Ploche ONE: Odhalenie molekulárnej mechanizmus Žalúdočné Cancer Marker annexinu A4 v Cancer Cell proliferácie Použitie Exon Arrays

abstraktné

Karcinóm žalúdka je malígne ochorenie, ktoré vzniká zo žalúdočného epitelu. Potenciálne biomarkerov rakoviny žalúdka je proteín annexin A4 (ANXA4), intracelulárne Ca ^{2 + čidlo. ANXA4 je primárne nachádza v epiteliálnych bunkách, a je známe, že sa zúčastňujú rôznych biologických procesov, vrátane apoptózy, bunkového cyklu a antikoagulácie. Vo vzťahu k rakovine, ANXA4-nadmerná expresia bola pozorovaná u rakovín rôzneho pôvodu, vrátane nádorov žalúdka spojené s Helicobacter pylori
infekcie. H. pylori
indukuje ANXA4 výraz a intracelulárnu [Ca 2 +] _{aj výšku, a je významným rizikovým faktorom pre karcinogenéze, ktoré vedie k rakovine žalúdka. Napriek tejto korelácie, role ANXA4 progresie nádorov žalúdka zostáva nejasná. V tejto štúdii sme skúmali, či môže sprostredkovať ANXA4 rýchlosť rastu buniek a či sú ANXA4 následné signály zapojené do vzniku nádorov. Po monitorovanie rýchlosti rastu buniek v reálnom čase, sme zistili, že ANXA4 podporuje bunkovú proliferáciu. Transkripcie génov profil buniek ANXA4-expresiou bola meraná a analyzovaná ľudskými exon poľa. Z týchto transkripčných dát génu, ukazujeme, že nadmerná expresia ANXA4 reguluje gény, ktoré je známe, že sa v súvislosti s rakovinou, napríklad aktiváciu hyaluronanu sprostredkovanej motility receptora (Rham), AKT a cyklin-dependentnej kinázy 1 (CDK1), ako aj potlačenie p21. Regulácia týchto génov ďalej indukuje proliferáciu rakovinových buniek. Tiež sme zistili, Ca 2+ mohla regulovať prenos nadväzujúcich signálov ANXA4. Odporúčame, ANXA4 spúšťa signálne kaskádu, ktorá vedie k zvýšenej proliferácii buniek epitelu, v konečnom dôsledku podporovať karcinogenéze. Tieto výsledky teda môže poskytnúť nový pohľad na liečbu rakoviny žalúdka, najmä prostredníctvom modifikácie ANXA4 činnosti}}

Citácia :. Lin LL, Huang HC, Juan HF (2012) Odhalenie molekulárnej mechanizmus rakovina žalúdka Marker annexinu A4 Cancer Cell proliferácia Používanie exon poľa. PLoS ONE 7 (9): e44615. doi: 10,1371 /journal.pone.0044615

Editor: Eric Y. Chuang, National Taiwan University, Taiwan

prijatá: 6. júna 2012; Prijaté: 06.08.2012; Uverejnené: 07.09.2012

Copyright: © Lin et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený vedeckej rady Národného Taiwan (NSC 99-2621-B-002-005-My3, NSC 99-2621-B-010-001-My3), National Taiwan University špičkových riadenie Research Project (10R70602C3) a National Health Research Institute, Taiwan (NHRIEX100-9819PI). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

žalúdka rakovina je druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu po celom svete a vykazuje vysokú prevalenciou u ázijskej populácie. Aj keď je výskyt karcinómu žalúdka klesá, celkový 5-ročné prežitie zostáva na nízkej úrovni [1]. Určovanie najefektívnejších rakovinou žalúdka terapiou a vyvíjať v skorom štádiu diagnostické nástroje sú dôležité stratégie v ovplyvnenie klinické výsledky. Komplexné vyšetrenie molekulárne mechanizmy, ktoré sú základom žalúdočné karcinogenéze by mohol poskytnúť pomoc pri vývoji užitočných terapeutických stratégií pre toto ochorenie.

Helicobacter pylori
je žalúdočné patogén a je hlavným etiologickým faktorom pre žalúdočné karcinogenéze , Približne polovica svetovej populácie je infikovaná H. pylori
, a viac ako 60% pacientov s karcinómom žalúdka v minulosti H. pylori
-positivity [2], [3], [4]. Nedávne štúdie ukázali, že H. pylori
môžu spôsobovať proliferáciu buniek karcinómu žalúdka a slizničné zápalové reakcie [5], [6]. Tak na preskúmanie molekulárnych mechanizmov základnej žalúdočné karcinogenéze, je potrebné skúmať úlohu a mechanizmov H. pylori
žalúdočné rakoviny.

Annexins sú všadeprítomné vyjadrené vo väčšine organizmoch, vrátane zvierat, rastlín, húb a prvokov. To je spojené s celým radom fyziologických funkcií [7]. o štruktúre svojho jadra konzervované domény založené na annexins sú považované za intracelulárnu Ca ^{2 + snímače a väzbu fosfolipidové proteíny. Boli pozorované na podporu obchodovania s membránou a vačkov agregáciu v reakcii na zvýšenú intracelulárnej [Ca 2 +] _{i [8], [9]. U ľudí, boli annexins Bolo pozorované, že majú rad bunkových funkcií, ktoré boli implikovanej v cytoskeletu organizácii, exocytózy, endocytózy, reguláciu iónových kanálov, zápal, apoptózy, fibrinolýzy a koagulácia [8]. Annexins sú tiež považované za zapojený do rakoviny, cukrovky a zápalu [10]. V poslednej dobe sa stále viac a viac štúdií ukázalo, že zapliesť zapojenie annexins v karcinogenéze, ako aj podporovať šírenie [11], [12], invázia [13] a metastázy [14], [15]. Avšak, nebol charakterizovaný vzťah medzi všetkými členmi rodiny annexins s rakovinou.}}

annexin A4 (ANXA4) je členom rodiny annexins spojené s tráviacim ústrojenstvom. To je výrazne exprimovaný v epiteliálnych bunkách [16]. Nedávne štúdie ukázali, že ANXA4 je považovaný za potenciálny žalúdočné biomarker založený na jeho identifikáciu v tkanivách pacientov s karcinómom žalúdka v proteomických štúdiách. Up-regulácia ANXA4 je špecificky nájsť v H. Pylori
-infected nádorového tkaniva [17], [18]. Ďalej, mnoho štúdie preukázali vzťah medzi ANXA4 prejavu a rakoviny. Tento vzťah bol hlásený v pankrease adenokarcinóm [19], jasné karcinómu vaječníkov [20], [21], karcinómu obličky [22], kolorektálneho karcinómu [23] a rakovinou prostaty [24]. Karcinómu obličkových buniek, up-regulácia ANXA4 sa podieľa na šírení nádorových buniek, propagáciu migráciu buniek [22]. U pacientov s kolorektálnym karcinómom, vysoká expresia ANXA4 bola spojená s nízkou mierou prežitia a bola označená ako potencionálne biomarkeru pre diagnostiku nádoru [23]. Ak bunkové funkcie, ANXA4 sa môžu vyskytnúť vápenatý, antikoagulačnej a odolnosť proti apoptóze [25], [26]. Tieto udalosti ukazujú, že ANXA4 má onkogénne funkciu tým, že reguluje rýchlosť rastu buniek.

V tejto štúdii sme chceli objasnenie molekulárnej mechanizmus, ktorým ANXA4 indukuje karcinogenéze. Na dosiahnutie tohto cieľa, sme sledovali tempo rastu buniek karcinómu žalúdka s rôznymi úrovňami expresie ANXA4. Tiež sme vyhodnotili transkripcie expresné profil ANXA4-zvýšenej exprimujúcich buniek a použiť exon pole na analýzu downstream signalizáciu ANXA4. Z týchto štúdiách sme identifikovali 9 génov súvisiacich s rakovinou z ANXA4 nadväzujúcich signálov pomocou databázy vynaliezavosť Pathway Analysis (IPA). Ďalej sme preukázali, že ANXA4 reguluje aktiváciu RHAME, AKT, CDK1 a potlačenie p21, a preto navrhla ANXA4 regulovanej bunkovej proliferácie dráhu.

Výsledky

The Aktivácia ANXA4 podporuje cell proliferation

sme už skôr uviedlo, že ANXA4 je nadmerne vystavený v H. pylori
infikovaná žalúdočná nádorového tkaniva [17]. Ďalej skúmať vzťah medzi ANXA4 a karcinogenézy, sme sa zamerali na zistenie, či ANXA4 podporuje proliferáciu buniek. Bunky boli transfekovány buď v plnej dĺžke ANXA4
cDNA pre zvýšenie expresie alebo ANXA4 špecifickú siRNA určené na umlčanie ANXA4 expresie. Po transfekciu sme sledovali tempo rastu AGS buniek rakoviny žalúdka s použitím systému analýzy v reálnom čase cell (RTCA). Počty buniek boli zaznamenané ako hodnota indexu bunky (CI). Rastové krivky AGS bunky boli modifikované po transfekciu. Zvýšená expresia ANXA4 výrazne zvýšila miera bunkového rastu u AGS bunkách v porovnaní s kontrolnými bunkami ( P Hotel < 0,001; 1A), zatiaľ čo porazený ANXA4 významne znížil rýchlosť rastu ( P Hotel <0,001, obrázok 1B). Tieto výsledky naznačujú, že ANXA4 má potenciál na zlepšenie bunkovej proliferácie.

ANXA4 Zvyšuje expresiu membránových proteínov, RHAME a LAMP2

Tiež sme skúmali rozdiely v génovej expresii medzi ANXA4-nadmerne exprimujúce bunky a kontrolné bunky exprimujúce prázdny vektor. Skúmali sme to pomocou exon polia analýza, ktorá poskytuje presnejší pohľad na génovej expresie na úrovni pomocou štyroch sond na exon, v porovnaní s bežnými 3 'polí [27]. Na obrázku S1, X
v osi na bodovom diagrame zobrazuje intenzitu výrazu sondy meranej v jednom experimente a Y
os zobrazuje intenzitu výrazu sondy sa meria v inom experimente , Tieto výsledky ukazujú vzťah medzi výsledky oboch experimentov, a preto naznačujú súlad medzi našimi duplicitných microarrays. Hladiny génovej expresie boli vypočítané z nameraných intenzít pomocou sady sond. Celkovo sa zistilo, že expresie génov 1,052 významne líšia ( P Hotel &0,05). Medzi bunkami ANXA4-expresiou a kontrolných buniek

ANXA4 je plazmatický proteín viažuci membrány, a tak sme navrhujeme, aby ostatné plazmové membránové proteíny by mohli byť regulované ANXA4 a spoločne pracovať na prenášajú svoju downstream signalizáciu. Preskúmať signálne transdukcie regulovaná ANXA4 sme skúmali plazmové membránové proteíny z exónu analýzy poľa. Štyridsať sedem plazmové membránové proteíny bola pozorovaná zmena ≥ 1,5-násobne v ANXA4-expresiou buniek (tabuľka S1). Medzi nimi, hyaluronan-sprostredkovaná motility receptora ( HMMR
) ukazuje najväčšie zvýšenie expresie (2,4-násobné Tabuľka S1). Navyše naše predchádzajúce štúdia ukázala, že na povrchu buniek expresie lysozomálnej asociovaných membránový proteín 2 ( LAMP2
), lysozomálnej markerom, je up-regulovaná ANXA4 a podieľa sa na exocytózou (obr S2 a S1 súboru) , Tu transkripčné expresia LAMP2
tiež preukázali zvýšenie expresie (1,8-násobne Tabuľka S1), merané pomocou analýzy exon poľa. V tejto štúdii bol ANXA4 nadmerne exprimované alebo umlčaný (obrázok 2A) a potom analyzované imunoblotováním ku kontrole expresie proteínu RHAME a LAMP2. ANXA4 nadmerná expresia zvýšila expresiu Rham (obr 2B) a LAMP2 (obrázok 2c) av súlade s tým je porazený zo ANXA4 vyjadrenie sa znížil ich hladiny expresie (obrázok 2b a 2c).

ANXA4 Nadprodukcie Reguluje rakoviny by preto Gene Expression

sme použili databázu vynaliezavosť Pathway Analysis (IPA) na vykonanie analýzy génovej funkcie dát exon poľa a zistil, že 25 zo 42 génov boli oprávnené na analýzu sieťové funkcie (≥2-fold diferenčné vyjadrenie, t
test, P Hotel < 0,05) (tabuľka 1). Tieto funkčné siete boli významne spojené s génmi ANXA4-regulované. Najviac silne spojený sieť bola
rakoviny, bunkového cyklu, a reprodukčný systém ochorenia ( P Hotel &0,05; 3A) a top-zaradil chorôb či porúch bola rakovina
( P Hotel &0,05; obrázok 3B). Tam bolo 9 gény sú klasifikované ako génov súvisiacich s rakovinou v bunkách ANXA4-expresiou vrátane 7 génov, ktoré boli up-regulované v našich experimentoch. Tieto gény sú eukaryotické translačný iniciačný faktor 4E ( eIF4E
), sukcinát dehydrogenázu komplex, podjednotka C, integrálne membránový proteín, 15 kDa ( SDHC
), Cdk1 ( CDK1
), vypúšťa sa v lymfocytárnej leukémie 2 ( DLEU2
), chromatín modifikáciu proteín 5 ( CHMP5
), NADČASOVÝ interagujúce proteín ( TIPIN
), PDZ- viažuci kinázu (
PBK). Chorionický somatomammotropin hormón 1 (placentárnu laktogen) ( CSH1
) a interferón alfa 2 ( IFNA2
) boli down-regulované ANXA4. Na základe našich výsledkov, navrhujeme, aby ANXA4 má funkciu indukovať proliferáciu buniek. Okrem toho CDK1 stroje a PBK
(obrázok 3B a tabuľka 1) boli považované za zapojený do ANXA4 proliferácie vyvolávajúce modelu. Vzhľadom k tomu, aktivácia CDK1 je spojená s bunkovou proliferáciou v rozvojových žalúdočnej MALT lymfómu [28]. Vzájomná aktivácia CDK1 a PBK bolo oznámené predtým [29]. V tejto štúdii, up-regulácia CDK1 stroje a PBK
pozorovaná v bunkách ANXA4-expresiou boli potvrdené kvantitatívne real-time PCR (QRT-PCR) analýzy (obr S3) .

ANXA4 Reguluje aktivácia Akt CDK1 a potlačenie p21

aktiváciu CDK1, ktorý je upravený p21, inhibuje G2 /M fáze zastaviť, čím sa podporí mitózu a bunkové proliferácie [30 ]. Tiež bolo opísané, že Akt blokuje aktiváciu p21, čo spôsobuje jeho akumulácie v cytoplazme a v dôsledku toho podporovať proliferáciu buniek [31]. Za použitia analýzy imunoblotu, sme pozorovali, že nadmerná expresia ANXA4 zvyšuje fosforyláciu serínu 473 a treonínu na AKT 161 na CDK1 a zníženie expresie p21 (obrázok 4A). Okrem toho sa Vyradenie ANXA4 expresie klesla fosfo-AKT a fosfo-CDK1 a zvýšila expresiu p21 (Obrázok 4B). Tieto údaje naznačujú, že fosfo-AKT, fosfo-CDK1 a P21 sú regulované ANXA4 a sú downstream signály ANXA4.

Ca 2+ sprostredkováva ANXA4 signalizácie downstream transdukcia

V karcinogenézy, ca ^{2+ sa podieľa na vzniku signálnu transdukciu sprostredkovať širokú radu biologických procesov vrátane invázie, proliferácie, angiogenézy a metastázy [32]. Bolo oznámené, že annexins môže sprostredkovať niektoré fyziologické mechanizmy v Ca 2 + -dependentní spôsob [9]. V predchádzajúcich štúdiách, intracelulárne [Ca 2 +] _{aj nadmorská výška bola vyvolaná H. pylori
infekcie, ktorý, podľa poradia, up-reguluje expresiu ANXA4 [17], [33]. Ak chcete zistiť, či zvýšenie intracelulárnej [Ca 2 +] aj sprostredkuje prenos signálov z nadväzujúcich ANXA4, AGS bunky boli ošetrené ionomycinu. Ionomycin je Ca 2+ ionofór a bola pridaná do kultivačného média v našom modeli AGS bunky k vyvolaniu trvalé zvýšenie intracelulárnej [Ca 2 +] i [34]. Proteínové výrazy ANXA4, LAMP2, RHAME, p21, fosfo-AKT a fosfo-CDK1 boli merané imunoblotovou analýzou (obrázok 5A). Podobne ako u našich pozorovaní sa ANXA4 nadmernou expresiou, zvýšenie [Ca 2 +] aj hladiny významne up-regulovaná expresia Rham ( P Hotel &0,01) a fosfo-AKT (Ser 473) ( P Hotel &0,05) a významne down-regulované expresiu p21 ( P Hotel &0,01) (obrázok 5B). aktivácia CDK1 sa mierne zvýšil o [Ca 2 +] i výške. Avšak zvýšené [Ca 2 +] aj hladiny nemal žiadny vplyv na expresiu ANXA4 a LAMP2. V našej predchádzajúcej štúdii, ANXA4 a LAMP2 možno lokalizovať do plazmatické membrány po H. pylori
infekcie intracelulárnymi [Ca 2 +] aj nadmorská výška (obr S4 a File S1). Tieto výsledky naznačujú, že Ca 2+ len zmení vnútrobunkovej umiestnenie ANXA4 a LAMP2, ale nie upravuje ich vyjadrenia.}}

Diskusia

V oblasti výskumu rakoviny, identifikácia biomarkerov a následné objasnenie ich mechanických vzťahov s vzniku nádorov môže prispieť k rozvoju užitočných diagnostických nástrojov a mať za následok optimálne terapeutické stratégie. V poslednej dobe sa stále viac a viac štúdií ukázali, že biomarker kandidátske proteíny v rodine annexins sú potenciálne pomocný v progresii rôznych druhov rakoviny; napríklad ANXA1 pre jasné bunky rakoviny obličiek, žalúdka ANXA2 pre rakoviny a rakoviny hrubého čreva, rakoviny hrubého čreva a ANXA4, ANXA8 karcinómu prsníka, ANXA10 hepatocelulárneho karcinómu, ANXA11 pre rakoviny vaječníkov a rakoviny hrubého čreva [35]. ANXA4, člen rodiny annexins, bolo pozorované, že sa nadmerne exprimovaný v žalúdočných nádorových tkanivách a je tiež spojená s rakovinou žalúdka súvisiace s H. pylori
infekcie [17]. Okrem toho, ďalší člen rodiny annexins, ANXA2, tiež bol pozorované, že je nadmerne exprimovaný v karcinómu žalúdka, a je spojená so zlou klinickou odpoveďou, čo je potenciálny prognostický faktor [36]. Dohromady tieto nálezy naznačujú, že zapojenie ANXA4 na vzniku nádorov; však, jeho presný mechanizmus v procese zostáva nejasný. S cieľom ďalšieho vyhodnotenia bunkovej funkcie ANXA4 progresie rakoviny žalúdka, skúmali sme spojenie medzi dvoma a následne preukázali, že ANXA4 môže regulovať gény súvisiace s rakovinou a propagovať cestu k proliferácii buniek.

Táto štúdia, sme zistili, že karcinogenézy asociované proteíny, ako je RHAME, AKT, p21, PBK, a CDK1 upravuje nadmerné expresiu ANXA4. Schematické znázornenie ANXA4 indukovaných nadväzujúcich signálov spojených s bunkovou proliferáciou je znázornené na obrázku 6. HMMR
(Rham) je onkogén, ktorý je nadmerne exprimovaný v mnohých druhov rakoviny, vrátane rakoviny žalúdka, a sa podieľa na mnohých mobilný procesy, ako je bunkové signalizácia, proliferáciu buniek a vzniku nádorov [37], [38].

bolo zistené, že RHAME indukuje signálnu kaskádu RAS a aktivuje Akt [39]. RAS signalizačné kaskáda transdukuje downstream signály aktiváciou fosfo-AKT prostredníctvom fosfoinositid 3-kináz. Táto aktivácia Akt bol hlásený aj ako marker progresie rakoviny žalúdka [40]. Už skôr sme uviedli, že H. pylori
infekcie je spojená s nadmernou expresiou ANXA4 [17]. H. pylori
môže zabezpečiť cytotoxin spojená génu (ČAGA) do hostiteľských buniek, čo vedie k aktivácii Akt a dochádza tak k proliferácii buniek [41]. Pokiaľ ide o prežitie buniek, AKT potláča apoptózu stimuláciou NF-kB [42]. Nedávne štúdie tiež ukázali, že ANXA4 interaguje s P105 (P50 prekurzorového proteínu NF-kB), a potláča transkripčné aktivitu NF-kB pre indukciu anti-apoptotický účinok [25]. Dohromady tieto pozorovania naznačujú, že ANXA4 hrá dôležitú úlohu v bunkovom prežívanie a rast buniek.

CDK1-cyklin B1 komplexy reguláciu bunkového cyklu G2 /M fáze, a sú zapojené aj v podpore tumorigenezi [43]. Nedávna štúdia ukázala, že zvýšená expresia CDK1 je spojená s progresiou z H. pylori
-associated gastritídu slizníc spojených s lymfoidné tkanív lymfómu [28]. V tejto štúdii, aktivácia CDK1 bola up-regulovaná podľa ANXA4. Tieto udalosti naznačujú, že by mohlo ANXA4 sprostredkujú downstream signálne dráhu, čo vedie k vzniku nádorov u pacientov s karcinómom žalúdka s H. pylori
infekcie.

Okrem zapojenia do progresie rakoviny, ANXA4 bola tiež spojená s získané chemorezistence na protinádorových liečiv [44], [45], [46]. V bunkovej línii odolnej voči paklitaxelu (H460 /T800), ANXA4 expresie sa zvyšuje a lokalizovaný v jadre [44]. V jasnom karcinómu vaječníkov a mezoteliomu buniek, ANXA4 expresia je zvýšená a spojené s rezistenciou na liečbu s karboplatinou, a je považovaný za biomarker na vnímavosť k cisplatine [45], [46]. Okrem toho, ANXA4 je intracelulárnej Ca ^{2 + senzor, a Ca 2+ hrá dôležitú úlohu v neurotoxicity a srdcové zlyhanie [47], [48]. Nedávne štúdie ukázali, že zvýšené množstvo ANXA4 je nielen spojený s rakovinou, ale aj Alzheimerovej choroby, srdcového zlyhania a bunkovej lézie spôsobené etanolu [49], [50], [51].}

Ca ^{2+ je tiež potrebné messenger systém pre bunkové proliferácie procesu a môže regulovať bunkový cyklus [52], [53]. Bolo oznámené, že Ca 2+ možno aktivovať Akt dráhy k podpore prežívanie buniek [54]. V tejto štúdii sme zistili, že expresia RHAME, fosfo-AKT a potlačenie p21 významne zvýšili o [Ca 2 +] _{aj nadmorskej výšky (Obrázok 5). H. pylori
infekcie je spojená s nadmernou expresiou ANXA4 a intracelulárnu [Ca 2 +] aj nadmorská výška (obr S4 a súborový S1) [17], [33]. Tieto výsledky ukazujú, že H. pylori
infekcia mohla vyvolať nejaké downstream signalizáciu ANXA4 tým, že stimuluje intracelulárnu [Ca 2 +] i výške. Avšak detail mechanizmu v tomto procese môže byť zložitý a zostáva nejasný. Tie by mohli poskytnúť vysvetlenie vzniku nádorov žalúdka procesu je základom H. pylori
stimuláciu. Dohromady to nasvedčuje tomu, že Ca 2+ mohli pomôcť ANXA4 sa prenášajú signalizáciu a podporovať nádorového žalúdka u pacientov s H. pylori
infekcie.}}

Na záver, naše výsledky ukazujú, že umlčanie ANXA4 znižuje proliferáciu buniek epitelu, zatiaľ čo nadmerná expresia sa zvyšuje proliferáciu. Okrem toho ANXA4 vyvoláva následné signály, ktoré podporujú rast buniek. Predpokladáme, že tieto signály a následní aktivácia delenie hostiteľskej bunky môžu byť patogénne udalosti v H. pylori
indukovanej rakoviny. V súčasnej klinickej terapii, AKT, p21 a CDK1 boli použité ako cieľ protinádorového liečiva. inhibítor AKT, Perifosine, je ústne protirakovinové činidlo a má anti-proliferačnú aktivitu v rôznych nádorových modeloch [55], [56], [57]. Paclitaxel (Taxol) a vinkristínom môže vyvolať aj zvýšenie expresie p21 k zníženiu G2 /M zatknutie a proliferáciu buniek blok [58], [59], [60], [61]. Flavopiridol je inhibítor niekoľkých CDK, vrátane CDK1 indukuje apoptózu a anti-angiogenézy [62]. Tieto štúdie ukazujú, že zvýšenie ANXA4 u pacientov, môže byť považovaný za cieľ lieku pre liečbu rakoviny žalúdka. Použitie viacerých liekov v kombinácii môže poskytnúť účinnú liečbu pre blokovanie signálov v ceste. Dohromady táto štúdia mohla poskytnúť nové pohľady na vývoj terapeutických stratégií pre rakovinu žalúdka.

Materiály a metódy

bunkové línie a kultivačné podmienky

Ľudský žalúdok adenokarcinóm AGS bunky (CRL-1739, ATCC) boli pestované v 90% médiu RPMI 1640 (Biological Industries, Bet-Haemek, Izrael), ktoré bolo doplnené 1% penicilínom /streptomycínom a 10% fetálnym hovädzím sérom (Biological Industries, Bet-Haemek, Izrael) , Bunky boli kultivované pri 37 ° C v ochrannej zvlhčenej atmosfére v inkubátore obsahujúcom 5% CO _2.

Plazmidy a transfekcia

Full-length ANXA4
sa amplifikovaná pomocou PCR s použitím primerov dvojice ANXA4
-F (5 'atataagcttgccaccatggccatggcaaccaaa 3') a ANXA4
-R (5 'gcgcgggaattcttaatcatctcctccaca 3'), a amplifikačný produkt bol vložený do HindIII /ECOR miesta pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA). ANXA4
-specifické siRNA a negatívne kontrolné siRNA Stealth (Stealth RNAi ™) boli zakúpené od Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Bunky boli kultivované v šiestich jamkami, alebo na potiahnutých krycie sklíčka po dobu 24 hodín. Bunky potom boli prechodne transfekovány pcDNA 3.1 (+) / ANXA4
(8 ug na dobu šiestich jamkami, 0,4 ug /ml pre 96-jamkové E dosky), alebo ANXA4
siRNA (100 pmol na dobu šiestich jamkami, 10 pmol na 96-jamkové doštičky E-) za použitia Lipofectamine 2000 (Invitrogen) podľa inštrukcií výrobcu. Účinnosť expresného vektora a siRNA transfekcia bola analyzovaná pomocou imunoblotu. Po transfekciu po dobu 48 hodín, bolo zistené diferenciálnej expresie proteínov a génov

Protilátky

monoklonálne myšou protilátky použité v tejto štúdii boli nasledovné :. CDK1 P34 (sc-51578) od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); LAMP2 (ab25631) a Rham (ab67003) od abca (Cambridge, UK); a α-tubulín (T5168) od firmy Sigma (Dorset, UK). Králičie polyklonálne protilátky boli nasledovné: ANXA4 (sc-28827), p21 (sc-397), a pCDK1 P34 (Thr 161, SC-101654) od Santa Cruz Biotechnology; a AKT (9272) a pakt (Ser473; 9271S). od Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)

imuno-blottingom

Bunkové lyzáty boli pripravené z AGS buniek, ktoré boli prechodne transfekovány expresné vektory pcDNA 3.1 (+) / ANXA4
(8 ug) alebo ANXA4
siRNA (100 pmol). Na stanovenie rozdielov v expresii proteínov v podmienkach vysokej intracelulárnej [Ca ^{2 +] _{i, ionomycin (5 uM) bol pridaný k bunkám po dobu 1 hodiny. Pre štúdium účinkov inhibícia fosforylácie Akt, sa bunky nechajú hladovať po dobu 1,5 hodín po 48-h transfekcia a boli liečení 5 uM inhibítora AKT VIII (Merck KGaA, Darmstadt, Nemecko) po dobu 1 hodiny. Vzorky boli separované pomocou 10% SDS-PAGE a prenesené na polyvinylidendifluoridovou (PVDF) membrány (Millipore, Billerica, MA, USA). Po blokovaní v 5% netučného mlieka a tris-vyrovnanom fyziologickom roztoku (TBS) obsahujúcim 0,1% Tween 20 (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA) po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti za mierneho kývania, boli použité nasledovné primárne protilátky: anti-ANXA4 ( 1: 1000), anti-p21 (1: 500), anti-AKT (1: 500), anti-Pakt (Ser473; 1: 500), anti-CDK1 (1: 1000), anti-pCDK1 (Thr 161; 1: 500) a anti-Rham protilátky (1: 400). Membrány boli inkubované s sekundárne kozie anti-myšou IgG konjugovanými protilátkami (Sigma) alebo kozí anti-králičí IgG konjugované (Rockland, Gilbertsville, PA), v danom poradí. a-tubulín protilátka (1: 4000) bol použitý ako vnútorná kontrola. Imunoblotu boli vyvinuté s použitím detekčnej súpravy rozšírené chemiluminiscencie (ECL) (Millipore) a vizualizovať na röntgenových filmov. Intenzita pozorovaných pásov bola normalizovaná na intenzite α-tubulínu pásma. Denzitometrické analýza bola vykonaná s použitím Kodak 1-D softvér pre analýzu obrazu verzie 3.6 (Eastman Kodak, Londýn, Veľká Británia).}}

Exon Array hybridizácia a analýza

Na štúdium nadväzujúcim gény ANXA4 sme porovnávali že profily génovej expresie medzi bunkách transfekciou pcDNA3.1 (+) / ANXA4 stroje a kontrolných buniek transfekciou prázdnym vektorom za použitia exon poľa. Celková bunková RNA bola extrahovaná za použitia TRIzol® Reagent (Invitrogen), a RNA čistota bola potvrdená spektrofotometriou (pomer A260 /A280), ako aj pomocou kapilárnej elektroforézy (Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). spracovanie RNA a hybridizácie boli vykonané za použitia Affymetrix Human Exon 1.0 ST pole (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) podľa protokolu výrobcu. Každé pole má 28,869 dobre komentovaných gény s 764,885 rôznych sond. Pole obsahuje približne 26 sondy pre každého génu. Informácie o Affymetrix sondy sety sú zobrazené na webových stránkach NetAffx (http://www.affymetrix.com) [63]. microarray analýzy (n = 2 na skupinu) bola vykonaná za použitia verzia Partek Genomics Suite 6.5 (Partek Inc., St. Louis, MO, USA). Prvotné dáta (CEL súbory) boli normalizované pomocou algoritmu robustný mnohočipový priemerovanie (RMA) a analyzované pomocou t
testy. Analýza funkcie a biologický mechanizmus z rozdielne exprimovaných génov bola vykonaná pomocou softvéru vynaliezavosť Pathway Analysis (IPA) verzia 7.5; skóre 3 alebo bola považovaná za štatisticky významnú ( P Hotel &0,01) k anotácii informácie. Máme predložili údaje o pole do databázy GEO a sériové číslo záznamu je GSE33620.

Kvantitatívne PCR v reálnom čase (QRT-PCR)

Dáta Exon pole získané pomocou softvéru Partek a databázy IPA bola potvrdená QRT-PCR. RNA bola izolovaná z buniek za použitia AGS TRIzol® Reagent (Invitrogen) a RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Nemecko) podľa inštrukcií výrobcu. Prvé vlákno cDNA sa syntetizuje z celkom mRNA za použitia reverznej transkripcie kitu (Invitrogen, Carlsbad, CA). Primery (tabuľka S2) boli navrhnuté za použitia softvéru DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, WI, USA) a PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank). Génová expresia sa merala pomocou real-time PCR detekčného systému Bio-Rad iQ5 s SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), a je normalizované k GAPDH expresii.

Test proliferácie buniek

AGS bunky boli nanesené do každej jamky 16-jamkové mikrotitračné E-dosky. Každá jamka obsahovala mikroelektronických senzorov poľa na základni pre detekciu indexu buniek (CI). Pre transfekční pokusy, po kultivácii počas 24 hodín, AGS bunky boli transfekovány expresnými vektormi alebo siRNA po dobu 6 hodín a monitorovaná po dobu celkom 84 hodín. E-doska bola umiestnená do systému analýzy v reálnom čase (Cell RTCA) a inkubované v inkubátore obsahujúcom 5% CO _{2 pri 37 ° C. Úroveň proliferácie buniek bola reprezentovaná ako CI, ktorý bol založený na elektrickej impedancie meranej pomocou systému xCELLigence (Roche, Mannheim, Nemecko).}

Štatistická analýza

Dáta bola vyjadrená ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). Rozdiel medzi nezávislými skupinami bola analyzovaná pomocou t
testy riadenia dvojchvostý Studentov. Údaje získané z testu proliferácie buniek bola analyzovaná za použitia dvoch-vzorka Kolmogorov-Smirnov test. A P
hodnota menšia ako 0,05 uvedené štatistickej významnosti.

Podporné informácie
Obrázok S1.
Bodový graf intenzít sond v opakovaných pokusoch exon polí. Intenzity sonda dvoch opakovaných pokusoch boli prezentované oddelene od X
v osi a Y
v osi. Každá sonda bola reprezentovaná jedinou bodkou v bodovom diagrame. Tieto výsledky ukázali konzistenciu v našich experimentoch duplikát exon pole
doi :. 10,1371 /journal.pone.0044615.s001
(TIF)
Obrázok S2.
ANXA4 sa podieľa na membránové opravu plazmové náborom exocytotického membránu. Zástupca cytometria tok analýzy preukázali prítomnosť LAMP2 vo H. pylori
-infected bunky. (A) Bunky ANXA4-expresiou boli porovnané s (B) ANXA4
-silenced bunky. Výsledky ukazujú, že podporuje ANXA4 LAMP2 expresiu na povrchu H. pylori
-infected bunky. ANXA4 zvýšená expresia, Over-ANXA4; Kontrolné siRNA, siControl; . ANXA4
siRNA, si ANXA4
doi: 10,1371 /journal.pone.0044615.s002
(TIF)
Obrázok S3.
ANXA4 vyvoláva následný prenos signálu. QRT-PCR test ANXA4-expresiou AGS bunky (čiernych skriniek) bola vykonaná na potvrdenie údajov získaných z exónov polí (šedej krabice). Úrovne relatívna mRNA CDK1 stroje a PBK
boli merané a normalizované na GAPDH mRNA
doi :. 10,1371 /journal.pone.0044615.s003
(TIF)
Obrázok S4.
Intracelulárne Ca 2+ nadmorská výška, ANXA4 a lokalizácia LAMP2 na H. pylori
infekciu. (A) H. Pylori
-infected AGS do buniek zavedie Fluo-3 /AM sledovať intracelulárny Ca 2+ hladiny pomocou prietokovej cytometrie. (B) Dynamic lokalizácia ANXA4 v živej bunke. Real-time fluorescenčné obrazy znázorňujúce lokalizáciu EGFP-ANXA4 vo H. pylori
-infected AGS a SC-M1 bunky (žlté šípky) zafarbené Hoechst 33258. (C) LAMP2 fluorescencie na povrchu H.

• Ploche ONE: Vplyv XPD /ERCC2 polymorfizmy na žalúdočné riziko rakoviny u rôznych etník: výzva na systematickom preskúmaní a Meta-Analysis
• Ploche ONE: sekrečnú proteín, kyslé a bohaté na cysteín (SPARC) Potláča angiogenézy Down-reguláciu expresie VEGF a MMP-7 v žalúdku Cancer