Ploche ONE: Neinvazívne Vizualizácia mikroRNA-16 v chemorezistence na žalúdočné rakovinu použitie duálneho referenčného génu Imaging System

abstraktné

mikroRNA (miRNA) boli zapletené hrať kľúčovú úlohu v rozvoji liekovej rezistencie v rôznych malignít. Avšak, mnoho štúdie boli vykonané na vitro
úrovni a nemohol poskytnúť in vivo
Informácie o funkciách miRNA v odpore protinádorového liečiva. Tu sme zaviedli duálny reportér génu zobrazovací systém pre sledovanie neinvazívne kinetickú expresiu miRNA-16 počas chemorezistence u karcinómu žalúdka obaja in vitro stroje a in vivo
. Ľudský jodid sodný symporter (hnis) a luciferázy svetlušiek (Fluco) gény boli spojené za vzniku hnisu /Fluco dvojaký fúznej gén reportéri a potom generovať rakovina žalúdka u ľudí bunkové línie NF-3xmir16 a jeho odolnosť voči liekom bunkové línie NF-3xmir16 /VCR. Radioiodide príjem a Fluco luminiscencie signály in vitro
dobre korelovala s počtom životaschopných buniek. Luciferázové aktivity a radioiodide vychytávanie v NF-3xmir16 bunky boli pozoruhodne potlačený exogénne alebo endogénne miRNA-16. NF-3xmir16 /VCR bunky vykazovali výrazný nárast ^{131 I vychytávania a luminiscenčné intenzity v porovnaní s NF-3xmir16 buniek. Rádioaktivita zo in vivo
99m-technecistanu zobrazovanie a intenzita od Bioluminiscencia zobrazovania Rovnako boli zvýšené v NF-3xmir16 /VCR v porovnaní s údajmi v NF-3xmir16 štepov tumorov z cudzej. Okrem toho, použitie tohto génu systému spravodajca, sme zistili, že etopozid (VP-16) a 5-fluorouracil (5-FU) aktivovanej miRNA-16 expresie in vitro stroje a in vivo
, a upregulace miRNA-16 je závislá na p38MAPK, ale NF-kB nezávisle. Tento dvojaký zobrazovacie reportéri gén môže byť podávaná ako nový nástroj na in vivo zobrazovanie
mikroRNA v chemorezistence rakoviny, ako aj pre včasnú detekciu a diagnózu v klinike}

Citácia :. Wang F, Song X, Li X, Xin J, Wang S, W Yang, et al. (2013) Neinvazívne Vizualizácia mikroRNA-16 v chemorezistence na žalúdočné rakovinu Použitie Dual reportéri gén zobrazovacieho systému. PLoS ONE 8 (4): e61792. doi: 10,1371 /journal.pone.0061792

Editor: Javier S. Castresana, University of Navarra, Španielsko |

prijatá: 21. novembra 2012; Prijaté: 13.března 2013; Uverejnené: 17.apríla 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený programom Národného základný program výskumu a vývoja Číny (973) pod Grant No. 2012CB518101, 2011CB707702, Národná prírodná Science Foundation Číny pod Grant č. 81090272, 81090274, 81227901, inovácii vývojový tím Grant by Čína Department školstve (2010CXTD01), 863 Program Číny (2012AA02A603) a kľúčové technológie podporného programu Národného pod Grant No. 2012BAI23B06. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konflikt záujmov :. Spoluautor Xiaoyuan Chen slúži ako redaktor tohto časopisu. To však nič nemení priľnavosť jednotlivých autorov do všetkých politík ploche jeden na zdieľanie dát a materiálov.

Úvod

Karcinóm žalúdka zostáva prvou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu v Číne a štvrtou najčastejšou zhubný nádor na celom svete cez dramatický pokles jeho morbidity a mortality v priebehu posledných troch desaťročí [1]. Chemoterapia sa široko používa na liečbu ako operovateľným a pokročilého karcinómu žalúdka, čo vedie k zlepšeniu celkového prežitia, ako aj kvalitu života pacientov [2], [3]. Avšak, dlhodobé chemoterapia často nedokáže odstrániť všetky nádorové bunky, pretože vlastné alebo získanú mnohopočetné liekové rezistencie (MDR), ktorá je najviac primárnou príčinou recidívy [4]. V súčasnej dobe je MDR bola považovaná za mnohofaktorovú jav zahŕňajúce niekoľko hlavných mechanizmov, vrátane zvýšeného metabolizmu liekov, znížený príjem vo vode rozpustných liečiv, zmenené liekovej ciele, znižuje intracelulárna koncentrácia liečiva podľa efluxnej pumpa, zmenené kontrolné body bunkového cyklu a indukované núdze gény odozvy na zhoršiť apoptotické dráhy, atď
[5]. Aj keď mechanizmy MDR boli podrobne preskúmané, kľúčové faktory tohto javu zostávajú do značnej miery nejasný.

mikroRNA (miRNA) sú triedou román endogénnych malých nekódovacích RNA (19-23 nukleotidov), ktoré negatívne regulujú génovej expresie u post-transkripčné úrovni dokonalým alebo nedokonalým párovaním báz s 3 'netranslatované oblasti (UTR) cieľových mRNA, a tým vyvolať mRNA degradácia alebo preklad represie [6]. V súčasnej dobe, vznikajúce štúdie naznačujú existenciu a význam miRNA vo vývoji rezistencie protinádorového liečiva a miRNA expresie profilovanie môže byť v korelácii s vývojom liekovej rezistencie [7] - [10], čo znamená, že miRNA-sprostredkované forma rezistencie pridáva ďalšie mechanizmus MDR. V našej predchádzajúcej štúdii, bolo oznámené, že dve miRNA, miRNA-15b a miRNA-16, boli odlišne exprimované v multirezistentnej rakovina žalúdka u bunkové línie SGC7901 /VCR a jej rodičovská bunková línia SGC7901 [11]. Avšak, to bolo vykonané len na vitro
úrovni a nemohol odrážať in vivo
informácie o funkciách miRNA v odpore protinádorového liečiva.

Nedávne pokroky v technik molekulárnej zobrazovania umožňuje neinvazívne vizualizáciu normálnych a abnormálnych bunkových procesov v živých jedincov na molekulárnej úrovni, skôr než na anatomickú úrovni [12]. Niekoľko neinvazívna stratégia, ako napríklad za použitia fluorescenčné proteín, luciferázy reportér génu, nucleolin aptamer alebo fluorescenčné molekulárnej maják konjugované nanočastíc, boli vyvinuté pre sledovanie expresie vzory rôznych miRNA v priebehu karcinogenézy, neurogeneze alebo myogenesis in vitro a
in vivo
[13] - [16]. Táto štúdia bolo zaviesť neinvazívnu metódu pre monitorovanie miRNA-16 v chemorezistence karcinómu žalúdka prostredníctvom systému reportérového génu s dvoma zobrazovacie v ktorej jodid ľudský sodného symporter (hnis) a luciferázy svetlušiek (Fluco) gény boli spojené s génom fúzneho pre Bioluminiscencia zobrazovanie a ^{99m-technecistanu zobrazovacie gama kamera in vivo
.}

materiáloch a metódach

Zvieratá

špecificky prostého patogénov 8-týždňovej -old Balb /c nahých myší boli získané zo zvierat Shanghai Center v Číne a chovajú vo štvrtom Military Medical University zvieracieho centra, Čína. Všetky experimentálne zvieratá umiestnené za špecifických podmienok bez patogénov. Zviera protokoly použité v tejto štúdii boli schválené štvrtej Military Medical University Ethics Review Board. Všetky postupy boli vykonávané v súlade so štvrtou Military Medical University Guide pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat formulovaných Národná spoločnosť pre lekársky výskum.

Činidlá a protilátky

Myši monoklonálna protilátka proti hnisom (ab17795) bol zakúpený od abca. Králičie polyklonálne protilátka špecifická pre Bcl-2 bola získaná od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Bay11-7082 (NF-kB inhibítor) a SB203580 (inhibítor p38 MAPK) boli získané od Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, Čína). Protinádorové lieky, vrátane vinkristínu (VCR), etopozid (VP-16), mitomycín C (MMC), cisplatina (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU) a adriamycín (ADR) boli zakúpené od Wolsen Biotechnology (Xi'an, Čína). GV260-Fluco-Puro lentivirus plazmid bol získaný od Shanghai génoch Company (Shanghai, Čína). Všetky bunkové kultivačné média a séra bola zakúpená od firmy Gibco (Grand Island, NY).

Dual reportérového génu plazmid konštrukt

kódujúce sekvencie hnis génu bola amplifikovaná pomocou PCR z plazmidu láskavo poskytnutých Dr. Weidong Yang (Fourth Military Medical University, Čína), s použitím nasledujúcich primerov:

hnis-Fw: 5'-CGGGATCCCGCCACCATGGAGGCCGTGGAGACC-3 '

hnis-Zj: 5'-CGGGTACCGGTACGAGGTTTGTCTCCTGCTGGTC-3 '

Pre stavbu dvojaký expresného vektora sa cDNA z hnis gén bol vložený do BamH i a
vek
restrikčné enzýmová miesta aj lentivirovým vektorom GV260 -Fluc-puro (Shanghai génoch, Čína), ktorá kóduje gén Fluco pod kontrolou promótorom ubiquitin. Výsledný duálny expresné konštrukt GV260-hnis /Fluco bol ďalej použitý na výrobu GV260-hnis /Fluco-3xmir16 plazmid. Tri kópie komplementárne sekvencie proti miRNA-16 (3xmir16) bol po stop kodóne fúzneho génu hnis /Fluco vytvárať GV260-hnis /Fluco-3xmir16 (obrázok 1A) vložený. Kódovanú nukleotidovej sekvencie podobnú dĺžku, aby 3xmir16 bol tiež vložený na 3 'UTR génu hnis /Fluco fúzneho k získaniu kontrolného konštrukt (GV260-hnis /Fluco-scramble. Boli získané 3xmir16 sekvencie alebo sekvencie ťahanice žíhaním nasledujúcich oligonukleotidov :

3xmir16-FW: 5'-CGCCAATATTTACGTGCTGCTACGCCAATATTTACGTGCTG-CTACGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3 '

3xmir16-Rev: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCGTAGCAGCACGTAAATAT-TGGCGTAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3'

vyškriabať-FW: 5 '- TCGTGGCGTCATTTCTTCAGAATCCGTCCTCCCAAGTACT-CAGTGTGCTAATGTCTATCGATACAA-3'

vyškriabať-Rev: 5'-TTGTATCGATAGACATTAGCACACTGAGTACTTGGGAGG-ACGGATTCTGAAGAAATGACGCCACGA

karcinóm žalúdka bunkové kultúry a stabilné generácie bunkové línie

rakovina žalúdka u ľudí bunkové línie SGC7901 a jeho multirezistentnej variant SGC7901 /VCR (vytvoriť a udržiavať v našom laboratóriu, ako bolo opísané skôr [11]) boli kultivované v médiu RPMI-1640 doplnenom 10% fetálneho teľacieho séra a 100 jednotiek penicilínu a 100 ug /ml streptomycínu (Invitrogen ). Zachovať MDR fenotyp, vinkristín (s konečnou koncentráciou 1 ug /ml) bol pridaný do kultivačného média pre SGC7901 /VCR buniek. Ak chcete generovať stabilné bunkové línie, lentivirus vektor GV260-hnis /Fluco alebo GV260-hnis /Fluco-3xmir16 bol prvý kotransfikovány do buniek 293T s obalov plazmidov ( gag, pol VSV-G
). Rastové médium bolo menené v 6 h po transfekciu a supernatant lentivirus obsahujúce vypestovanej na 48 hodín po transfekciu. Pozberané supernatanty boli odstredené pri 4000 g počas 10 min k usadeniu bunkovej drti. Koncentrovaný vírus bol titrovaný na 293T bunkách. SGC7901 bunky a SGC7901 /VCR bunky boli transdukovány GV260-hnisu /Fluco a GV260-hnis /Fluco-3xmir16 vírusu, respektíve pri multiplicitě infekcie (MOI) 10. Potom boli bunky testované na puromycin počas 3 týždňov a bunkové kolónie boli zhromažďujú sa rozšíril na ďalší krok experimenty

RNA oligo a transfekcia

miRNA-16 a negatívne kontrolou (NC) RNA oligonukleotidy boli syntetizované (Shanghai GenePharma, Čína), za použitia nasledujúcej sekvencie .:

miRNA-16 sense: 5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3 '

miRNA-16 anti-sense: 5'-CGCCAAUAUUUACGU-GCUGCUA-3'

NC zmysel: 5 "-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3 '

NC anti-sense: 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3'

Pred transfekcia SGCC7901 bunky boli nasadené na 1 x 10 ^{5 buniek na jamku v 24-jamkové doštičky a rast po dobu 24 hodín. Transfekcia bola vykonaná pomocou činidla Lipofectamine 2000 (Invitrogen) podľa protokolu výrobcu. Všetky transfekcia boli vykonané v troch opakovaniach.}

Kvantitatívne PCR v reálnom čase (QRT-PCR) analýzy

Celková RNA bola izolovaná z kultivovaných buniek za použitia TRIzolu (Invitrogen). RT bola vykonaná s PrimerScript RT Regent Kit (Takara, Japonsko) a qPCR bola vykonaná s Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) a ABI StepOne Plus Real-time PCR systém (Applied Biosystems) podľa návodu výrobcu , PCR produkty boli analyzované na 3% agarózových géloch. Relatívne množstvo miRNA-16 je normalizované na U6 snRNA. A relatívne množstvo Fluco je normalizované na GAPDH génu. Násobok-change pre miRNA-16 alebo Fluco génu z experiment skupiny v porovnaní s kontrolnou skupinou viedlo použitie ^{-ΔΔCt metóda, na 2, kde ΔΔCt = ΔCt experiment - kontrola ΔCt a ΔCt = Ct miRNA - Ct U6 alebo ΔCt = Ct Fluco - Ct GAPDH. PCR bola vykonávaná v triplikátech. Primery použité pre kmeňové slučky RT-PCR pre mier-16 sú uvedené v nasledujúcom:}

U6 FW: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 '

U6 Rev: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3 "

MIR-16 RT 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGG-ATACGACCGCCAAT-3 '

MIR-16 Fw: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3'

MIR-16 Rev: 5 "-TGCGTGTCGTGGAGTC-3 '

Fluco-FW: 5'-GGTCCTATGATTATGTCCGGTTATG-3'

Fluco-Zj: 5'-ATGTAGCCATCCATCCTTGTCAAT-3 '

GAPDH-Fw: 5'-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3 '

GAPDH-Rev: 5'-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3'

Western blot analýza

SGC7901 bunky boli trikrát premyté PBS a potom lyžovanie v chladnom lyzačním pufri (20 mM NaCl, 200 mM Tris-HCl [pH 7,4], 1 mM fenylmetylsulfonyl fluorid, 1% Triton X-100 a 1% aprotinín) počas 30 minút na ľade. Fragmenty buniek boli potom centrifugovány pri 12000 otáčkach za minútu počas 15 minút pri teplote 4 ° C. Supernatant sa oddelí a rovnaké množstvo proteínu boli rozdelené o 8% SDS-PAGE a potom prenesené na nitrocelulózové membrány. Membrány boli inkubované v blokujúcom roztoku, ktorý obsahuje 5% BSA po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti, a potom sa vykonali imunoblotu s uvedenými protilátkami. Imunoreaktívnych pásy boli vizualizované pomocou rozšírenej sady chemiluminiscencie (Amersham Pharmacia Corp, Piscataway, NJ).

MTT test

Ak chcete zistiť rýchlosť rastu NF-prázdne, NF-3xmir16 a NF-3xmir16 /VCR bunky, tieto tri typy buniek boli vrúbľovať do 96-jamkových doštičiek s rovnakými číslami (5,000 buniek na jamku). V rôznych časových bodoch (24, 48, 72, 96 h), 25 ul 5,0 mg /ml sterilne filtrovaný 3- (4, 5-dimetyl-thiazol-2-yl) -2, 5-difenyl tetrazolium bromidu (MTT; Sigma) bolo pridané do každej jamky. Nezreagovaný farbivo bolo odstránené po 4 hodinách inkubácie a nerozpustné kryštály formazánu sa rozpustí v 100 ul dimetylsulfoxidu (DMSO). Absorbancia pri 570 nm (referenčná vlnová dĺžka 630 nm) bola meraná pomocou Synergy II multimode mikrodoštičiek (BioTech Instruments, VT).

Rádioaktívne vychytávania jodidu test

Ak chcete určiť vzťah medzi jodidu príjem a počet buniek, sérií riedenie buniek boli vrúbľovať do 24-jamkových doštičiek. Po 12 hodinách inkubácie bola skúmaná miera absorpcie ^{131 I. Vychytávania jodidu bola určená inkubáciou buniek s vyváženým soľným roztokom 500 ul Hanksův (HBSS) obsahujúci 0,5% hovädzieho sérového albumínu s 37 kBq nosného bez Na 131 I a 10 mM Nal po dobu 30 minút. Po inkubácii boli bunky premyté dvakrát tak rýchlo, ako je to možné v 1 ml ľadovo chladného HBSS pufra. Bunky boli oddelené s 200 ul trypsínu, a rádioaktivita sa meria za použitia y-čítača (Perkin-Elmer). Pre vyhodnotenie funkčné expresiu hnisu v systéme reportérového génu, NF-3xmir16 bunky boli nasadené na na 1 x 10 5 buniek na jamku v 24-jamkové doštičke deň pred transfekcia, potom boli transfekovány miRNA-16 a NC oligo , 24 hodín neskôr sa vychytávania jodid boli merané, ako je popísané vyššie.}

In vitro
bioluminiscenční zobrazovanie skúška

, ktorý definuje vzťah medzi luminiscenčné signály a počtu buniek, zrieďovacej rad buniek boli vrúbľovať do 24-jamkových doštičiek. Po 12 hodinách inkubácie bola každá jamka premytá fosfátom beffered fyziologickom roztoku (PBS). Potom D-luciferínu (Xenogen) v koncentrácii 0,5 mmol /l bol pridaný bezprostredne pred testom. Bioluminiscencia bola meraná Ivis 100 zobrazovacieho systému (Xenogen) a analyzujú za použitia Living Image softvér verzie 2.50 (Xenogen). Pre vyhodnotenie funkčné expresiu Fluco v systéme reportérového génu, NF-3xmir16 bunky boli nasadené na na 1 x 10 ^{5 buniek na jamku v 24-jamkové doštičke deň pred transfekcia, potom boli transfekovány miRNA-16 a NC oligo , 24 hodín neskôr, test Bioluminiscencia bola meraná ako je popísané vyššie.}

bioluminiscenční a 99mTc-technecistanu zobrazovanie u nahých myší

rovnaký počet (5 x 10 ^{6 buniek) z NF-prázdne a NF-3xmir16, alebo NF-3xmir16 /VCR a NF-3xmir16 bunky, boli xenografted subkutánne do ľavej a pravej zadnej časti boku holej myši každý, ako je uvedené vo výsledkoch. Bioluminiscenční zobrazovanie bol získaný jeden deň po injekcii buniek. Všetky myši sa anestetizují 2,5% izofluranom plynu v kyslíka pri prietoku 1,5 l /min. Vodný roztok D-luciferínu (150 mg /kg telesnej hmotnosti) bol injikovaný podkožne 10 min pred zobrazením. Celotelová fotografie pre Fluco signály boli získané po dobu 2 minút a Living Softvér Image (Xenogen) bežal k získaniu bioluminiscenční snímok. ROI bol vybraný ručne cez intenzity signálu. Bioluminiscencia signály sú vyjadrené ako fotónov za sekundu na kubický centimeter na steradián (p /s /cm 2 /SR) v ROI.}

U jadrových zobrazovanie, nádor nesúce myši bolo intraperitoneálne podali 18,5 MBq o ^{99m-technecistanu na 2-týždenné po injekcii buniek. 30 min po injekcii boli zvieratá umiestnené v roztiahnuté polohe, v polohe na chrbte na dne SPECT skenera (Symbio T2, Siemens). Anestézia bola vykonaná s 1% až 2% izofluranu v 100% O _{2 počas vstrekovanie a spracovanie obrazu. Všetky obrazy boli rekonštruované s 2-rozmerná objednaný-podmnožín očakávania maximálnu algoritmu. Aktivita sa kvantifikuje prehliadanie oblastí záujmu (ROI) v nádoroch a oblasť ROI sa udržiava konštantný na všetkých jadrových a optických snímok. Po bioluminiscenční a 99mTc-technecistanu zobrazovanie, nádory boli odobraté a zvážené.}}

Štatistická analýza

Výsledky sú vyjadrené ako priemer ± SD. Údaje vypovedajúce o porovnanie medzi dvoma skupinami boli hodnotené pomocou t test. Porovnanie medzi viac ako dvoma skupinami boli stanovené pomocou analýzy variance (ANOVA) s príslušným testovaním posthoc. P hodnoty. ≪ 0,05 boli považované za štatisticky významné

Výsledky

Vznik žalúdočných rakovinových bunkových línií stabilne exprimujúcich hnisu a gény Fluco

Ak chcete vygenerovať fúzny reportéri gén (GV260- hnis /Fluco, uvedené NF-prázdny) sa hnis cDNA bola klonovaná do vektora lentivirem (GV260-Fluco-puro) kódujúci gén Fluco pre vytvorenie fúzneho proteínu, ktorý bol pod kontrolou promótor ubikvitinu. Potom sa po stop kodóne fúzneho génu hnis /Fluco vytvárať ďalšie konštrukt vložený tri kópie komplementárne sekvencie proti miRNA-16 (3xmir16) (GV260-hnis /Fluco-3xmir16 uvedenej NF-3xmir16) (obrázok 1A). Kódovanú nukleotidovej sekvencie podobnú dĺžku, aby 3xmir16 bol tiež vložený na 3 'UTR génu hnis /Fluco fúzneho k získaniu kontrolného konštrukt (GV260-hnis /Fluco-Scramble, odvolával sa na NF-scramble). In vitro
Bioluminiscencia zobrazovacie ukázalo, že Fluco gén aktivita NF-prázdnych buniek bol podobný tomu z NF-Scramble buniek (obr S1A). Tak sme si vybrať NF-prázdne konštruktu v ďalšom štúdiu. Dve bunkové línie, čo je MDR rakovina žalúdka u ľudí bunková línia SGC7901 /VCR a jej rodičovské bunkové línie SGC7901, boli transdukovány s lentivirus, ktorý obsahuje NF-prázdna alebo NF-3xmir16 gén, respektíve vytvoriť tri stabilné bunkové línie NF-prázdne /SGC7901, NF -3xmir16 /SGC7901 a NF-3xmir16 /SGC7901 /VCR (ďalej NF-prázdne, NF-3xmir16 a NF-3xmir16 /VCR). Najprv je vykonaná MTT test pre meranie rastu týchto troch bunkových línií (obr S1B). Potom sme perfomed qPCR test vyšetrovať integrovaných kópií reportér konštruktov v troch bunkových líniách (Obr S1C). In vitro
bioluminiscenční zobrazovania (Obrázok 1B) a Western blot (obrázok 1C) boli ďalej vykonané, aby sa preukázala úspešnou expresiu Fluco a hnisu génov v týchto troch bunkových línií.

Linearita korelácia Fluco a transgénnej aktivity hnis s počtom buniek in vitro

Ak chcete zhodnotiť transgénu činnosti Fluco a hnis v bunkách, sme vykonali in vitro
Bioluminiscencia zobrazovacie a ^{131 I radioiodide vychytávania testy v sérií riedení bunkové línie NF-3xmir16. Ako je znázornené na obrázku 1D, v závislosti na zvýšenie počtu buniek, akumulácia luminiscencia tiež zvýšil. Bolo zistené, Bioluminiscencia signály dobre koreluje s počtom buniek (γ 2 = 0.9990) (Obrázok 1E). Medzitým 131 I vychytávania bolo tiež zvyšuje s počtom buniek (obrázok 1F). Príjem radioiodide bolo pozorované dobre korelované (γ 2 = 0,9543) s číslami buniek (Obrázok 1G). Vzhľadom k tomu, Fluco fúzovania s hnisom, dobré korelácia medzi intenzitou Bioluminiscencia a 131 I rádioaktivita bola zaznamenaná v bunkách v závislosti na lineárnej regresnej analýzy (γ 2 = 0,9339) (Obrázok 1 H).}

overenie miRNA-16 činností pomocou
reportního génového systému

aby bolo možné otestovať, či NF-3xmir16 reportér vektor obsahujúci miRNA-16 cieľových sekvencií bola potlačená exogénnym miRNA-16, sme sa zaoberali Fluco a hnisu aktivita po zavedení miRNA-16. V porovnaní s bunkách transfekciou NC oligo je Bioluminiscencia signál bol v bunkách transfekciou miRNA-16 (obrázok 2A a 2B) sa znížil o 35%. A radioiodide vychytávania ^{131 I v miRNA-16 transfektovaných buniek bola približne o 70%, ktoré v NC transfekciou bunkách kvantifikované rádioaktívnym počítanie (obrázok 2C). A aktivita Fluco a hnisu boli znížené v závislosti na dávke (Obr S1D-F). Tieto údaje naznačujú, že NF-3xmir16 reportér konštrukt by mohla byť upravovaná podľa miRNA-16.}

Detekcia endogénnej miRNA-16 expresie in vitro stroje a in vivo

Pre detekciu endogénnej miRNA-16 úrovne expresie v nádorových bunkách žalúdku in vitro
, rovnaký počet (1 x 10 ^{6) NF-prázdny a NF-3xmir16 buniek bolo vysiate a potom bolo vyšetrených aktivita Fluco a hnis. Ako je znázornené na obrázku 2D a 2E, Fluco aktivita vyplývajúce z NF-3xmir16 buniek bola znížená o približne 50% endogénnej miRNA-16 v porovnaní s od NF-prázdnych buniek. A aktivita hnis od NF-3xmir16 buniek bola tiež znížená asi o 40%, v závislosti na endogénne miRNA-16, na rozdiel od, že z NF-prázdnych buniek (Obrázok 2f). Nedostatok potláčania činností Fluco alebo hnis pozorovaných v NF-prázdnych buniek je v prípade, že nedošlo k žiadnym Mirna-16 cieľových miest v NF-prázdnej konštrukt.}

Duálne zobrazovanie reportér gén systém umožnil v vivo
vizualizácie endogénnej miRNA-16 expresie v nádorových bunkách žalúdka. Rovnaké počty (1 x 10 ^{7) z NF-prázdnych a NF-3xmir16 bunky boli xenografted subkutánne do ľavej a pravej zadnej boky každej nahé myši (n = 6) a potom sa bioluminiscenční zobrazovania a 99mTc-technecistanu gama zobrazovacie kamery boli získané. Ako je znázornené na obrázku 2G, intenzity luminiscencie z implantovaných NF-3xmir16 bunky boli o 55% nižšie, než je od NF-prázdne bunky, podobne ako na rozdiel luciferázové aktivity meranej in vitro
(obrázok 2D a 2E). Po intraperitoneálnej injekcii 99m-technecistanu na 18,5 MBq, bola vykonaná zobrazovacie gama kamera. Na rozdiel od NF-prázdna nádorov, ktoré ukazovali významné zavádzania 99m-technecistan, NF-3xmir16 nádory vykazovali zanedbateľnú absorpciu (obrázok 2 H), čo naznačuje endogénne miRNA-16 znížil výraz hnis. Fyziologická vychytávania bol pozorovaný tiež v miestach štítnej žľazy, žalúdka a močového mechúra, v ktorom hnis je normálne vyjadrené. Oblasti záujmu (ROI) Analýza ukázala, že hnis aktivita významne znížil NF-3xmir16 xenografe v porovnaní so NF-prázdnych xenoimplantátů (Obrázok 2 H). Po zobrazovanie sme zhromaždili a vážil NF-prázdne a NF-3xmir16 nádory (obr S1G). Výsledky ukázali, že majú rovnaké hmotnosti, je uvedené, že rozdiely v intenzite signálu sa má však endogénnej miRNA-16 funkcie, ale nie počtu buniek.}

Vizualizácia expresie zmeny miRNA-16 v MDR buniek karcinómu žalúdka in vitro stroje a in vivo

bola zistená zmena expresie miRNA-16 na rezistentné nádorových bunkách žalúdočnej pomocou
na Fluco a hnis činnosti zo strany Bioluminiscencia zobrazovanie a ^{131 I testy vychytávania radioiodide. Oba Fluco aktivita (Obrázok 3A a 3B) a hnis aktivita (3C) sa zvýšila o zhruba 1,5 násobne v NF-3xmir16 VCR buniek /v porovnaní s údajmi v NF-3xmir16 buniek, z ktorých vyplýva, že miRNA-16 bol downregulated v NF-3xmir16 /VCR buniek. Pre overenie výsledkov získaných pomocou systému reportérového génu, kvantitatívnej RT-PCR (Q-PCR) bola vykonaná na analýze diferenciálnej expresiu miRNA-16 v týchto dvoch bunkových línií. V súlade s údajmi systému reportérového génu, Q-PCR ukázala, znížil miRNA-16 úrovne v NF-3xmir16 /VCR, v porovnaní s jeho náprotivkom NF-3xmir16 bunky (obrázok 3D).}

neinvazívna kvantitatívne monitorovanie miRNA- 16 diferenciálnej expresie v MDR rakovinových buniek v žalúdku vivo
bioluminescent zobrazovanie a ^{99m-technecistanu zobrazovacie kamera gemy boli vykonané. Bioluminiscenční zobrazovanie preukázala, že luminiscenčné signály boli asi 1,7 násobné zvýšenie v NF-3xmir16 /VCR xenoimplantátů oproti NF-3xmir16 xenoimplantátů (Obrázok 3e), v súlade s prírastkami luciferázové aktivity meranej in vitro
(obrázok 3A a 3B). Injekcia 99m-technecistanu a získavanie zobrazovanie gama kamery ukázali, že výrazne vyššia akumulácia 99m-technecistanu bola pozorovaná u NF-3xmir16 /VCR xenoimplantátů, než že v NF-3xmir16 xenoimplantátů. Fyziologická 99mTc-technecistanu akumulácia boli pozorované aj u štítnej žľazy, močového mechúra a žalúdka (obrázok 3F). A NF-3xmir16 a NF-3xmir16 /VCR nádory mali rovnakej hmotnosti (obr S1H).}

VP-16 a 5-FU Upregulace miRNA-16 expresie neinvazívne obraz vytvorený systém génu s dvoma reportérového

Ak chcete zistiť, či iné protinádorové lieky môžu zmeniť miRNA-16 profil expresie, päť klinickej lieky na rakovinu žalúdka boli pridané do NF-3xmir16 buniek s následnou vitro
Bioluminiscencia zobrazovacie a 131 I testy. Výsledky ukázali, že intenzita luminiscencie (obrázok 4A a 4B), alebo bunková jodid príjem (obrázok 4E) sa výrazne znižuje expozíciu VP-16, 5-FU a CDDP, ale nie k MMC a liečbe ADR porovnaní s tými neošetrených buniek.

dôvody zníženej signálu pozorovaného v VP-16, 5-FU a spracovanie CDDP môže byť, že tieto lieky aktivované endogénnej miRNA-16 expresie alebo inhibovala bunkový rast aj spôsobené bunkovú smrť. Vylúčiť druhú možnosť, pridané päť lieky na NF-prázdne bunky, ktoré neobsahujú žiadne miRNA-16 cieľových miest v konštruktu. in vitro
Bioluminiscencia výsledky preukázali, že zobrazovacie VP-16 a 5-FU nemal žiadny inhibičný účinok na intenzitu luminiscencie, vzhľadom k tomu, CDDP ešte znížilo luminiscenčné signál (Obrázok 4C a 4D), čo naznačuje, že CDDP môže inhibovať bunkový rast ale neaktivuje endogénnej miRNA-16 výraz. Na druhú stranu, MMC a ADR boli zistené mierne zvýšiť intenzitu luminiscencie v oboch NF-3xmir16 a NF-prázdnych buniek (Obrázok 4A-D), ktoré môžu vyplynúť z podpory proliferáciu buniek.

Ak chcete overiť, či miRNA-16 aktivácia podieľal na protirakovinových účinkov VP-16 a 5-FU, Q-PCR bola vykonaná na stanovenie úrovne miRNA-16 na NF-3xmir16 vystavenie buniek na protinádorových liečiv ošetrenie. V súlade s tým, miRNA-16 expresie bola up-regulovaná významne po VP-16, alebo 5-FU ošetrení v SGC7901 buniek v porovnaní s neošetrenými kontrolnými bunkami, zatiaľ čo MMC, ADR a CDDP mal malý vplyv na miRNA-16 expresie (obrázok 4F).

Zvýšené miRNA-16 výrazy VP-16 a 5-FU sa podieľajú na p38 MAPK, ale NF-kB signálne dráhy
, transkripcie miRNA génov sa zdá

Podobne ako v modulácii génov RNA kódujúcich proteíny byť regulovaná niekoľkých signálnych dráh. Aktivácia NF-kB alebo MAPK signálnych dráh je spoločná odpoveď po chemoterapeutík [17], [18]. Preto sme predpokladali, že upregulace miRNA-16 môže byť dôsledkom zvýšenej aktivácia NF-kB alebo MAPK po VP-16 alebo liečenie 5-FU. Na objasnenie úlohy týchto signálnych dráh vo VP-16 a 5-FU-indukovanej transaktivace miRNA-16, sa najprv meria intenzitu luminiscencie v NF-3xmir16 buniek v odpovedi na VP-16 a 5-FU v prítomnosti alebo neprítomnosti farmakologických inhibítorov NF-kB alebo p38 MAPK. Liečba buniek špecifický inhibítor NF-kB, Bay 11-7082, nemala žiadny vplyv na luminiscenčné signál v porovnaní s liečivom ošetrené bunky bez inhibítorov (obr S2).

Na rozdiel od ošetrenia sa špecifickou p38 inhibítor MAPK, SB203850, výrazne zachránil pokles Bioluminiscencia (obrázok 5A a 5B) alebo jodidu absorpciu (obrázok 5C), VP-16 a 5-FU v porovnaní s ošetrených kontrolných buniek. Pre potvrdenie miRNA-16 expresiu v prítomnosti SB203850, PCR v reálnom čase bola vykonaná a výsledky ukázali, že inhibítory p38 MAPK výrazne potlačená VP-16 a 5-FU-indukovanej miRNA-16 up-regulácia (obr 5D), čo naznačuje, že zvýšená miRNA-16 expresie VP-16 a 5-FU sa podieľa na p38 MAPK signalizačnej ceste.

Naše predchádzajúce štúdia preukázala, že Bcl-2 proteín je priamym cieľový gén z miRNA-16 vo vývoji MDR v SGC7901 buniek karcinómu žalúdka [11]. Ak chcete otestovať, či Bcl-2 je zapojený do VP-16 a 5-FU stimuláciu miRNA-16 Prostredníctvom
p38 MAPK sme zistili, Bcl-2 hladinu proteínu analýzou westernovým prenosom. Ako je znázornené na obrázku 5E a 5F, VP-16 a 5-FU významne znížila hladinu Bcl-2 proteín o približne 50% v porovnaní s neošetrenými kontrolnými bunkami v neprítomnosti SB203850. Po ošetrení spolu s SB203850, zníženie Bcl-2 proteínu bola drasticky oslabené, čo naznačuje, že je dôležité, aktivácia p38 MAPK vo VP-16 a 5-FU-indukovanej downregulace Bcl-2 proteínu.

in vivo
monitorovanie posilnenej miRNA-16 expresie VP-16 a 5-FU

neinvazívna monitorovanie posilnenej miRNA-16 expresie vyvolanej VP-16 a 5-FU, NF-prázdny a NF -3xmir16 bunky boli vrúbľovať na pravej a ľavej zadnej končatiny každej myši (n = 6), v danom poradí. Aby sa zabránilo Bioluminiscencia signál z NF-prázdne narúša že od NF-3xmir16 počas liečby drogovej závislosti, rôzne počty NF-prázdna (1 x 10 ^{5 buniek) a NF-3xmir16 (1 x 10 7 bunky) boli vrúbľovať. Ako je znázornené na obrázku 6, výrazne znížila intenzita Bioluminiscencia bol pozorovaný u NF-3xmir16 xenoimplantátů po VP-16 alebo liečbe 5-FU v porovnaní s nontreatment. Najmä u myší ošetrených VP-16 sa Bioluminiscencia signálu znížená o približne 40% v NF-3xmir16 xenoimplantátů, zatiaľ čo sa mierne zvýšila na NF-prázdnych xenoimplantátů oproti predchádzajúcej liečbou obrázkov (obrázok 6A a 6B), podobne rozdielu intenzity luminiscencie spôsobená VP-16 in vitro
(Obrázok 4A-D).}

• PLoS ONE: microRNA-219-2-3p Funguje ako nádorový supresor v rakoviny žalúdka a je riadená metylácie DNA
• Ploche ONE: pridružení medzi glutatión S-transferáza T1 Null genotypu s rakovinou žalúdka riziko: meta-analýze 48 štúdií