obr 4G). Prísť na to, či je prívod vápnika pomohol inflamazóm aktiváciu, v médiu pre bunkové kultúry sme pridali rôzne dávky EGTA a zistilo sa, že liečba EGTA zablokované M.hy
indukovanej sekrécie IL-1 v spôsobom závislým od dávky, a žiadny toxický účinok od EGTA bol pozorovaný ako o tom svedčí produkcie IL-8 (obr 4D a 4H).}

Ďalej sme testovali, či M.hy
úlohou indukovaná ROS generácie v THP-1 buniek , Pre tento test, THP-1 bunky boli najskôr zavedie sa do nich redox-senzitívny fluorofor DCFDA a potom stimulované M.hy
, ATP bol zahrnutý ako pozitívna kontrola. Ako je znázornené na obrázku 5A, 16,9% CM-H2DCFDA pozitívne bunky boli detekované 30 minút po M.hy
ošetrenie v porovnaní s 1,6% v neošetrených buniek. Tieto údaje naznačujú, že ROS môže prispieť k aktivácii NLRP3 inflamazóm v reakcii na M.hy
výzvu. Na overenie tejto možnosti sme sa predbežne THP-1 buniek s inhibítorom ROS diphenyliodonium (DPI) po dobu 30 minút a potom vyzval buniek M.hy
pred meraním IL-1 produkcie 6 hodín neskôr. Ako sa dalo očakávať, DPI výrazne znížiť M.hy
indukovanej IL-1β uvoľňovania (obrázok 5B). Nedávna štúdia ukázala, že ROS inhibítor, ako je DPI zrušený uvoľňovanie IL-1 v myších makrofágoch inhibíciou NLRP3 génovej expresie [40]. Preto sme tiež sledovali hladinu mRNA pre-IL-1 a NLRP3 pri liečbe DPI. Zistili sme, že DPI výrazne znižuje expresiu pre-IL-1 a NLRP3 (obrázok 5C-D), ktorý bol v súlade so zistením, z myších buniek [40]. Okrem toho sme tiež skúmali aktiváciu kaspázy-1 a bolo zistené, že nízke dávky (1 alebo 10 uM) liečby DPI nemá vplyv na aktiváciu kaspázy-1 pri 100 uM DPI inhibuje kaspázy-1 aktiváciu (obr 5E). To ukazuje, že v ľudských bunkách DPI rušená aktiváciou NLRP3 inflamazóm inhibíciou NLRP3 transkripcie, rovnako ako kaspázy-1 aktivity, keď bola aplikovaná vysoká dávka. Kolektívne, tieto údaje naznačujú, že kathepsin B činnosť, K ^{+ efluxu, Ca 2+ príliv a ROS to všetko prispelo k aktivácii NLRP3 inflamazóm v reakcii na M.hy
výzvu.}

M.hy
Aktivuje NLRP3 inflamazóm in vivo

Keď boli myší kostnej drene odvodené dendritické bunky (BMDCs) infikovalo M.hy
, s predĺženým IL-1β indukcie bola pozorovaná (Obrázok 6A). Ďalšie pokusy o BMDCs izolované z divokého typu (WT) myší alebo myší s deficitom pre kaspázy-1, ASC alebo NLRP3 s M.hy
úlohou bolo potvrdené, že M.hy
indukcie IL 1β bolo NLRP3 inflamazóm závislú (obrázok 6B). Okrem toho, systémová inokulácie M.hy
WT myší indukovanej produkcie IL-1β v sére a peritoneálnej laváži (PLF), ale nie u myší, ktorým chýba ASC alebo NLRP3 (obrázok 6C-D). Je zaujímavé, že bazálna hladina IL-1 v ASC deficitom myší bola jasne vyššia ako u WT alebo NLRP3 myší s deficitom, ale výzva s M.hy
ďalej nezvyšuje sekréciu IL-1 v týchto myší (obrázok 6C-D). Kolektívne, tieto nálezy potvrdili, že M.hy
aktivovať aj NLRP3 inflamazóm v myšiam in vitro stroje a in vivo
.

M. hy
vyvolaná IL-1β podporuje žalúdočné nádorové bunkové migrácie a invázie

vyššie uvedené dáta jasne ukazujú, že M.hy
bol schopný vyvolať produkciu IL-1 z vrodených imunitných buniek cez NLRP3 inflamazóm aktivácie. Skoršie štúdie ukázali epidémie možnú úlohu mykoplazmy v rozvoji rakoviny žalúdka [5]. A Mycoplasma hyorhinis
bolo preukázané, aby podporovali migráciu nádorových buniek, invázia a metastáz in vitro stroje a in vivo
[41]. Predpokladali sme, že môžu existovať iný mechanizmus pre túto akciu, ktorá je, že M.hy
môžu podporovať žalúdočné karcinogenéze a /alebo metastáz tým, že podporuje produkciu IL-1. A my sme potvrdili, že M.hy
podporoval žalúdočné migrácie a invázie (obr S5) rakovinových buniek. Vzhľadom k tomu, M.hy
bola preukázaná pre infikovanie buniek karcinómu žalúdka ([41], obr S4), je teda možné, že M.hy
môžu indukovať aktiváciu inflamazóm v rakovinových bunkách priamo. Avšak, žiadna aktivácia inflamazóm bola zistená u buniek karcinómu žalúdka (obr S6).

Ďalej určuje účinok ľudského rekombinantného IL-1 (RIL-1β) na žalúdočné rakovina karcinogenéze v teste tvorby kolónií, ktoré bolo zistené, že RIL-1β nemali vplyv na proliferáciu karcinómu žalúdka bunkové línie MGC-803 (Obr S7). Vzhľadom k tomu, IL-1β bola hlásená na podporu metastázy iných nádorov [18], sme skontrolovali účinky RIL-1β o migrácii a invázii MGC-803 buniek. Naše výsledky ukazujú, že migrácia a invázia MGC-803 bol obohatený o RIL-1β ošetrenie (obrázok 7A a 7C), zatiaľ čo liečba RIL-18 nepreukázali žiadny účinok (Obrázok 7B a 7D). Ďalej sme sa správali tieto žalúdočné rakovinové bunky s supernatantov M.hy
napádal THP-1 odvodených makrofágov alebo makrofágov s umlčanie NLRP3, ASC a kaspázy-1 pre migráciu a inváziu testu. Naše výsledky ukázali, že supernatanty kultúry z M.hy
napadnuté zakódované makrofágoch silne zvýšenú migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka, zatiaľ čo supernatanty kultúry z NLRP3, ASC alebo kaspázy-1 porazený makrofágov nie, pravdepodobne z dôvodu, že sa znižuje sekréciu IL-1 (obrázok 8A a 8C). Táto zvýšená migrácia a invázia MGC-803 buniek bol zrušený spracovaním buniek s anti-IL-1 mAb (Obrázok 8B a 8D). Celkovo vzaté, naše výsledky ukázali, že M.hy
vyvolanú migráciu a inváziu žalúdočné rakovina bunkové línie MGC-803 tým, že podporuje sekréciu IL-1 z monocytární bunky. Navyše naše dáta ukazujú, že M.hy
indukovanú aktiváciu inflamazóm môže podporovať M.hy
replikácie (obr S8), ktorý môže vytvoriť pozitívnu spätnú väzbu, a nakoniec vedie k chronicity ochorení.

Diskusia

mykoplazmy odlíšiť od iných baktérií malými rozmermi, minútu genómu a nedostatok bunkovej steny. Mnoho mykoplazmy nadviazať kolonizáciu a infekciu cez dodržiavanie hostiteľskými tkanivami. Vzhľadom k tomu, ich dynamické povrch architektúra je antigénne a funkčne všestranná, mykoplazmy sú schopné sa vyhnúť hostiteľa imunitný útok a prispôsobenie sa mnoho stanovíšť a spôsobujú chronické ochorenia [32]. Vzhľadom k tomu, identifikáciu M.hy
z ošípaných v roku 1962, malý šetrenie bolo vykonané na tomto patogénu, až sa zistilo, že sú spojené s niekoľkými ľudských nádorov [5], [41], [42], [ ,,,0],43]. V poslednej dobe, vedci zistili, že M.hy
proteín P37 bol zodpovedný za podporu rakovinových buniek invazívnosti a metastáz [30], [44]. Okrem tejto priamej mechanizmu, tento mikrób môže tiež indukovať tumorigenezi alebo metastáz nepriamo prostredníctvom miestneho chronického zápalového procesu. Je dobre známe, že IL-1β je dôležitý prozápalový cytokín, ktorý podporuje rast rakovinových buniek hrubého čreva a zvyšuje invazívnosti a metastázovaniu B16 melanómu buniek [19], [45]. Bolo zistené, že nadmerná expresia IL-1 pre indukciu žalúdočné zápalu a rakoviny u myší [19]. V tejto štúdii sme skúmali, či NLRP3 inflamazóm, ktorá ovláda IL-1 zrenie, bol aktivovaný M.hy
, a či je táto aktivácia môže prispieť k M.hy
spojené žalúdočné metastáz , Naše výsledky ukázali, že M.hy
aktivoval NLRP3 inflamazóm in vitro stroje a in vivo stroje a podpora žalúdočné migrácie a invázie nádorových buniek pomocou M .hy
bol závislý na aktiváciu NLRP3 inflamazóm. Okrem NLRP3 sme zistili, že M.hy
DNA tiež aktivovali AIM2 inflamazóm, ale MLAMP aktivácia NLRP3 bola dominantnou zložkou IL-1 indukcie M.hy.

nedávno bolo oznámené, že acylovaný lipopeptid z tepelne usmrtených mykoplazem Acholeplasma laidlawii
(HKAL) indukovanej IL-1β produkciu prostredníctvom NLRP7 inflamazóm v ľudských bunkách, zatiaľ čo celková HKAL indukovanej sekrécie IL-1β bola čiastočne závislá NLRP3 [46], čo znamená, že viac inflamazóm možné aktivovať určitú mykoplazmy. Naše dáta nevylúčil možnú účasť NLRP7 vo M.hy
indukovanej produkcie IL-1β, ale M.hy
hlavne aktivoval NLRP3 inflamazóm, pretože sekrécia IL-1β bola takmer úplne zrušený v NLRP3 umlčané bunkách (obr 3h a 3i).

Skoršie štúdie navrhuje, aby ROS aktivovali NLRP3 inflamazóm aktiváciou kaspázy-1 [47]. Avšak, nedávny Vyšetrovanie ukázalo, že inhibítory ROS zasahovali do transkripcie IL-1 a NLRP3, ale nie je ovplyvnená aktivácia kaspázy-1 v myších buniek [40]. V našej štúdii, aj keď ROS inhibícia s nízkou dávkou DPI (10 pM) významne znižuje produkciu IL-1 upon M.hy
úloha, to neinhiboval kaspázy-1 štiepenie, je marker inflamazóm aktivácie. Avšak, keď bol aplikovaný vysoká dávka DPI (100 uM), kaspázy-1 štiepenie bolo jasne inhibovaná (obr 5E), čo naznačuje, že vysoká dávka DPI môže potlačiť montáž inflamazóm komplexu, aj keď nemožno vylúčiť možnosť, že tento efekt môže boli vyplynuli z NLRP3 mRNA ruší od východiskového stavu (obrázok 5D). Je pravdepodobné, že inhibítor ROS môže ovplyvňovať ako pre-IL-1 syntézu a aktiváciu kaspázy-1.

Ako M.hy
podporuje produkciu ROS v makrofágu zostáva nejasná. Nedostatok bunkovej steny z M.hy
umožňuje priamy kontakt s Mycoplasma membrány a membránu hostiteľskej bunky, a tento kontakt môže viesť k fúzii mykoplaziem s eukaryotické hostiteľskej bunky. Toto spojenie môže viesť nielen k mykoplaziem komponenty dodávajú do hostiteľskej bunky, ale tiež umožňujú vloženie zložiek Mycoplasma membrány do membrány v eukaryotických hostiteľskej bunke. V poslednej dobe, boli nájdené M.hy
membrány, že má fosfolipáza A (PLA), ktoré môžu byť zapojené do procesu rozrušenie plazmatické membrány, ktorá sa vyskytuje na inváziu hostiteľských buniek [48], [49]. Počas tohto procesu, sa hostiteľskej bunky môžu produkovať ROS. Bolo by to stojí za to vyšetruje, či PLA je požadované pre M.hy
indukovanú produkciu ROS a IL-1 sekrécie.

Ako vyplýva z našich dát, lysozomálnej prasknutie, K ^{+ výtok, Ca 2+ príliv a ROS boli všetci zapojení do M.hy
indukovanú aktiváciu NLRP3. Ako bolo uvedené skôr, K + efluxu a prasknutie fagolysosomu môže vyvolať Ca 2+ príliv, zatiaľ čo Ca 2 + influx môže spôsobiť dysfunkciu mitochondrií, čo má za následok uvoľnenie oxiduje mitochondriálnej DNA (mtDNA) do cytosolu, kde sa viažu na a aktivujú NLRP3 inflamazóm [9], [12]. Mitochondrie sa zdá pôsobiť ako centrálny uzol pre integráciu rôznych signálov snímaných podľa NLRP3, ale relatívny podiel ROS a mtDNA pre aktiváciu NLRP3 inflamazóm stále nie je jasné, k dnešnému dňu [9].}

Aj M .hy
nie je vysoko virulentný, môže vytvoriť chronickú infekciu. Postupným a progresívne interakciu s hostiteľskými bunkami, indukuje chromozomálne nestability a malígne transformácie, a tak podporovať rast nádoru, migráciu alebo inváziu [50], [51]. M.hy
P37 proteín podporovaná buniek karcinómu žalúdka, karcinómu prostaty a melanómu bunkové línie invazívnosti [30], [31]. Okrem toho je pre-zápalové mikro-prostredí, ako je produkcia IL-1 môže tiež prispieť k tomuto procesu [19]. Naša štúdia zistila, že M.hy
vyvolanú IL-1β podporoval migráciu a inváziu rakovinových buniek žalúdka, zatiaľ čo M.hy
indukovanej IL-18 neprispeli k migrácii a invázii rakovinové bunky žalúdka, ktorý bol odlišný od iných správ [26], [27]. Možným vysvetlením je, že IL-18 môže byť povýšený žalúdočné rakovinové bunky migráciu a inváziu cez reguláciu CD70, CD44 a expresia VEGF v bunkách imunitného systému, ktorá si zaslúži našu ďalšie vyšetrovanie [26]. Ďalším vysvetlením by mohlo byť to, že dávka ril-18 sa používa (150 ng /ml), je oveľa vyššia, než to, čo sme použili [27]. Okrem toho IL-1β podporoval migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka môže byť sprostredkované matričnej metaloproteinázy-9 (MMP9) ďalšie hľadači označená [52]. Aby však bolo možné získať priamy a pevnejšie dôkazy a im zodpovedajúce mechanizmy o spojenie medzi aktiváciou NLRP3 inflamazóm vyvolané M.hy stroje a rakovina žalúdka metastáz, vhodných zvieracích modeloch, ako je napríklad in vivo
nádorové invázie test [53] a pacientov štúdie sú potrebné pre ďalšie štúdium v ​​budúcnosti.

materiály a metódy

Cell Culture

THP-1 bunky, PMA-indukovanej makrofágy a žalúdka karcinóm MGC-803 boli udržiavané v médiu RPMI 1640 so základnými doplnkami. Ľudské monocyty boli izolované Percol TM gradientom hustoty odstreďovaní (GE Healthcare Bio-Sciences, Švédsko) z ľudských mononukleárnych buniek periférnej krvi (PBMC) získané z Shanghai Blood Center (Shanghai, Čína).

M.hy
Strain a PCR detekcia

M.hy
kmeň použitý v našej štúdii boli získané z kontaminovanej bunkovej kultúry. Detekcia mycoplasm sa vykonáva prostredníctvom dvoch kôl PCR s bunkového kultivačného média [54]: Po prvé, beh PCR so štyrmi priméry 5'-ACACCATGGGAGYTGGTAAT-3 ', 5'-CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT-3', 5'-AAAGTGGGCAATACCCAC GC-3 ', 5'-TCACGCTTAGATGCTTTCAGCG-3 "s mobilným kultivačného média ako šablónu. Po druhé, sa 1 ul vyššie uvedeného PCR produktu ako templátu a beh PCR s tromi priméry 5'-GTGSGGMTGGATCACCTCCT-3 ', 5'-GCATCCACCAWAWACY CTTT-3', 5'-CCACTGTGTGCCCTTTGTTCCT-3 '. Prvá a druhá PCR prebieha za rovnakých podmienok cyklu. Potom sme sekvenované PCR produktu a získať nasledujúce sekvencie: ACTCTTACTTAATTTAAAAGTTAATACAACTTTAATATT GCCTATTATTGCTAAAGATAAATATCTTAAGGTATTTTAATATTGGTAATCTATTTTAGAAATTTAATTTAAAAATTAAACTCGGTTATAAAAAAGATCGTTGAAATAATAAATATGAAGTTAATCATATTGTTATTTGCTATTCAGTTTTCAAAGAACTATAATTGAGAACTTAAAGCTCTCAAAACTAGACACGAATCGATTATGTAATAAGTCAATTAAGACTAACGGAAAGCGGAAAAAGAAGGTGATCCGTCCCCACG. BLAST v databáze NCBI, sme získali informáciu, že Mycoplasma je M.hy
. To môže byť SK76, GDL-1 alebo MCLD kmeň.

M.hy
Kultúra, DNA Extrakcia a MLAMP Príprava

M.hy
WAS pestuje v modifikovanej SP-4 médium obsahujúce 20% novorodencov hovädzie sérum, 10% extraktu z kvasníc, 1% glukózu, 0,00024% phenolsulfonphthalein a 1000 IU /ml penicilínu. extrakcie DNA zo M.hy
bola vykonaná v súlade s pokynmi s činidlami poskytovaných Shanghai Lifefeng Biotechnology Co., Ltd. M.hy
bola kvantifikovaná ako zmena farby jednotky (CCU) na mililiter, ako je popísané [55]. Extrakcia MLAMP bolo vykonané, ako bolo opísané skôr [34].

Real-time PCR

NLRP3 a IL-1β mRNA expresia bola stanovená kvantitatívne real-time PCR. Relatívna kvantifikácia génov boli normalizované proti endogénnej kontrola beta-aktínu pomocou vzorca [2 ^{-ΔCt (cieľový gén-β-aktínu)]. Použité primery boli: Homo sapiens (hs) IL-1β, 5'-CACGATGCACCTGTACGATCA- (dopredu) 3 ', 5'-GTTGCTCCATATCC TGTCCCT- (reverznej) 3'; beta-aktínu, 5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG- (dopredu) 3 ', 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC- (reverznej) 3'; NLRP3, 5'-AAGGGCCATGGACTATTTCC- (dopredu) 3 ', 5'-GACTCCACCCGATGACAGTT- (reverzný), 3'. M.hy
DNA kópie boli dertermined kvantitatívne real-time PCR s metodikou štandardná krivka pre absolútnom počte kópií. Špecifické priméry na M.hy
boli :. 5'-CGATTCGTGTCTAGTTTTGAG - (vpred) 3 ', 5'-ATTGCCTATTATTGCTAAAG - (reverzné) 3'}

ELISA

supernatanty z bunkových kultúr, myšieho séra a myšou peritoneálnej výplach tekutiny boli analyzované cytokíny IL-1, IL-18, IL-6 alebo sekréciu IL-8 pomocou ELISA (BD Biosciences) podľa inštrukcií výrobcu.

generácia THP-1 bunky exprimujúce shRNAs cielenie génov

zhrnieme vektorov proti ľudskému NLRP3, kaspázy-1 a ASC, a ich vyškriabať vektorov sú dary od Dr. Jürg Tschopp [56]. O generáciu buniek THP-1 exprimujúce shRNAs, stručne, nt GATGCGGAAGCTCTTCAGTTTCA ľudskej sekvencie kódujúce ASC, nt CAGGTTTGACTATCTGTTCT ľudského NLRP3 kódujúce sekvencie, nt GTGAAGAGATCCTTCTGTA v 3 'UTR ľudského kaspázy-1 boli vložené do pSUPER. Pol III promótor zhrnie kazety z týchto vektorov a z lamin A /C-špecifický kontrolný pSUPER konštrukt boli vložené do lentivirovým vektorom pAB286.1, derivát dsk, ktorý obsahuje SV40-puromycin acetyl transferázu kazetu pre antibiotickú selekciu.

• Ploche ONE: Negatívny Node Count Zlepšenie prognosticky Predikcia siedme vydanie TNM klasifikácie pre žalúdočné Cancer
• Ploche ONE: Natural History of malígneho do kostí v rakoviny žalúdka: Konečné výsledky multicentrickej Kostná metastázy Survey