E-cadherin je zásadný pre udržanie architektúry tkaniva vďaka svojej úlohe v adhéziu bunka-bunka. mutácie E-cadherinu sú genetická príčina dedičného difúznou rakoviny žalúdka (HDGC) a chybných mutácií predstavujú klinický záťaž, vzhľadom na neistotu ich patogénne úlohu. In vitro a in vivo, väčšina mutácie viesť k strate-of-funkcie, aj keď príčinná faktor je neznámy pre väčšinu. Predpokladali sme, že destabilizácia mohol zodpovedať za patogenitu E-cadherinu chybných mutácií v HDGC a skúša našu hypotézu pomocou in silico a in vitro nástrojov. FoldX algoritmus bol použitý pre výpočet vplyvov jednotlivých mutácií v E-cadherin natívnym stave stability a analýza bola doplnená evolučnej konzervácie tým, že preosiať. Je zaujímavé, že pacienti HDGC nesúci embryonálny E-cadherin destabilizácii mutantov predstavovať mladší vek v čase stanovenia diagnózy alebo smrti, čo naznačuje, že strata v natívnom stave stability E-cadherinu účtov za fenotypu ochorenia. K objasneniu biologický význam E-cadherin destabilizácie HDGC sme skúmali skupinu novo identifikovaných HDGC asociovaných mutácií (E185V, S232C a L583R), z ktorých L583R sa predpokladá, že destabilizuje. Ukázali sme, že táto mutácia nie je funkčný in vitro, vykazuje kratší polčas a je schopný zrieť, v dôsledku predčasného proteazómu závislé degradácie, fenotypu sa vrátilo stabilizáciou s umelou mutáciu L583I (štrukturálne tolerovanej). Tu máme správu E-cadherin štrukturálnych modelov vhodných na určenie vplyvu väčšiny chybných mutácií s rakovinou spojené a ukážeme, že E-cadherin destabilizácie vedie k strate-of-funkcie in vitro a zvýšenú patogenitu in vivo.
Citácia: Simões-Correia J, J Figueiredo, Lopes R, Stricher F, Oliveira C, Serrano L, et al. (2012) E-cadherin destabilizácie Účty patogenitu missense mutácií v Dedičný difúzne rakoviny žalúdka. PLoS ONE 7 (3): e33783. doi: 10,1371 /journal.pone.0033783
Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japonsko
Prijaté: 9. novembra 2011; Prijaté: 17.februára 2012; Uverejnené: 21. marca 2012
Copyright: © 2012 Simões-Correia et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané
Financovanie :. Toto dielo bola podporená Fundação parašutista Ciencia e Tecnologia, Portugalsko (PTDC /SAU-OBD /64319/2006, PTDC /SAU-OBD /104017/2008, SFRH /BPD /48765/2008 častíc), EMBO (short-term Fellowship astfe 60- 2009) a poskytne EÚ Prospects (HEALTH-F4-2008-201648). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu
Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú
Úvod
E-cadherin je adhézia bunka-bunka glykoproteín zložený z piatich extracelulárnej opakuje cadherin typu, jednej transmembránovej oblasti a vysoko konzervatívny cytoplazmatickej chvost [1], [2]. E-cadherin je exprimovaný predovšetkým v bunkách epitelu a je hlavnou zložkou adhézny uzlov (AJ). Tieto uzly klastra, cez homophilic interakcií, skrz extracelulárnej domény E-cadherinu molekúl vápnika závislé na povrchu homotypická susedných buniek.
Role E-cadherinu vo vývoji nádorov je dobre popísaný, a jeho strata expresie je charakteristickým znakom v karcinómov [3]. Experimentálne dôkazy podporujú úlohu pre E-cadherin komplexu a to ako pri potláčaní invázie a metastáz tvorbu [4]. Strata E-cadherin expresie je často spojená s genetickými udalosti, ako sú spojovacie miesta a mutácie skrátených spôsobených inzerciou, delécií, a nezmyselných mutácií, okrem missense mutácie [5]. V ojedinelých difúzneho karcinómu žalúdka, zmeny v géne pre E-cadherinu (CDH1) sa nachádzajú prednostne vo exónov 7-9 [5], zatiaľ čo v lobulárna karcinómov prsníka, ktoré sú rozmiestnené pozdĺž génu, bez prednostného aktívneho bodu [6]. Missense mutácie sa nachádzajú v týchto dvoch typov rakoviny sporadické a tiež v synoviálnych sarkómov [7].
familiárna agregácie difúznych rakoviny žalúdka (GŘC) predstavuje 10% prípadov rakoviny žalúdka (GC), a až 1-3% sú dedičné [8]. Z týchto familiárny prípady, dedičná Difúzny karcinóm žalúdka (HDGC) je definovaná prísne kritériá, ktoré boli definované v medzinárodnom rakovina žalúdka Prepojenie Consortium (IGCLC) v roku 1999: (1) dve alebo viac zdokumentované prípady difúzneho karcinómu žalúdka v prvom /druhom stupni príbuzní, s aspoň jedným diagnostikovaná pred dosiahnutím veku 50; alebo (2), tri alebo viac prípadov doložených difúzneho karcinómu žalúdka v prvom /druhým príbuzným miery, nezávisle na veku. Skorý nástup Difúzne rakovina žalúdka (EODGC) je považovaný za izolovaný, keď je jedinec s diagnózou GŘC s menej ako 45 rokov veku. Zárodočnej CDH1 mutácie sa nachádzajú v 30% prípadov HDGC [9]. Združenie CDH1 mutácií a familiárnej rakovinu žalúdka bol prvýkrát popísaný Guilford et al V tejto práci, sme skúmali potenciál štruktúry založenej na in silico Collection of E-cadherin sekvenčných variantov a PDB E-cadherinu varianty spojené s HDGC alebo EODGC boli odobraté z literatúry, a somatické varianty boli zhromaždené z katalógu somatické mutácie v rakovine (kozmickej) databáz (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/~~HEAD=pobj kozmickej /). Tri nové E-cadherin sekvencie variantov, kde údajne našom laboratóriu pre funkčné analýzy: E185V, S232C a L583R. V poslednej dobe sa L583R bolo hlásené, s spojené funkčné údajov [22]. PDB E-cadherinu súvisiace boli identifikované pomocou automatického vyhľadávania sa švajčiarskou Model Repository (http://swissmodel.expasy.org). Sekvenčné zoradenie ľudský E-cadherin a každá zo sekvencií použitých pre rôzne modely bola vykonaná s M-káva [23], [24] (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/play?name=mcoffee ). Snímky boli pripravené s Pymol. Po analýze sekvencie a štruktúrny homológie, tri PDB boli vybrané na použitie ako modely :. Xenopus C-cadherinu ektodomény (PDB 1L3W), myš E-cadherinu prodoménu (PDB 1OP4) a myšou β-katenin interagujúce domény (PDB 1I7X) FoldX výpočty a SIFT analýza Použitie príkazu FoldX (http://foldx.crg.es/) Buildmodel Použili sme preosiať (http://sift.jcvi.org/~~HEAD=dobj, triedenie Intolerantná Od tolerantní) vyhodnotiť zachovanie jednotlivých aminokyselín substitúcie, ako bolo predtým. opísané [25], pomocou funkcie mrknutie GI :. 31073. Iba mutácie sa skóre pod 0,05 bola považovaná za netolerantné PROP (http://www.cbs.dtu.dk/services /prop /), [26] bol použitý pre vyhodnotenie, či mutácia by mohla mať vplyv na prodomény štiepenie. Bunková kultúra a transfekcia E-cadherin WT cDNA bola klonovaná v pIRES2-EGFP vektorom podľa vyrobiť inštrukcie (Clontech, Takara Bio) a mutácie E185V, S232C, L583R a L583I He-cadherinu bola vyvolaná lokálne cielenú mutagenézou, ako bolo opísané skôr [27]. Prázdny vektor (Mock) bol použitý ako kontrola CHO (vaječník čínskeho škrečka) (číslo ATCC: CCL-61), boli pestované v alfa-MEM médiu (Gibco, Invitrogen) doplnenom 10% fetálneho hovädzieho dobytka séra (FBS, Gibco, Invitrogen) a 1% penicilín-streptomycín (Gibco, Invitrogen). Bunky boli ojedinele hodnotené na mycoplasm kontaminácie imunofluorescencie s DAPI. Bunky boli transfekovány s 1 ug každého z vektorov kódujúcich rôzne formy E-cadherinu (WT, E185V, S232C, L583R a L583I) za použitia Lipofectamine 2000 (Invitrogen), podľa postupu výroby. Pre stabilné bunkové línie usadzovaniu, bunky sa selektovali podľa rezistencie voči antibiotikám na 5 ug /ml blasticidin (Gibco, Invitrogen). Všetky bunkové línie boli udržiavané vo vlhkom inkubátore s 5% CO 2 pri 37 ° C Funkčné testy prechodne transfekciou CHO (vaječník čínskeho škrečka) bunky (ATCC identifikačné číslo :. CCL -61) sa podrobí toku citometry, pomocou merania GFP fluorescencie, vyhodnotiť účinnosť transfekcia pred každým experimentom. Za pomalé agregácie testu jamky 96-jamkové doštičke boli potiahnuté 50 ul roztoku agaru (100 mg Bacto-Agar v 15 ml sterilného PBS). Bunky boli oddelené s trypsínom a suspenduje sa v kultivačnom médiu. Suspenzia 1 x 10 5 buniek /ml bol pripravený a 2 x 10 4 bunky boli nasadené na každej jamky. Doštička bola inkubovaná pri teplote 37 ° C vo vlhkej komore s 5% CO 2 po dobu 48 hodín. Agregácie bola hodnotená v inverznom mikroskopom (4 x zväčšené) a fotografované s digitálnym fotoaparátom. Bunkové lyzáty boli získané s katenin lyzačného pufru (1% Triton X-100, 1 % Nonidet P-40 v PBS), doplnenom kokteilom inhibítora proteázy (Roche) a inhibítora fosfatázy koktail (Sigma). Proteín kvantifikácia bola vykonaná pomocou modifikovaného testu Bradford (Bio-Rad). Pre každú vzorku 25 ug proteínu bolo naložené, oddelený v 7,5% SDS-PAGE a elektroblotovány na nitrocelulózové membránu (GE Healthcare Life Sciences). Membrány boli blokované 5% odtučneného sušeného mlieka a 0,5% Tween-20 v PBS. Imunoblotování bola vykonaná s protilátkami proti E-cadherinu (1: 1000, BD Biosciences), aktínu (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology) a α-tubulín (1: 10000, Sigma). Ovčej anti-myšou (GE Healthcare Life Sciences) alebo oslie anti-kozie (Santa Cruz Biotechnology) boli použité ako sekundárne protilátky, a následne detekcia ECL (GE Healthcare Life Sciences). Imunoblotu boli kvantifikované v Množstvo jednom software (Bio-Rad). Bunky boli pestované na splývajúce monovrstvu, samostatne stojace s Versene (Gibco, Invitrogen) a resuspendovaného v ľadom chladeným PBS s 0,05 mg /ml CaCl 2. Suspenzia 5 x 10 5 buniek bola centrifugována po dobu 5 minút pri 1500 otáčkach za minútu 4 ° C a premyté v PBS s 0,05 mg /ml CaCl 2 3% BSA. Bunky boli inkubované po dobu 60 minút s primárnou protilátkou proti E-cadherinu, HECD1 (Zymed Laboratories) v 1: 100 riedenie. Bunky boli dvakrát premyté a potom inkubované s anti-myšou biotinilated (Dako) v 1: 100 riedenie. Bunky boli dvakrát premyté a potom inkubované so streptavidín-PE Cy5 (BD Pharmingen) na 1:40 riedenie. Nakoniec boli bunky premyté, resuspendované v 500 ul PBS, a 50000 boli bunky analyzované na prietokovom cytometri (Coulter Epics XL-MCL). Dáta boli analyzované pomocou softwaru WinMDI. imunofluorescencie a mikroskopiu, bunky boli schovať na krycie sklíčka a ponechané rásť do približne 80% zhlukovania, pevné v ľadovom metanole po dobu 15 minút, premytá 2 krát s PBS a inkubované s primárnou protilátkou, zriedené v PBS 5% BSA po dobu 60 minút pri izbovej teplote. Primárne protilátky použité: myšou monoklonálne anti-E-cadherin (BD Biosciences); králičie anti-calnexin (Stressgen). Sekundárne protilátky použité: Alexa Fluór 488 anti-myšou (1: 500, Invitrogen); Alexa Fluór 594 anti-králičie (1: 500, Invitrogen). Krycie sklíčka boli namontované na sklíčka s použitím Vectashield s DAPI za jadrovú detekciu (Vector Laboratories). Snímanie obrazu bola vykonaná na Carl Zeiss Apotome Axiovert 200 m fluorescenčným mikroskopom s použitím 40 × cieľov. Snímky boli získané s Axiocam HRM kamery a spracované softvérom verzie Axiovison 4.8. pre inhibíciu syntézy proteínov, boli bunky ošetrené 25 uM cykloheximid po dobu 8 hodín a 16 hodín, a množstvo celkovej E-cadherin sa analyzuje WB, ako bolo popísané skôr. Pre test inhibícia proteazómu, bunky boli vrúbľovať do 6-jamkových doštičiek, ktoré sa pestujú na približne 80% zhlukovania, a inkubované počas 16 hodín s 10 uM MG132 (Calbiochem). Fragmenty buniek boli analyzované WB, ako bolo popísané skôr. 1. E-cadherin štrukturálne modely Nie sú k dispozícii len málo ľudský E-cadherin (He-CAD) štruktúry, a tie sa vzťahujú len malé porcie proteínu (tabuľka S1). Pomocou automatického vyhľadávania švajčiarskej úložisku modelu sme zistili, že PNR 1L3W poznámkami po celej dĺžke extracelulárnej domény Xenopus EP-cadherinu (EP-CAD), je vysoko homológnej k rovnakej doméne v ľudskom E-cadherinu. Analyzovali sme sekvenčné homológie porovnaním s použitím M-kávy, viacnásobné porovnanie sekvencií, ktorý kombinuje výstup z niekoľkých rôznych zarovnanie sekvencie balíčkov (PCMA, Poa, Mafft, svalov, T-káva, ClustalW, ProbCons, DialignTX) [23] [24 ]. Obrázok 1A ukazuje porovnanie dvoch sekvencií extracelulárnej domény. Červené tehlové regióny predstavujú dokonalú dohodu medzi použitých metódach, čo predstavuje veľmi podobné sekvencie. Ak chcete vytvoriť vzorovú štruktúru, sme odstránili regióny s žiadnu podobnosť (pozri obrázok 1A, hviezdy), a obmedzený model do regiónov s spoľahlivé vyrovnanie (čiernou šípkou, Obr 1A). Štruktúra Xenopus bol humanizáciu ako je popísané v sekcii Materiál a metódy a Obrázok 1B ukazuje štrukturálne zarovnanie He-CAD EC1-EC2 domén (z PNR 2O72) a EC1-EC2 domén z Xenopus odvodené štrukturálnej model. Tieto dve štruktúry sú takmer prekrývajú, čo naznačuje, že podobnosť medzi extracelulárnej domény ľudského E-cadherinu a Xenopus EP-cadherinu je nielen na úrovni sekvencie, ale aj na štrukturálnej úrovni. Model štruktúra ľudského E-CAD vykazuje kompatibilný energie s konštrukciou z Xenopus, s miernym poklesom voľnej energie (? G) získané pre daný model (? G reálnom = 559,99 kcal /mol a? G Model = 531.77 kcal /mol), čo naznačuje, že humanizácie nezavádza ďalšie strety. V poslednej dobe sa štruktúra myšou extracelulárnej domény bol prepustený (PDB 3Q2V, tabuľka S1), a my tiež použiť túto štruktúru ako model, ako spôsob, ako zdokonaliť výsledky získané s modelom Xenopus. sme založili ďalšie dva modely, ktoré pokrývajú prodomény (PDB 1OP4, z myší N-cadherinu) a β-katenin cytoplazmatickej doméne (PDB 1I7X, z myší E-cadherin), s použitím rovnakej metodológie. Dohromady tieto tri modely pokrývajú väčšinu proteínové štruktúry (Obrázok 1C): model prodomény zahŕňa pozície 28-117, extracelulárnej modely pozície 155-697 a β-katenin cytoplazmatickej doméne zahŕňa 782-838. Na úrovni blízko membrány domény, jedna štruktúra je uvedená poznámka, obsahujúce interagujúce plochu medzi E-cadherinu a P120 [28]. Táto štruktúra obsahuje malé, 18 aminokyselín dlhý peptid (pokrývajúca pozícií 756-773 na He-CAD), s veľmi nízkym obsahom štrukturálne faktory, ktoré znižujú spoľahlivosť energetickej výpočty, takže sme zlikvidovať túto štruktúru z analýzy. 2. in silico E-cadherinu mutácií sú nielen genetické príčina HDGC, ale oni sú tiež často nachádzajú v rôznych typov sporadické rakoviny. Analyzovali sme in silico Použitie štrukturálnych modelov popísaných vyššie, sme použili FoldX na generovanie každej z rakovinou spojené USVS a vyhodnotiť ich natívnom stave stability ,? G (zvyčajne označované ako celková energia pre jednoduchosť) [20]. Energetické Rozdiel medzi referenčnou WT a zodpovedajúce mutanty (ΔΔG =? G WT-? G Mut) bola vypočítaná na 22 HDGC /EODGC E-cadherinu USVS lokalizovaných na regióny zahrnuté do modelových štruktúr a výsledky sú uvedené v tabuľke 1. pri ΔΔG je negatívny, to predstavuje zisk v natívnom stave stability v mutantný formy; ak je pozitívny, to znamená, že mutant je menej stabilná, potom sa odkaz WT. Predchádzajúce štúdie na iných proteínov ukázali, že zmeny stability vypočítava FoldX algoritmom pod 0,8 kcal /mol, sú v rámci zmeny chyby softvéru, a sú teda považované za bezvýznamné [21]. V dôsledku toho sme len považované mutácie byť destabilizačné, keď vyvolávajú energetickej zmeny výšky 0,8 kcal /mol. Na obrázku 2A, mutácie nad režime sú destabilizujúce, zatiaľ čo tie dolné sú štrukturálne tolerované. Je jasné, že destabilizáciu mutácie sú spead pozdĺž proteínu, a to bez preferenčným doménou ovplyvnené. prodomény He-CAD sa odštiepi v priebehu zrenia, a ak to nie je vykonané, je narušená E-cadherin funkcie lepidlo [ ,,,0],29], [30]. Pre mutácie lokalizované v tejto oblasti, sme hodnotili vplyv na celkové energie s FoldX, zachovanie s preosiať a tiež hodnotí v prípade, že zásah do prodomény štiepneho miesta s PROP (podrobnosti v časti Materiály a metódy). Zistili sme, že obaja dedičné (G62V a T118R) a sporadické (P30T, G62D, H92Y, H121R a H123Y) mutácie lokalizované v E-cadherin prodomény sú konštrukčne tolerované, ako predpovedal FoldX (Tabuľka S3). Keď sme sa analyzovať vplyv na základe zachovanie pomocou preosiať, sme tiež zistili, že žiadna z mutácií bolo považované za škodlivé, pretože ich stupeň konzervácie je nízky (Tabuľka S3). Tieto výsledky ukazujú, že patogenita E-cadherinu USVS lokalizované v prodomény je pravdepodobné, že nie je závislý na destabilizáciu. Tiež sme zistili, žiadny vplyv na štiepenie propeptidu, ako predpovedal PROP (dáta nie sú uvedené). V dôsledku toho sa domnievame, že patogenita E-cadherinu mutáciami v tejto oblasti môže vyplývať z interferencie s dokovania proteínov podieľajúcich sa na spracovaní prodomény, nemožné predpovedať in silico Dedičná E -cadherin USVS pokrývajú celú dĺžku extracelulárnej domény, zatiaľ čo sporadické mutácie sú prevažne v EC2-EC3, ako je v súlade s aktívnou oblasti opísaným skôr v exónov 7-9 [5]. Z celkových 18 zárodočnej línie HDGC /EODGC mutácie lokalizované v tejto oblasti, sme zistili, že 10 má významný vplyv na štrukturálne proteín (Tabuľka 1). Približne polovica z sporadických mutácií sú tiež destabilizuje (tabuľka S3), nezávisle na EC domény, kde sú lokalizované, čo naznačuje, že v natívnom stave destabilizácia môžu byť spojené k podstatnej frakcie sporadických rakovín zahŕňajúcich stratu E-cadherinu bodovú mutácií. iba tri mutácie sú lokalizované v oblasti mapované podľa vzoru cytoplazmatickej väzbové β-katenin domény (P799R, V832M, S838G): prvé dva uvedené v nastavení HDGC /EODGC a druhý sporadickú, nájdených v karcinóm vaječníku [31]. U týchto mutácií sme analyzovali väzobné energiu medzi E-cadherinu a beta-kateninu a bolo zistené, že žiadny z nich výrazne mení väzbovú afinitu beta-kateninu, podľa FoldX predikcie. To je v súlade s in vitro Zhromaždili sme všetky predpovede a funkčné in vitro analyzovali sme k dispozícii pre zárodočnú HDGC /EODGC mutácie dopravcov a dát, aj keď informácie sú obmedzené, zistili sme, že najúplnejšie súbor údajov je vek nástupu alebo úmrtia spojené so GŘC. Keď sme box-plot Tieto dáta zoskupení "destabilizujúce" a "Non-destabilizujúci" mutácia nosičov, pozorujeme evidentné mladší vek nástupu choroby (diagnóza alebo smrť) pre prvú skupinu (obrázok 2D), čo naznačuje, že v natívnom stave destabilizácii účty pre skoršie vývoj GŘC. 3. Biologický význam E-cadherin destabilizácie Ak chcete určiť biologický význam E-cadherin destabilizácie, použili sme ako modelový systém tri novo zistené E-cadherin zárodočnej missense mutácie hlásené našom laboratóriu na funkčné charakteristika: E185V, S232C a L583R, neskôr v poslednej dobe opísané v literatúre [22]. in silico analýzy Aj n vitro Keď sme analyzovali E-cadherinu expresie v rôznych bunkových líniách, sme zistili, že celkové množstvo mutantního L583R je nižšia, že WT expresie za rovnakých podmienok, zatiaľ čo mutácie E185V a S232C, udržať normálnu hladinu (Obrázok 3B). Zaujímavé je, že skupina zodpovedajúca L583R je zachovaná v gélu, čo ukazuje, že L583R nie je schopný správne zrieť (nezrelé formy E-cadherinu je 130 kDa, zrelý, je 120 kDa) a prietokovou cytometriou výsledky ukazujú, že to je menej vyjadrený v plazmatická membrána (obrázok 3C). Keď proteín zrenia zlyhá, to často vyústi v endoplasmatickém retikule (ER) retenciu nezrelé proteínu. Pre testovanie, či L583R naozaj zachované ako nezrelé, sme analyzovali, ak je zachovaná v ER súčasným imonufluoreskujúca s ER markeru calnexin (obrázok 4A), a zistilo sa, že časť L583R signálu prekrýva s ER markeru, čo naznačuje, zvýšená retenčné ER. ak chcete pochopiť, ak by mohli byť detekované destabilizácie in vitro nestabilné alebo zle zloženého proteíny sú pevne upravené kontrolné proteín kvality mechanizmov ktoré chránia bunky tým, že nariadi novo syntetizovaných rozloženej proteíny pre degradáciu v proteazómu [34]. Vyriešiť, ak ide o prípad L583R, inhibuje sme aktivitu proteazómu s MG132 a pozoroval, že aj cez rôzne počiatočné úrovní E-cadherinu, expresia mutantný L583R úplne obnovený po liečbe (obr 4C), čo naznačuje, že sa jedná predčasne degradovaný proteasomem po syntéze, ako už bolo opísané pre iné juxtamembranar mutácií HDGC spojených s E-cadherin [35]. Je zaujímavé, že keď je degradácia proteazómu inhibuje, dochádza k hromadeniu nezrelých E-CAD vo všetkých bunkových línií, prejavujúce význam proteazómu v regulácii novo syntetizovanej E-CAD, nezávisle byť mutované, alebo nie. pre ďalšie overenie in silico E-cadherin zmeny (mutácie, delécie a metylácie) sú len uznané genetická príčina HDGC [36], [37], [38]. Väčšina mutácií uvedené v HDGC sú typu nezmysel, ale značný podiel (20%) zo zárodočnej mutácie vedú k jedinej aminokyselinových substitúcií, z ktorých patogenita je ťažké vyhodnotiť a je často nejasné [39], [40]. Najdôležitejšie informácie, pokiaľ ide o genetickú radu zárodočných missense mutácie nosičov je familiárna klinickej informácie (analýza segregácie, väčšinou), ale táto informácia je často málo s veľkosťou pôvodu všeobecne, že je príliš malý, aby umožnil segregačné štúdie a posúdenie patogenita zvyčajne pochádza z buniek na báze funkčných testoch in vitro
v roku 1998 [10] a od tej doby mnoho štúdií hlásené rôzne typy CDH1 mutácií v HDGC [11], [12], [13 ]. Zo všetkých hlásených CDH1
zárodočnej mutácie, 77,9% sú nezmysel, zostrihu miesto a posúvať mutácie (s očakávaným vyrábať predčasného ukončenia kodónov) a 22,1% sú missense mutácie [9]. Mutácie, ktoré generujú PTC sú zvyčajne škodlivý, pacienti sú považované za vysoko rizikové nosiče, a sa odporúča, aby sa profylaktické celkovú gastrektómii [14]. Patogenita chybných mutácií nie je jednoduché, a tieto zmeny sú zvyčajne označované ako Nekategorizované sekvenčné varianty (USVS) v dôsledku nedostatku prísnych kritérií na hodnotenie ich vplyvu. Niektoré parametre boli vzaté do úvahy pri klasifikácii E-cadherinu USVS v HDGC: 1) spoločné segregácie mutácie s GŘC (do rodokmeňov); 2) frekvencia mutácie v zdravej populácie kontrolných; 3) mutácie recidíva (v samostatných rodinných príslušníkov). Analýza oddeľovanie je často nemožné, s malým počtom postihnutých prípadov sú k dispozícii pre molekulárnu diagnostiku [15], a neprítomnosť klinických informácií je limitujúcim krokom na odvodenie patogénne význam týchto mutácií. Ak chcete toto obmedzenie obísť sme už skôr vyvinutú in vitro
funkčných testov pre vyhodnotenie funkčného významu E-cadherinu zárodočná chybných mutácií [16], [17]. Avšak, tieto štúdie zapliesť laboratórne konkrétne experimentálne podmienky, a síce bunkovej biológii testy, a sú časovo náročné pre použitie v rutine. in silico
predpovede sú spoľahlivé a rýchle analýzy, ktoré možno použiť na určenie vplyvu bodovými mutáciami, najmä ak je k dispozícii informácie o štruktúre [18], [19].
predpoveď na vyhodnotenie dopadu chybných mutácií E-cadherinu, ktoré boli uznané v dedičnej a sporadické rakoviny. Naša analýza bola založená na výpočte natívne zmeny stavu stability vyvolaných každý variant (ΔΔG =? G WT-? G Mut), získané pomocou algoritmu proteín konštrukcie FoldX [20], [21]. Zaujímavé je, že skupina pacientov nesúcich destabilizovať mutácie (ΔΔG > 0,8 kcal /mol) sa vyznačuje tým, mladšom veku v čase diagnózy alebo smrti GŘC, čo naznačuje, že strata E-cadherinu v natívnom stave stability prispieva k fenotypu ochorenia. Za použitie mobilné modelu sme analyzovali fenotyp E-cadherin destabilizácie, a zistili, že keď je mutácia indukuje znížila natívnom stave stability, E-cadherin sa predčasne degradovaný proteasomem, vykazuje kratší polčas, čo vedie k strate lepidlá funkcie. Celkovo naše výsledky naznačujú, že destabilizácia zodpovedá za patogenitu chybných mutácií E-cadherinu nájdené v HDGC.
materiáloch a metódach
sme vytvorili tri rôzne modely (prodomény, extracelulárnej a cytoplazmatické); Tri štruktúry boli humanizovanej substitúciou každého odlišného aminokyseliny. Výsledná štruktúra bola optimalizovaná použitím príkazu RepairPDB stroje a energie, kde analyzované s
stabilite alebo AnalyseComplex
príkazov. Mutácie ochorenie spojené s boli vytvorené s Buildmodel
velenia, každý mutácie opakovaného do piatich behov. Energie sú automatické vysielanie v FoldX a natívne zmena stavu stability, ΔΔG medzi WT a mutanty (ΔΔG =? G WT-? G Mut) je tiež generované v samostatnom súbore s zodpovedajúce normy odchýlky, a všetky energetické sankcie voči každej mutácii. Iba mutácie s ΔΔG > 0,8 kcal /mol boli považované za škodlivé
buniek
Western blotting
Fluorescenčné aktivované triedenie buniek (FACS)
imunofluorescenčné farbenie
Mobilné Ošetrenie
Výsledky
predikciu vplyvu rakoviny spojené s E-cadherin USVS
vplyvu všetkých mutácií s rakovinou spojené E-cadherin chybných ktoré lokalizáciu do oblastí, ktoré sú predmetom štrukturálnych modelov generované: 22 zárodočnej mutácie nájdené v nastavení HDGC a EODGC a 57 nájdených v sporadických rakovín. Zárodočnej E-cadherin USVS boli odobraté z literatúry, a niektoré z nich sú osobné komunikácie našom laboratóriu. Niektoré HDGC /EODGC mutácie nie sú možné modelovať, vzhľadom na nedostatok štrukturálnych informácií (napr tých lokalizovaných blízko membrány doméne E-cadherin), a neboli zahrnuté do tejto analýzy. Somatické mutácie boli odobraté z databázy Cancer Genome Project a obsahujú mutácie nájdené u karcinómu žalúdka a lobulárna prsníka (iba dva druhy rakoviny spojené s HDGC), ale aj ďalšie typy rakoviny, ako je synoviálneho sarkómu alebo karcinómu žlčových ciest (tabuľka S2 ).
.
Výsledky ukazujú, že dedičné mutácie V832M efektívne viaže beta-katenin a jej patogenita sa zdá byť závislá na neschopnosť E-cadherin /β-katenin komplexu viazať α -catenin [32], [33].
údaje HDGC /EODGC mutácií a analyzoval spoľahlivosť prediktorov použitých (tabuľka 1). klasifikovaný sme výsledky z predpovediam sú: skutočne pozitívny (TP), keď je mutácia predpovedať, ako škodlivé in silico
(buď FoldX alebo SIFT) a vykazujú stratu funkcie in vitro
; Pravda Negatívne správa (TN), keď je mutácia predpovedal tolerovanú in silico
a je funkčná in vitro
; Falošne pozitívny (FP), keď je mutácia predpovedať, ako škodlivé in silico
ale je funkčný in vitro
; a falošne negatívny (FN), keď je mutácia predpovedal tolerovanú in silico
ale vykazuje in vitro
stratu funkcie. TP a TN sú pozitívne výsledky, čo znamená, že prediktory sú schopné detekovať vplyv mutácií v funkcie; FP a FN reprezentovať ich mieru zlyhania. Zistili sme, že obe algoritmy sú schopné predpovedať funkčné vplyv až 70% zo zárodočnej línie HDGC /EODGC mutácií (11 z 16 mutácií), sa predpovede prekrývajúce polovicu mutácie (tabuľka 1, obrázok 2B).
popísané vyššie bola vykonaná za týchto troch nových mutácií a výsledky sú uvedené v tabuľke 1 (pod tmavou líniu). Mutácie E185V a S232C sú konštrukčne tolerovaná, s ΔΔG = 0,29 kcal /mol a -0,9 kcal /mol v danom poradí (tabuľka 1), ktorý je považovaný bezvýznamné, pokiaľ ide o vplyv na štruktúru. Mutácie S232C podporuje zníženie energie, stabilizovať proteín, a to z dôvodu straty vysokej energii serinového pochovaný skupina OH, ktorý nie je zapojený do H-väzby, a s ubytovaním v postrannom reťazci cysteínu. Mutácie L583R spôsobuje destabilizáciu, s ΔΔG = 2,72 kcal /mol, čo odráža dramatickú zmenu z hydrofóbnej k hydrofilnej aminokyselinu, ktorá má za následok arginínu Nie sú schopné vytvárať vodíkové väzby, pričom nepriaznivo pochovaný.
funkčné testy boli vykonané na vyššie uvedené HDGC /EODGC mutácií, a zistili sme, perfektný korelácia medzi funkčnosťou in vitro stroje a prítomnosti /absencii štrukturálneho vplyvu: E185V a S232C udržať funkcia lepidlo E-cadherinu, a sú schopné tvoriť tesné bunkových agregátov, zatiaľ čo L583R vykazuje jasné rozptýlené vzor, ktorý sa podobá Mock buniek (obrázok 3a), čo naznačuje, že E185V a S232C sú nepatogénne a L583R patogénne.
sme analyzovali stabilitu L583R v bunke, hodnotiť svoj obrat. zablokované sme syntézu bielkovín s cykloheximid a zistil, že L583R je skoro degradovaný, ako je hodnotená jeho zvyškovú expresie ihneď po 8 hodinách inhibícia syntézy bielkovín, na rozdiel od WT a ďalšie mutanty, ktoré sú stále vysoko exprimovaných v rovnakom stave (obrázok 4B) , čo naznačuje, že je nestabilný L583R v bunke. Prítomnosť nezrelých pásma WT alebo mutantných vzorky E-cadherinu (horné pásmo, Obrázok 4B), je vzhľadom k preťaženiu bielkovinu z prechodnej transfekcia.
predpovediach sme analyzovali fenotyp vrátenými destabilizoval mutáciu tým, že prinúti štrukturálne tolerovanej zmenu v rovnakej polohe mutantný formu E-cadherinu. Použitie FoldX sme vypočítali dopad každú možnú zmenu v polohe 583 a zistil, že zmena vyvolávajúce menej destabilizácii bol L583I (ΔΔG = 0,56 kcal /mol, ako bolo predpovedané pomocou myši model, Tabuľka S3). Zaujímavé je, že táto mutácia zachováva funkciu adhezívnej E-cadherinu, čo má za následok kompaktný bunkových agregátov (obrázok 4D), a nie je destabilizácii in vitro
, vykazujúci cicloheximide odolnosť porovnateľnú s WT tvaru (obrázok 4E). Tieto výsledky zdôrazňujú spoľahlivosť in silico
založené na predikcie E-cadherinu stabilitu a jasné združenie E-cadherin destabilizácii so stratou funkcie lepidla.
Diskusia
[15], [17], ktoré sú časovo náročné a technicky náročné, a preto sa široko použiteľné v rutinných molekulárnych laboratóriách. V dôsledku toho existuje potreba nových metód pre stanovenie patogenitu missense mutácie E-cadherinu spojených s HDGC [40].