Stomach Health > žalúdok zdravie >  > Gastric Cancer > žalúdočné Cancer

Ploche ONE: E-cadherin destabilizácie Účty patogenitu missense mutácií v Dedičný difúznu rakoviny žalúdka

Abstract

E-cadherin je zásadný pre udržanie architektúry tkaniva vďaka svojej úlohe v adhéziu bunka-bunka. mutácie E-cadherinu sú genetická príčina dedičného difúznou rakoviny žalúdka (HDGC) a chybných mutácií predstavujú klinický záťaž, vzhľadom na neistotu ich patogénne úlohu. In vitro a in vivo, väčšina mutácie viesť k strate-of-funkcie, aj keď príčinná faktor je neznámy pre väčšinu. Predpokladali sme, že destabilizácia mohol zodpovedať za patogenitu E-cadherinu chybných mutácií v HDGC a skúša našu hypotézu pomocou in silico a in vitro nástrojov. FoldX algoritmus bol použitý pre výpočet vplyvov jednotlivých mutácií v E-cadherin natívnym stave stability a analýza bola doplnená evolučnej konzervácie tým, že preosiať. Je zaujímavé, že pacienti HDGC nesúci embryonálny E-cadherin destabilizácii mutantov predstavovať mladší vek v čase stanovenia diagnózy alebo smrti, čo naznačuje, že strata v natívnom stave stability E-cadherinu účtov za fenotypu ochorenia. K objasneniu biologický význam E-cadherin destabilizácie HDGC sme skúmali skupinu novo identifikovaných HDGC asociovaných mutácií (E185V, S232C a L583R), z ktorých L583R sa predpokladá, že destabilizuje. Ukázali sme, že táto mutácia nie je funkčný in vitro, vykazuje kratší polčas a je schopný zrieť, v dôsledku predčasného proteazómu závislé degradácie, fenotypu sa vrátilo stabilizáciou s umelou mutáciu L583I (štrukturálne tolerovanej). Tu máme správu E-cadherin štrukturálnych modelov vhodných na určenie vplyvu väčšiny chybných mutácií s rakovinou spojené a ukážeme, že E-cadherin destabilizácie vedie k strate-of-funkcie in vitro a zvýšenú patogenitu in vivo.

Citácia: Simões-Correia J, J Figueiredo, Lopes R, Stricher F, Oliveira C, Serrano L, et al. (2012) E-cadherin destabilizácie Účty patogenitu missense mutácií v Dedičný difúzne rakoviny žalúdka. PLoS ONE 7 (3): e33783. doi: 10,1371 /journal.pone.0033783

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japonsko

Prijaté: 9. novembra 2011; Prijaté: 17.februára 2012; Uverejnené: 21. marca 2012

Copyright: © 2012 Simões-Correia et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bola podporená Fundação parašutista Ciencia e Tecnologia, Portugalsko (PTDC /SAU-OBD /64319/2006, PTDC /SAU-OBD /104017/2008, SFRH /BPD /48765/2008 častíc), EMBO (short-term Fellowship astfe 60- 2009) a poskytne EÚ Prospects (HEALTH-F4-2008-201648). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

E-cadherin je adhézia bunka-bunka glykoproteín zložený z piatich extracelulárnej opakuje cadherin typu, jednej transmembránovej oblasti a vysoko konzervatívny cytoplazmatickej chvost [1], [2]. E-cadherin je exprimovaný predovšetkým v bunkách epitelu a je hlavnou zložkou adhézny uzlov (AJ). Tieto uzly klastra, cez homophilic interakcií, skrz extracelulárnej domény E-cadherinu molekúl vápnika závislé na povrchu homotypická susedných buniek.

Role E-cadherinu vo vývoji nádorov je dobre popísaný, a jeho strata expresie je charakteristickým znakom v karcinómov [3]. Experimentálne dôkazy podporujú úlohu pre E-cadherin komplexu a to ako pri potláčaní invázie a metastáz tvorbu [4]. Strata E-cadherin expresie je často spojená s genetickými udalosti, ako sú spojovacie miesta a mutácie skrátených spôsobených inzerciou, delécií, a nezmyselných mutácií, okrem missense mutácie [5]. V ojedinelých difúzneho karcinómu žalúdka, zmeny v géne pre E-cadherinu (CDH1) sa nachádzajú prednostne vo exónov 7-9 [5], zatiaľ čo v lobulárna karcinómov prsníka, ktoré sú rozmiestnené pozdĺž génu, bez prednostného aktívneho bodu [6]. Missense mutácie sa nachádzajú v týchto dvoch typov rakoviny sporadické a tiež v synoviálnych sarkómov [7].

familiárna agregácie difúznych rakoviny žalúdka (GŘC) predstavuje 10% prípadov rakoviny žalúdka (GC), a až 1-3% sú dedičné [8]. Z týchto familiárny prípady, dedičná Difúzny karcinóm žalúdka (HDGC) je definovaná prísne kritériá, ktoré boli definované v medzinárodnom rakovina žalúdka Prepojenie Consortium (IGCLC) v roku 1999: (1) dve alebo viac zdokumentované prípady difúzneho karcinómu žalúdka v prvom /druhom stupni príbuzní, s aspoň jedným diagnostikovaná pred dosiahnutím veku 50; alebo (2), tri alebo viac prípadov doložených difúzneho karcinómu žalúdka v prvom /druhým príbuzným miery, nezávisle na veku. Skorý nástup Difúzne rakovina žalúdka (EODGC) je považovaný za izolovaný, keď je jedinec s diagnózou GŘC s menej ako 45 rokov veku. Zárodočnej CDH1 mutácie sa nachádzajú v 30% prípadov HDGC [9]. Združenie CDH1 mutácií a familiárnej rakovinu žalúdka bol prvýkrát popísaný Guilford et al
v roku 1998 [10] a od tej doby mnoho štúdií hlásené rôzne typy CDH1 mutácií v HDGC [11], [12], [13 ]. Zo všetkých hlásených CDH1
zárodočnej mutácie, 77,9% sú nezmysel, zostrihu miesto a posúvať mutácie (s očakávaným vyrábať predčasného ukončenia kodónov) a 22,1% sú missense mutácie [9]. Mutácie, ktoré generujú PTC sú zvyčajne škodlivý, pacienti sú považované za vysoko rizikové nosiče, a sa odporúča, aby sa profylaktické celkovú gastrektómii [14]. Patogenita chybných mutácií nie je jednoduché, a tieto zmeny sú zvyčajne označované ako Nekategorizované sekvenčné varianty (USVS) v dôsledku nedostatku prísnych kritérií na hodnotenie ich vplyvu. Niektoré parametre boli vzaté do úvahy pri klasifikácii E-cadherinu USVS v HDGC: 1) spoločné segregácie mutácie s GŘC (do rodokmeňov); 2) frekvencia mutácie v zdravej populácie kontrolných; 3) mutácie recidíva (v samostatných rodinných príslušníkov). Analýza oddeľovanie je často nemožné, s malým počtom postihnutých prípadov sú k dispozícii pre molekulárnu diagnostiku [15], a neprítomnosť klinických informácií je limitujúcim krokom na odvodenie patogénne význam týchto mutácií. Ak chcete toto obmedzenie obísť sme už skôr vyvinutú in vitro
funkčných testov pre vyhodnotenie funkčného významu E-cadherinu zárodočná chybných mutácií [16], [17]. Avšak, tieto štúdie zapliesť laboratórne konkrétne experimentálne podmienky, a síce bunkovej biológii testy, a sú časovo náročné pre použitie v rutine. in silico
predpovede sú spoľahlivé a rýchle analýzy, ktoré možno použiť na určenie vplyvu bodovými mutáciami, najmä ak je k dispozícii informácie o štruktúre [18], [19].

V tejto práci, sme skúmali potenciál štruktúry založenej na in silico
predpoveď na vyhodnotenie dopadu chybných mutácií E-cadherinu, ktoré boli uznané v dedičnej a sporadické rakoviny. Naša analýza bola založená na výpočte natívne zmeny stavu stability vyvolaných každý variant (ΔΔG =? G WT-? G Mut), získané pomocou algoritmu proteín konštrukcie FoldX [20], [21]. Zaujímavé je, že skupina pacientov nesúcich destabilizovať mutácie (ΔΔG > 0,8 kcal /mol) sa vyznačuje tým, mladšom veku v čase diagnózy alebo smrti GŘC, čo naznačuje, že strata E-cadherinu v natívnom stave stability prispieva k fenotypu ochorenia. Za použitie mobilné modelu sme analyzovali fenotyp E-cadherin destabilizácie, a zistili, že keď je mutácia indukuje znížila natívnom stave stability, E-cadherin sa predčasne degradovaný proteasomem, vykazuje kratší polčas, čo vedie k strate lepidlá funkcie. Celkovo naše výsledky naznačujú, že destabilizácia zodpovedá za patogenitu chybných mutácií E-cadherinu nájdené v HDGC.

materiáloch a metódach

Collection of E-cadherin sekvenčných variantov a PDB

E-cadherinu varianty spojené s HDGC alebo EODGC boli odobraté z literatúry, a somatické varianty boli zhromaždené z katalógu somatické mutácie v rakovine (kozmickej) databáz (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/~~HEAD=pobj kozmickej /). Tri nové E-cadherin sekvencie variantov, kde údajne našom laboratóriu pre funkčné analýzy: E185V, S232C a L583R. V poslednej dobe sa L583R bolo hlásené, s spojené funkčné údajov [22].

PDB E-cadherinu súvisiace boli identifikované pomocou automatického vyhľadávania sa švajčiarskou Model Repository (http://swissmodel.expasy.org). Sekvenčné zoradenie ľudský E-cadherin a každá zo sekvencií použitých pre rôzne modely bola vykonaná s M-káva [23], [24] (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/play?name=mcoffee ). Snímky boli pripravené s Pymol. Po analýze sekvencie a štruktúrny homológie, tri PDB boli vybrané na použitie ako modely :. Xenopus C-cadherinu ektodomény (PDB 1L3W), myš E-cadherinu prodoménu (PDB 1OP4) a myšou β-katenin interagujúce domény (PDB 1I7X)

FoldX výpočty a SIFT analýza

Použitie príkazu FoldX (http://foldx.crg.es/) Buildmodel
sme vytvorili tri rôzne modely (prodomény, extracelulárnej a cytoplazmatické); Tri štruktúry boli humanizovanej substitúciou každého odlišného aminokyseliny. Výsledná štruktúra bola optimalizovaná použitím príkazu RepairPDB stroje a energie, kde analyzované s
stabilite alebo AnalyseComplex
príkazov. Mutácie ochorenie spojené s boli vytvorené s Buildmodel
velenia, každý mutácie opakovaného do piatich behov. Energie sú automatické vysielanie v FoldX a natívne zmena stavu stability, ΔΔG medzi WT a mutanty (ΔΔG =? G WT-? G Mut) je tiež generované v samostatnom súbore s zodpovedajúce normy odchýlky, a všetky energetické sankcie voči každej mutácii. Iba mutácie s ΔΔG > 0,8 kcal /mol boli považované za škodlivé

Použili sme preosiať (http://sift.jcvi.org/~~HEAD=dobj, triedenie Intolerantná Od tolerantní) vyhodnotiť zachovanie jednotlivých aminokyselín substitúcie, ako bolo predtým. opísané [25], pomocou funkcie mrknutie GI :. 31073. Iba mutácie sa skóre pod 0,05 bola považovaná za netolerantné

PROP (http://www.cbs.dtu.dk/services /prop /), [26] bol použitý pre vyhodnotenie, či mutácia by mohla mať vplyv na prodomény štiepenie.

Bunková kultúra a transfekcia

E-cadherin WT cDNA bola klonovaná v pIRES2-EGFP vektorom podľa vyrobiť inštrukcie (Clontech, Takara Bio) a mutácie E185V, S232C, L583R a L583I He-cadherinu bola vyvolaná lokálne cielenú mutagenézou, ako bolo opísané skôr [27]. Prázdny vektor (Mock) bol použitý ako kontrola
buniek

CHO (vaječník čínskeho škrečka) (číslo ATCC: CCL-61), boli pestované v alfa-MEM médiu (Gibco, Invitrogen) doplnenom 10% fetálneho hovädzieho dobytka séra (FBS, Gibco, Invitrogen) a 1% penicilín-streptomycín (Gibco, Invitrogen). Bunky boli ojedinele hodnotené na mycoplasm kontaminácie imunofluorescencie s DAPI. Bunky boli transfekovány s 1 ug každého z vektorov kódujúcich rôzne formy E-cadherinu (WT, E185V, S232C, L583R a L583I) za použitia Lipofectamine 2000 (Invitrogen), podľa postupu výroby. Pre stabilné bunkové línie usadzovaniu, bunky sa selektovali podľa rezistencie voči antibiotikám na 5 ug /ml blasticidin (Gibco, Invitrogen). Všetky bunkové línie boli udržiavané vo vlhkom inkubátore s 5% CO 2 pri 37 ° C

Funkčné testy

prechodne transfekciou CHO (vaječník čínskeho škrečka) bunky (ATCC identifikačné číslo :. CCL -61) sa podrobí toku citometry, pomocou merania GFP fluorescencie, vyhodnotiť účinnosť transfekcia pred každým experimentom. Za pomalé agregácie testu jamky 96-jamkové doštičke boli potiahnuté 50 ul roztoku agaru (100 mg Bacto-Agar v 15 ml sterilného PBS). Bunky boli oddelené s trypsínom a suspenduje sa v kultivačnom médiu. Suspenzia 1 x 10 5 buniek /ml bol pripravený a 2 x 10 4 bunky boli nasadené na každej jamky. Doštička bola inkubovaná pri teplote 37 ° C vo vlhkej komore s 5% CO 2 po dobu 48 hodín. Agregácie bola hodnotená v inverznom mikroskopom (4 x zväčšené) a fotografované s digitálnym fotoaparátom.

Western blotting

Bunkové lyzáty boli získané s katenin lyzačného pufru (1% Triton X-100, 1 % Nonidet P-40 v PBS), doplnenom kokteilom inhibítora proteázy (Roche) a inhibítora fosfatázy koktail (Sigma). Proteín kvantifikácia bola vykonaná pomocou modifikovaného testu Bradford (Bio-Rad). Pre každú vzorku 25 ug proteínu bolo naložené, oddelený v 7,5% SDS-PAGE a elektroblotovány na nitrocelulózové membránu (GE Healthcare Life Sciences). Membrány boli blokované 5% odtučneného sušeného mlieka a 0,5% Tween-20 v PBS. Imunoblotování bola vykonaná s protilátkami proti E-cadherinu (1: 1000, BD Biosciences), aktínu (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology) a α-tubulín (1: 10000, Sigma). Ovčej anti-myšou (GE Healthcare Life Sciences) alebo oslie anti-kozie (Santa Cruz Biotechnology) boli použité ako sekundárne protilátky, a následne detekcia ECL (GE Healthcare Life Sciences). Imunoblotu boli kvantifikované v Množstvo jednom software (Bio-Rad).

Fluorescenčné aktivované triedenie buniek (FACS)

Bunky boli pestované na splývajúce monovrstvu, samostatne stojace s Versene (Gibco, Invitrogen) a resuspendovaného v ľadom chladeným PBS s 0,05 mg /ml CaCl 2. Suspenzia 5 x 10 5 buniek bola centrifugována po dobu 5 minút pri 1500 otáčkach za minútu 4 ° C a premyté v PBS s 0,05 mg /ml CaCl 2 3% BSA. Bunky boli inkubované po dobu 60 minút s primárnou protilátkou proti E-cadherinu, HECD1 (Zymed Laboratories) v 1: 100 riedenie. Bunky boli dvakrát premyté a potom inkubované s anti-myšou biotinilated (Dako) v 1: 100 riedenie. Bunky boli dvakrát premyté a potom inkubované so streptavidín-PE Cy5 (BD Pharmingen) na 1:40 riedenie. Nakoniec boli bunky premyté, resuspendované v 500 ul PBS, a 50000 boli bunky analyzované na prietokovom cytometri (Coulter Epics XL-MCL). Dáta boli analyzované pomocou softwaru WinMDI.

imunofluorescenčné farbenie

imunofluorescencie a mikroskopiu, bunky boli schovať na krycie sklíčka a ponechané rásť do približne 80% zhlukovania, pevné v ľadovom metanole po dobu 15 minút, premytá 2 krát s PBS a inkubované s primárnou protilátkou, zriedené v PBS 5% BSA po dobu 60 minút pri izbovej teplote. Primárne protilátky použité: myšou monoklonálne anti-E-cadherin (BD Biosciences); králičie anti-calnexin (Stressgen). Sekundárne protilátky použité: Alexa Fluór 488 anti-myšou (1: 500, Invitrogen); Alexa Fluór 594 anti-králičie (1: 500, Invitrogen). Krycie sklíčka boli namontované na sklíčka s použitím Vectashield s DAPI za jadrovú detekciu (Vector Laboratories). Snímanie obrazu bola vykonaná na Carl Zeiss Apotome Axiovert 200 m fluorescenčným mikroskopom s použitím 40 × cieľov. Snímky boli získané s Axiocam HRM kamery a spracované softvérom verzie Axiovison 4.8.

Mobilné Ošetrenie

pre inhibíciu syntézy proteínov, boli bunky ošetrené 25 uM cykloheximid po dobu 8 hodín a 16 hodín, a množstvo celkovej E-cadherin sa analyzuje WB, ako bolo popísané skôr. Pre test inhibícia proteazómu, bunky boli vrúbľovať do 6-jamkových doštičiek, ktoré sa pestujú na približne 80% zhlukovania, a inkubované počas 16 hodín s 10 uM MG132 (Calbiochem). Fragmenty buniek boli analyzované WB, ako bolo popísané skôr.

Výsledky

1. E-cadherin štrukturálne modely

Nie sú k dispozícii len málo ľudský E-cadherin (He-CAD) štruktúry, a tie sa vzťahujú len malé porcie proteínu (tabuľka S1). Pomocou automatického vyhľadávania švajčiarskej úložisku modelu sme zistili, že PNR 1L3W poznámkami po celej dĺžke extracelulárnej domény Xenopus EP-cadherinu (EP-CAD), je vysoko homológnej k rovnakej doméne v ľudskom E-cadherinu. Analyzovali sme sekvenčné homológie porovnaním s použitím M-kávy, viacnásobné porovnanie sekvencií, ktorý kombinuje výstup z niekoľkých rôznych zarovnanie sekvencie balíčkov (PCMA, Poa, Mafft, svalov, T-káva, ClustalW, ProbCons, DialignTX) [23] [24 ]. Obrázok 1A ukazuje porovnanie dvoch sekvencií extracelulárnej domény. Červené tehlové regióny predstavujú dokonalú dohodu medzi použitých metódach, čo predstavuje veľmi podobné sekvencie. Ak chcete vytvoriť vzorovú štruktúru, sme odstránili regióny s žiadnu podobnosť (pozri obrázok 1A, hviezdy), a obmedzený model do regiónov s spoľahlivé vyrovnanie (čiernou šípkou, Obr 1A). Štruktúra Xenopus bol humanizáciu ako je popísané v sekcii Materiál a metódy a Obrázok 1B ukazuje štrukturálne zarovnanie He-CAD EC1-EC2 domén (z PNR 2O72) a EC1-EC2 domén z Xenopus odvodené štrukturálnej model. Tieto dve štruktúry sú takmer prekrývajú, čo naznačuje, že podobnosť medzi extracelulárnej domény ľudského E-cadherinu a Xenopus EP-cadherinu je nielen na úrovni sekvencie, ale aj na štrukturálnej úrovni. Model štruktúra ľudského E-CAD vykazuje kompatibilný energie s konštrukciou z Xenopus, s miernym poklesom voľnej energie (? G) získané pre daný model (? G reálnom = 559,99 kcal /mol a? G Model = 531.77 kcal /mol), čo naznačuje, že humanizácie nezavádza ďalšie strety. V poslednej dobe sa štruktúra myšou extracelulárnej domény bol prepustený (PDB 3Q2V, tabuľka S1), a my tiež použiť túto štruktúru ako model, ako spôsob, ako zdokonaliť výsledky získané s modelom Xenopus.

sme založili ďalšie dva modely, ktoré pokrývajú prodomény (PDB 1OP4, z myší N-cadherinu) a β-katenin cytoplazmatickej doméne (PDB 1I7X, z myší E-cadherin), s použitím rovnakej metodológie. Dohromady tieto tri modely pokrývajú väčšinu proteínové štruktúry (Obrázok 1C): model prodomény zahŕňa pozície 28-117, extracelulárnej modely pozície 155-697 a β-katenin cytoplazmatickej doméne zahŕňa 782-838. Na úrovni blízko membrány domény, jedna štruktúra je uvedená poznámka, obsahujúce interagujúce plochu medzi E-cadherinu a P120 [28]. Táto štruktúra obsahuje malé, 18 aminokyselín dlhý peptid (pokrývajúca pozícií 756-773 na He-CAD), s veľmi nízkym obsahom štrukturálne faktory, ktoré znižujú spoľahlivosť energetickej výpočty, takže sme zlikvidovať túto štruktúru z analýzy.

2. in silico
predikciu vplyvu rakoviny spojené s E-cadherin USVS

E-cadherinu mutácií sú nielen genetické príčina HDGC, ale oni sú tiež často nachádzajú v rôznych typov sporadické rakoviny. Analyzovali sme in silico
vplyvu všetkých mutácií s rakovinou spojené E-cadherin chybných ktoré lokalizáciu do oblastí, ktoré sú predmetom štrukturálnych modelov generované: 22 zárodočnej mutácie nájdené v nastavení HDGC a EODGC a 57 nájdených v sporadických rakovín. Zárodočnej E-cadherin USVS boli odobraté z literatúry, a niektoré z nich sú osobné komunikácie našom laboratóriu. Niektoré HDGC /EODGC mutácie nie sú možné modelovať, vzhľadom na nedostatok štrukturálnych informácií (napr tých lokalizovaných blízko membrány doméne E-cadherin), a neboli zahrnuté do tejto analýzy. Somatické mutácie boli odobraté z databázy Cancer Genome Project a obsahujú mutácie nájdené u karcinómu žalúdka a lobulárna prsníka (iba dva druhy rakoviny spojené s HDGC), ale aj ďalšie typy rakoviny, ako je synoviálneho sarkómu alebo karcinómu žlčových ciest (tabuľka S2 ).

Použitie štrukturálnych modelov popísaných vyššie, sme použili FoldX na generovanie každej z rakovinou spojené USVS a vyhodnotiť ich natívnom stave stability ,? G (zvyčajne označované ako celková energia pre jednoduchosť) [20]. Energetické Rozdiel medzi referenčnou WT a zodpovedajúce mutanty (ΔΔG =? G WT-? G Mut) bola vypočítaná na 22 HDGC /EODGC E-cadherinu USVS lokalizovaných na regióny zahrnuté do modelových štruktúr a výsledky sú uvedené v tabuľke 1. pri ΔΔG je negatívny, to predstavuje zisk v natívnom stave stability v mutantný formy; ak je pozitívny, to znamená, že mutant je menej stabilná, potom sa odkaz WT. Predchádzajúce štúdie na iných proteínov ukázali, že zmeny stability vypočítava FoldX algoritmom pod 0,8 kcal /mol, sú v rámci zmeny chyby softvéru, a sú teda považované za bezvýznamné [21]. V dôsledku toho sme len považované mutácie byť destabilizačné, keď vyvolávajú energetickej zmeny výšky 0,8 kcal /mol. Na obrázku 2A, mutácie nad režime sú destabilizujúce, zatiaľ čo tie dolné sú štrukturálne tolerované. Je jasné, že destabilizáciu mutácie sú spead pozdĺž proteínu, a to bez preferenčným doménou ovplyvnené.

prodomény He-CAD sa odštiepi v priebehu zrenia, a ak to nie je vykonané, je narušená E-cadherin funkcie lepidlo [ ,,,0],29], [30]. Pre mutácie lokalizované v tejto oblasti, sme hodnotili vplyv na celkové energie s FoldX, zachovanie s preosiať a tiež hodnotí v prípade, že zásah do prodomény štiepneho miesta s PROP (podrobnosti v časti Materiály a metódy). Zistili sme, že obaja dedičné (G62V a T118R) a sporadické (P30T, G62D, H92Y, H121R a H123Y) mutácie lokalizované v E-cadherin prodomény sú konštrukčne tolerované, ako predpovedal FoldX (Tabuľka S3). Keď sme sa analyzovať vplyv na základe zachovanie pomocou preosiať, sme tiež zistili, že žiadna z mutácií bolo považované za škodlivé, pretože ich stupeň konzervácie je nízky (Tabuľka S3). Tieto výsledky ukazujú, že patogenita E-cadherinu USVS lokalizované v prodomény je pravdepodobné, že nie je závislý na destabilizáciu. Tiež sme zistili, žiadny vplyv na štiepenie propeptidu, ako predpovedal PROP (dáta nie sú uvedené). V dôsledku toho sa domnievame, že patogenita E-cadherinu mutáciami v tejto oblasti môže vyplývať z interferencie s dokovania proteínov podieľajúcich sa na spracovaní prodomény, nemožné predpovedať in silico
.

Dedičná E -cadherin USVS pokrývajú celú dĺžku extracelulárnej domény, zatiaľ čo sporadické mutácie sú prevažne v EC2-EC3, ako je v súlade s aktívnou oblasti opísaným skôr v exónov 7-9 [5]. Z celkových 18 zárodočnej línie HDGC /EODGC mutácie lokalizované v tejto oblasti, sme zistili, že 10 má významný vplyv na štrukturálne proteín (Tabuľka 1). Približne polovica z sporadických mutácií sú tiež destabilizuje (tabuľka S3), nezávisle na EC domény, kde sú lokalizované, čo naznačuje, že v natívnom stave destabilizácia môžu byť spojené k podstatnej frakcie sporadických rakovín zahŕňajúcich stratu E-cadherinu bodovú mutácií.

iba tri mutácie sú lokalizované v oblasti mapované podľa vzoru cytoplazmatickej väzbové β-katenin domény (P799R, V832M, S838G): prvé dva uvedené v nastavení HDGC /EODGC a druhý sporadickú, nájdených v karcinóm vaječníku [31]. U týchto mutácií sme analyzovali väzobné energiu medzi E-cadherinu a beta-kateninu a bolo zistené, že žiadny z nich výrazne mení väzbovú afinitu beta-kateninu, podľa FoldX predikcie. To je v súlade s in vitro
Výsledky ukazujú, že dedičné mutácie V832M efektívne viaže beta-katenin a jej patogenita sa zdá byť závislá na neschopnosť E-cadherin /β-katenin komplexu viazať α -catenin [32], [33].

Zhromaždili sme všetky predpovede a funkčné in vitro
údaje HDGC /EODGC mutácií a analyzoval spoľahlivosť prediktorov použitých (tabuľka 1). klasifikovaný sme výsledky z predpovediam sú: skutočne pozitívny (TP), keď je mutácia predpovedať, ako škodlivé in silico
(buď FoldX alebo SIFT) a vykazujú stratu funkcie in vitro
; Pravda Negatívne správa (TN), keď je mutácia predpovedal tolerovanú in silico
a je funkčná in vitro
; Falošne pozitívny (FP), keď je mutácia predpovedať, ako škodlivé in silico
ale je funkčný in vitro
; a falošne negatívny (FN), keď je mutácia predpovedal tolerovanú in silico
ale vykazuje in vitro
stratu funkcie. TP a TN sú pozitívne výsledky, čo znamená, že prediktory sú schopné detekovať vplyv mutácií v funkcie; FP a FN reprezentovať ich mieru zlyhania. Zistili sme, že obe algoritmy sú schopné predpovedať funkčné vplyv až 70% zo zárodočnej línie HDGC /EODGC mutácií (11 z 16 mutácií), sa predpovede prekrývajúce polovicu mutácie (tabuľka 1, obrázok 2B).

analyzovali sme k dispozícii pre zárodočnú HDGC /EODGC mutácie dopravcov a dát, aj keď informácie sú obmedzené, zistili sme, že najúplnejšie súbor údajov je vek nástupu alebo úmrtia spojené so GŘC. Keď sme box-plot Tieto dáta zoskupení "destabilizujúce" a "Non-destabilizujúci" mutácia nosičov, pozorujeme evidentné mladší vek nástupu choroby (diagnóza alebo smrť) pre prvú skupinu (obrázok 2D), čo naznačuje, že v natívnom stave destabilizácii účty pre skoršie vývoj GŘC.

3. Biologický význam E-cadherin destabilizácie

Ak chcete určiť biologický význam E-cadherin destabilizácie, použili sme ako modelový systém tri novo zistené E-cadherin zárodočnej missense mutácie hlásené našom laboratóriu na funkčné charakteristika: E185V, S232C a L583R, neskôr v poslednej dobe opísané v literatúre [22]. in silico analýzy
popísané vyššie bola vykonaná za týchto troch nových mutácií a výsledky sú uvedené v tabuľke 1 (pod tmavou líniu). Mutácie E185V a S232C sú konštrukčne tolerovaná, s ΔΔG = 0,29 kcal /mol a -0,9 kcal /mol v danom poradí (tabuľka 1), ktorý je považovaný bezvýznamné, pokiaľ ide o vplyv na štruktúru. Mutácie S232C podporuje zníženie energie, stabilizovať proteín, a to z dôvodu straty vysokej energii serinového pochovaný skupina OH, ktorý nie je zapojený do H-väzby, a s ubytovaním v postrannom reťazci cysteínu. Mutácie L583R spôsobuje destabilizáciu, s ΔΔG = 2,72 kcal /mol, čo odráža dramatickú zmenu z hydrofóbnej k hydrofilnej aminokyselinu, ktorá má za následok arginínu Nie sú schopné vytvárať vodíkové väzby, pričom nepriaznivo pochovaný.

Aj n vitro
funkčné testy boli vykonané na vyššie uvedené HDGC /EODGC mutácií, a zistili sme, perfektný korelácia medzi funkčnosťou in vitro stroje a prítomnosti /absencii štrukturálneho vplyvu: E185V a S232C udržať funkcia lepidlo E-cadherinu, a sú schopné tvoriť tesné bunkových agregátov, zatiaľ čo L583R vykazuje jasné rozptýlené vzor, ​​ktorý sa podobá Mock buniek (obrázok 3a), čo naznačuje, že E185V a S232C sú nepatogénne a L583R patogénne.

Keď sme analyzovali E-cadherinu expresie v rôznych bunkových líniách, sme zistili, že celkové množstvo mutantního L583R je nižšia, že WT expresie za rovnakých podmienok, zatiaľ čo mutácie E185V a S232C, udržať normálnu hladinu (Obrázok 3B). Zaujímavé je, že skupina zodpovedajúca L583R je zachovaná v gélu, čo ukazuje, že L583R nie je schopný správne zrieť (nezrelé formy E-cadherinu je 130 kDa, zrelý, je 120 kDa) a prietokovou cytometriou výsledky ukazujú, že to je menej vyjadrený v plazmatická membrána (obrázok 3C).

Keď proteín zrenia zlyhá, to často vyústi v endoplasmatickém retikule (ER) retenciu nezrelé proteínu. Pre testovanie, či L583R naozaj zachované ako nezrelé, sme analyzovali, ak je zachovaná v ER súčasným imonufluoreskujúca s ER markeru calnexin (obrázok 4A), a zistilo sa, že časť L583R signálu prekrýva s ER markeru, čo naznačuje, zvýšená retenčné ER.

ak chcete pochopiť, ak by mohli byť detekované destabilizácie in vitro
sme analyzovali stabilitu L583R v bunke, hodnotiť svoj obrat. zablokované sme syntézu bielkovín s cykloheximid a zistil, že L583R je skoro degradovaný, ako je hodnotená jeho zvyškovú expresie ihneď po 8 hodinách inhibícia syntézy bielkovín, na rozdiel od WT a ďalšie mutanty, ktoré sú stále vysoko exprimovaných v rovnakom stave (obrázok 4B) , čo naznačuje, že je nestabilný L583R v bunke. Prítomnosť nezrelých pásma WT alebo mutantných vzorky E-cadherinu (horné pásmo, Obrázok 4B), je vzhľadom k preťaženiu bielkovinu z prechodnej transfekcia.

nestabilné alebo zle zloženého proteíny sú pevne upravené kontrolné proteín kvality mechanizmov ktoré chránia bunky tým, že nariadi novo syntetizovaných rozloženej proteíny pre degradáciu v proteazómu [34]. Vyriešiť, ak ide o prípad L583R, inhibuje sme aktivitu proteazómu s MG132 a pozoroval, že aj cez rôzne počiatočné úrovní E-cadherinu, expresia mutantný L583R úplne obnovený po liečbe (obr 4C), čo naznačuje, že sa jedná predčasne degradovaný proteasomem po syntéze, ako už bolo opísané pre iné juxtamembranar mutácií HDGC spojených s E-cadherin [35]. Je zaujímavé, že keď je degradácia proteazómu inhibuje, dochádza k hromadeniu nezrelých E-CAD vo všetkých bunkových línií, prejavujúce význam proteazómu v regulácii novo syntetizovanej E-CAD, nezávisle byť mutované, alebo nie.

pre ďalšie overenie in silico
predpovediach sme analyzovali fenotyp vrátenými destabilizoval mutáciu tým, že prinúti štrukturálne tolerovanej zmenu v rovnakej polohe mutantný formu E-cadherinu. Použitie FoldX sme vypočítali dopad každú možnú zmenu v polohe 583 a zistil, že zmena vyvolávajúce menej destabilizácii bol L583I (ΔΔG = 0,56 kcal /mol, ako bolo predpovedané pomocou myši model, Tabuľka S3). Zaujímavé je, že táto mutácia zachováva funkciu adhezívnej E-cadherinu, čo má za následok kompaktný bunkových agregátov (obrázok 4D), a nie je destabilizácii in vitro
, vykazujúci cicloheximide odolnosť porovnateľnú s WT tvaru (obrázok 4E). Tieto výsledky zdôrazňujú spoľahlivosť in silico
založené na predikcie E-cadherinu stabilitu a jasné združenie E-cadherin destabilizácii so stratou funkcie lepidla.

Diskusia

E-cadherin zmeny (mutácie, delécie a metylácie) sú len uznané genetická príčina HDGC [36], [37], [38]. Väčšina mutácií uvedené v HDGC sú typu nezmysel, ale značný podiel (20%) zo zárodočnej mutácie vedú k jedinej aminokyselinových substitúcií, z ktorých patogenita je ťažké vyhodnotiť a je často nejasné [39], [40]. Najdôležitejšie informácie, pokiaľ ide o genetickú radu zárodočných missense mutácie nosičov je familiárna klinickej informácie (analýza segregácie, väčšinou), ale táto informácia je často málo s veľkosťou pôvodu všeobecne, že je príliš malý, aby umožnil segregačné štúdie a posúdenie patogenita zvyčajne pochádza z buniek na báze funkčných testoch in vitro
[15], [17], ktoré sú časovo náročné a technicky náročné, a preto sa široko použiteľné v rutinných molekulárnych laboratóriách. V dôsledku toho existuje potreba nových metód pre stanovenie patogenitu missense mutácie E-cadherinu spojených s HDGC [40].

Other Languages