Ploche ONE: microRNA Let-7f inhibuje invázie nádoru a metastázy zacielením MYH9 v žalúdku človeka Cancer

Abstraktné

Background

mikroRNA (miRNA) sú dôležitými regulátormi, ktoré hrajú kľúčovú úlohu pri vzniku nádorov a progresie nádoru. Predchádzajúca správa ukázala, že let-7 rodinní príslušníci môžu pôsobiť ako nádorové supresormi v mnohých druhov rakoviny. Prostredníctvom miRNA poľa, sme zistili, že nech-7F sa downregulated vo vysoko metastatických možných žalúdka nádorových bunkových línií GC9811-P a SGC7901-M, v porovnaní s ich rodičovských bunkových línií, GC9811 a SGC7901-NM; Avšak, mechanizmus nebol jasný. V tejto štúdii sme skúmať, či nechať-7F pôsobí ako nádorový supresor, aby inhibujú inváziu a metastázy v žalúdočných rakovín.

Metodika /Základné

Real-time PCR vykazovali zníženej hladiny Let-7f expresia u metastázujúcej rakoviny žalúdka tkanív a bunkových línií, ktoré sú potenciálne vysoko metastatické. Invázia buniek a migrácie boli významne narušená GC9811-P a bunkových línií SGC7901-M po transfekciu s Let-7F-napodobňuje. Nahé myši s štepov modelmi rakoviny žalúdka potvrdili, že nechal-7f môže inhibovať žalúdočné nádorových metastáz in vivo po transfekciu zo strany lentivirus pGCsil-GFP rokov-7f. Luciferázové reportéri testy preukázali, že let-7F sa priamo viaže na 3 'UTR MYH9, ktorý kóduje myosin IIA, a real-time PCR a westernovým prenosom ďalej ukázal, že nech-7F downregulated expresie myozínových IIA na mRNA a proteínové úrovni .

Závery /Význam

Naša štúdia preukázala, že nadmerná expresia rokov-7f u karcinómu žalúdka môže inhibovať inváziu a migráciu buniek karcinómu žalúdka prostredníctvom priamo zameraná na metastázy tumorov asociované génové MYH9. Tieto údaje naznačujú, že let-7F môže byť nová terapeutická kandidátom na rakovinu žalúdka, s ohľadom na jej schopnosť redukovať invázie buniek a metastáz

Citácia :. Liang S, L on, Zhao X, Y Miao, Gu Y, Guo C, et al. (2011) microRNA Let-7F inhibuje invázie tumoru a metastáz zacielením MYH9 v žalúdku ľudskej rakoviny. PLoS ONE 6 (4): e18409. doi: 10,1371 /journal.pone.0018409

Editor: Donald Gullberg, University of Bergen, Nórsko

prijatá: 27.septembra 2010; Prijaté: 07.03.2011; Uverejnené: 18.apríla 2011

Copyright: © 2011 Liang et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Táto štúdia bol podporený národná prírodná Science Foundation Číny (No. 30801330, 30871143, No. No. 81030044)) a Národná Basic programu výskumu Číny (č 2010CB529300, č 2010CB529306). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

rakovina žalúdka (GC) je najčastejšou gastrointestinálne zhubné bujnenie vo východnej Ázii, východnej Európe, a časti strednej a Južnej Ameriky, a je druhou najčastejšou príčinou úmrtí súvisiacich s rakovinou [1]. Rozšírené metastázy bol hlavný dôvod pre neutešenej výsledok pacientov GC. Metastáza je komplexný, viacstupňový proces, pri ktorom rakovinové bunky migrujú z primárneho nádoru na väčšiu vzdialenosť [2]. Proces začína, keď primárne nádorové bunky napadnúť susedné tkanivá, nasledovaný bunky vstupujú do krvného riečišťa (intravasation), translokační prostredníctvom ciev, vystupujúce z krvných ciev (extravazácia) do okolitého tkaniva parenchýmu, iniciačný mikrometastáz a nakoniec proliferujúce tvoriť makroskopické sekundárne nádory [3]. Jedným z rozhodujúcich regulátorov, ktoré zapojili do tohto procesu je microRNA (miRNA) [4].

mikroRNA (miRNA) sú triedou endogénnych aj malých nekódovacích regulačných RNA, ktoré regulujú gény v post- transkripčné úrovni [5]. Zrelých miRNA môže byť transkribovaných RNA polymerázou II, a sú generované zo sekvenčného spracovania primárnych transkriptov miRNA podľa Drosha a Dicer; ktoré potom slúžia ako posttranskripční regulátory génovej expresie prostredníctvom komplementárneho párovania báz na mRNA [6]. Mnoho správy ukazujú, že miRNA hrajú kľúčové úlohy v rôznych biologických procesov, vrátane diferenciácie buniek, proliferácie, apoptózy, odolnosť proti stresu, metabolizmu tukov, vzniku nádorov a nádorových metastáz [7], [8], [9].

let-7 rodina je konzervatívna rodina miRNA. Let-7 bol pôvodne pozorovaný u hlísty Caenorhabditis elegans [10], a štrnásť členov bolo zistené, že k dnešnému dňu [11]. V poslednej dobe bolo zistené, že hladiny expresie mnohých rokov-7-členov rodiny, ktoré majú byť znížené v rôznych druhov rakoviny. Napríklad, povedzme-7 je downregulated u rakoviny pľúc, melanómu a hlavy a krku z dlaždicových karcinómu, zatiaľ čo zvýšená expresia rokov-7 môže inhibovať rast rakovinových buniek [12], [13], [14], [15], [16 ], [17], [18]. Niekoľko onkogény, ako je napríklad RAS, MYC a HMGA2, sú priamymi cieľmi rokov-7 [19] [20] [21]. Let-7f je jeden člen rodiny let-7. Predchádzajúce štúdie ukázali, že let-7F je up-regulovaný v primárneho karcinómu prsníka a podporuje angiogenézu [22]; zníženie expresie v PAH [23] bol spôsobený tým, chronickej hypoxia alebo monocrotaline Potkan, a hladina bola znížená v plazme vačkoch NSCLC pacientov [24]. Okrem toho, nech-7F môže mať vplyv na bunkovú proliferáciu, a to zameraním kalikreín súvisiace peptidázy (KLKs), rodinu serínových proteáz, ktoré bolo preukázané, že ich poškodeniu v niektorých nádorových ochorení, vrátane rakoviny vaječníkov [25].

Naše lab už skôr identifikovali skupinu odlišne exprimovaných miRNA medzi GC9811 a GC9811 bunkami-P prostredníctvom high-profil mikroRNA čipu analýz, ktoré obsahujú let-7f [26]. Počas ďalšieho charakterizáciu Let-7f v rôznych nádorových bunkových línií, zistili sme, že nechať-7F funguje ako metastáz enie. Posilnená expresie rokov-7f môže potlačiť GC invázie buniek a migrácie in vitro a in vivo. Analýzou bioinformatiky, sme zistili, že MYH9, ktorý kóduje myosin IIA ťažký reťazec sa podieľajú na podpore migrácie alebo invázie nádorových buniek, ako domnelého nechať-7f cieľ. Následné experimenty potvrdili, že nechal-7f môžu znižuje expresiu myosin IIA expresiu zacielením 3 'UTR MYH9, ktorý poskytuje možný cieľ pre liečbu GC.

materiáloch a metódach

kolekcia Tissue

Primárne žalúdočné nádorovom tkanive, priľahlé non-nádorového tkaniva žalúdočné a vzdialených metastatických žalúdočné tkaniva boli získané od pacientov, ktorí podstúpili chirurgický zákrok na Xijing nemocnici choroby zažívacieho ústrojenstva v Xi'an, Čína. Všetky vzorky boli klinicky a patologicky dokázané, že sú správne označené. Pacienti, ktoré ponúkajú vzorky pre štúdium podpísaný informovaný súhlas formulárov.

Bunková kultúra

Rakovina bunkové línie ľudských žalúdočných GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, SGC7901-M boli konzervované v našej vlastnej laboratóriu a boli kultivované v RPMI 1640 (HyClone), doplnenom 10% fetálnym hovädzím. (FBS, Gibco), 100 jednotiek /ml penicilínu a 0,1 mg /ml streptomycínu pri 37 ° C vo zvlhčenom inkubátore s 5% oxidu uhličitého

extrakcie RNA a PCR v reálnom čase

QRT-PCR bola vykonaná na stanovenie hladiny expresie potenciálnych rokov-7F cieľových génov. Celková RNA bola extrahovaná z tkanív alebo kultivovaných buniek za použitia reakčného činidla TRIzolu (Invitrogen Life Technologies). Komplementárna DNA (cDNA), bol vytvorený s použitím TaqMan Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Real-time PCR analýzy boli vykonané za použitia metódy TaqMan Micro RNA-Assay (Applied Biosystems). Primer prenájmu-7f bol zakúpený od firmy Ambion (MI0000437). Základ MYH9 sekvencia bola navrhnutá s použitím Primer Express Software (verzia 1.5). Primer-MYH9 sekvencie: (Forward) 5'AGAGCTCACGTGCCTCAACG3 '(reverzný) 5'TGACCACACAGAACAGGCCTG3'.All protokoly boli vykonané v súlade s pokynmi výrobcu. Hladina expresie rokov-7f je normalizované na 5S (Forward: 5'GATTGAATCGAGCACCAGTTAC3 ';

Reverz: 5'GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC3 "). Hladina expresie bola MYH9 normalizované to18S (Forward: 5'CGGCTACCACATCCAAGGAA3 ';

Reverzný: 5'GCTGGAATATCCGCGGCT3') PCR a zber dát boli vykonané na iCycler (Bio-Rad) .. Každá vzorka bol spustený v trojitom prevedení

vektorové konštrukty a lentivirus Production

pri-let-7f sekvencia bola postavená takto :. (Vpred) HSA-let-7F-1-Xho IF GGGCCCGCTCTAGACTCGAGATATTTGCATGTCGCTATGTG (Reverse) HSA-let-7F-1- BamH IR CGCGGCCGCCTAATGGATCCAAAAAAGGCACAGTCGAGGCTGATC. Sekvencia bola amplifikovaná a klonovanie do pGCsil-GFP vektora (génoch) pre generovanie pGCsil-GFP rokov-7F. Negatívna kontrola bola PGC FU-RNAi-NC-LV. Vírus balenie bolo vykonané v HEK 293T buniek po ko-transfekciu 20 ug pGCsil-GFP-rokov-7f vektorom s 15 ug plazmidu obale pHelper 1.0 Vektor a 10 ug plazmidu obálky pHelper 2,0 vektor s použitím Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Vírusy boli zozbierané 48 hodín po transfekciu a vírusové titre boli stanovené.

oligonukleotidy konštrukcia

Let-7f napodobňuje, dajte-7f inhibítor a negatívne kontrolné siRNA oligonukleotidov boli chemosynthesized (Shanghai GenePhama Co., ltd). Oligonukleotidy použité v týchto štúdiách boli už-rokov-7f napodobňuje: 5'UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU3'and 5'CUAUACAAUCUACCUCAUU3 ';

Napodobňuje negatívna kontrola: 5'UUCUCCGAACGUGUCACGUT3'and5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3 ", má-let-7F inhibítor: 5'AACUAUACAAUCUACUACCUCA3 ". MircoRNA inhibítor negatívna kontrola: 5'CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3 '

transfekciu buniek

Bunky boli kultivované na 80% až 90% zhlukovania po vrúbľovať do 6-jamkových doštičiek a boli transfekovány Lipofectamine 2000 (Invitrogen. , Carlsbad, CA) podľa inštrukcií výrobcu. Pre prechodnú transfekciu sa bunky v každej jamke 6-jamkové doštičky boli transfekovány s inhibítorom 12,5 ul miRNA alebo 7,5 ul miRNA mimických oligonukleotidov. Po 48 hodinách od transfekcia boli bunky zozbierané pre ďalšie experimenty. Pre stabilne transfekciou buniek, bunky boli transfekovány lentivirus na 30% až 50% zhlukovania. Cieľové bunky (1 x 10 ^{4), vrátane GC 9811-P a SGC7901-M bunky, boli infikované s 1 x 10 6 rekombinantnej lentivirus prevádzajúcej jednotky v prítomnosti 6 ug /ml polybrenu (génoch) .}

Invasion test

invazívnej schopnosť buniek bola testovaná pomocou Transwells (8-um veľkosť pórov, Corning Costar Corp.). Tieto Transwells boli umiestnené do 24-jamkových doštičiek. Po prvé, sa pridá 0,1 ml Matrigelu (50 ug /ml, BD Biosciences) na povrchu dosky a inkubované po dobu 2 hodín, a potom bol odstránený supernatant. Čerstvo trypsinizovány a premýva bunky (GC9811, GC9811-p, SGC7901-NM, SGC7901-M) boli suspendované v RPMI 1640 obsahujúcom 1% fetálne hovädzie sérum. Potom bolo pridané 100 ul suspenzie buniek (1 x 10 ^{5 buniek) do hornej komory každej vložky, ktorá bola potiahnutá Matrigel. Ďalšie, 450 ul RPMI 1640 obsahujúcim 10% fetálne hovädzie sérum bolo pridané do dolnej komory, a bunky sa nechajú napadnúť po dobu 24 h, 48 h pri 37 ° C v 5% CO _{2 vlhké s inkubátora. Po inkubácii boli bunky fixované 95% absolútneho alkoholu a zafarbené kryštálovou violeťou. Bunky na hornom povrchu filtra boli odstránené s bavlnenou handričkou a bunky, ktoré napadli do spodného povrchu filtra boli počítané a zobrazený pod inverzným mikroskopom (Olympus Corp Tokyo, Japonsko) pri 200 x zväčšení viac ako desiatich náhodne pole v každej jamke. Každý experiment bol vykonaný v troch opakovaniach.}}

Migrácia buniek

Schopnosť GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, a SGC7901-M buniek migrovať bol detekovaný s použitím Transwells [8-um pórov veľkosť, Corning Costar Corp.]. Tieto Transwells boli umiestnené do 24-jamkových doštičiek. Čerstvo trypsinizovány a premyté bunky boli suspendované v RPMI 1640 obsahujúcom 1% fetálne hovädzie sérum. 5 x 10 ^{4 buniek /jamku bolo umiestnených do hornej komory každej vložky (BD Biosciences, NJ), s non-potiahnuté membrány. 450 ul RPMI 1640 obsahujúcim 10% fetálne hovädzie sérum bolo pridané do spodných komôr. Po inkubácii po dobu 24 h, 48 h pri 37 ° C v 5% CO a _{2 zvlhčenom inkubátore boli bunky fixované 95% absolútneho alkoholu a zafarbené kryštálovou violeťou. Bunky vo vnútornej komore boli odstránené bavlneným tampónom a bunky prichytené na dolnú stranu membrány boli počítané a zobrazený pod inverzným mikroskopom (Olympus Corp Tokyo, Japonsko) pri zväčšení 200 x viac ako desať náhodných polí v každej jamke , Každý experiment bol vykonaný v troch opakovaniach.}}

in vivo teste metastáz

Pre metastázy testoch in vivo, sa stabilný bunkové línie GC9811-P a SGC7901-M boli zozbierané z fľašiach pre tkanivové kultúry po transfekciu lentivirus pGCsil-GFP rokov-7f a ovládanie pGCsil-GFP s použitím trypsínu a trikrát premyté PBS. Potom 2 x 10 ^{6 bunky boli suspendované v 0,2 ml bezsérového RPMI 1640 pre každú myš (šesť v každej skupine, Fale Balb /c-nu /nu, 6-8 týždňov veku), a bunky boli injikované do chvostové žila. Po štyroch týždňoch po injekcii boli myši usmrtené. Tkaniva pečene bol pozorovaný voľným okom, a bol počítaný počet viditeľných nádorov na povrchu pečene. Tieto pečeňového tkaniva boli rozdelené do sériových rezov, pevných fosfátom pufrovanom neutrálnym formalínu, zafarbené hematoxylínom a eosínu a skúmané histologicky. Nahé myši boli manipulované a starať sa o ne v súlade s pokynmi NIH Animal Care and Use výboru v experimente Animal stredu štvrtého Vojenskej lekárskej univerzity (Xi'an v provincii Shanxi, Čína PR).}

Luciferase Reporter Assay

Ak chcete zistiť, či je MYH9 expresia bola regulovaná rokov-7f, bola vykonaná reportér test dual-luciferázy. 3 'UTR obsahujúca MYH9 nechal-7f väzobné miesto bol amplifikovaný pomocou PCR. Amplifikácia MYH9 použité nasledujúce primery: (Forward) XhoIF: 5'CCGctcgagGCCTCTTCTCCTGCAGCCTG 3 '(reverznej) NotIR: 5'ATAAGAATgcggccgcTCGTAGCACATGGTTCTCTTTATTG 3'

Ako negatívna kontrola, mutovaného väzobné miesto sekvencie 3'-UTR (za použitia reverznej komplement väzbového miesta) bola amplifikovaná s použitím primerov: (Forward) mutlet7MYH9F: 5'TTGCAATCACACGTGGTGTGGAGTCACACCTCTGCCCCTTGG3 "(Reverse) mutlet7MYH9R: 5'CCAAGGGGCAGAGGTGTGACTCCACACCACGTGTGATTGCAA 3 '. Produkty boli kultivovaný pomocou elektroforézy v agarosovém gélu a klonované do luciferázového reportérového vektora PsiCHECK (Promega, Madison, WI). Všetky konštrukty boli overené sekvenovaním. Log fáza bunky GC9811-P boli vrúbľovať do 24 jamkami a kotransfekovány Let-7F inhibítory alebo kontrolou a luciferázové reportérov s použitím Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) podľa inštrukcií. Po 48 hodinách inkubácie, svetlušky a Renilla aktivita luciferázy bola meraná s duálnym luciferázovým reporterovým testovacieho systému (Promega).

Western Blot

Bunky boli premyté dvakrát ľadovo chladným PBS a do poškriabaný RIPA pufra (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1% (v /v) Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM leupeptinu, 1 mM fenylmetylsulfonyl fluorid, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4) s čerstvo pridané inhibítora proteázy koktail (Roche) po dobu 15 minút na ľade, potom sa odstredí pri 13000 otáčkach za minútu po dobu 10 minút a supernatanty sa zhromaždia. Desať mikrogramov každej vzorky bola rozdelená za použitia 6% SDS-PAGE a prenesené na nitrocelulózové membránu (Bio-Rad, Hercules, CA). Tieto pásy boli inkubované s 10% netučného sušeného mlieka v Tris-pufrovaný fyziologický roztok-0,1% Tween-20 pre blokovanie nešpecifických väzobných miest a inkubované s primárnou protilátkou: králičie polyklonálne anti-humánne myosin IIA (zriedený 1: 500; Cell Signaling Technology ) cez noc pri 4 ° C. Po rewarming a opakovanom čistení trikrát, 15 min pre každú z nich, boli membrány inkubované s chrenovou peroxidázou konjugovanou anti-králičie sekundárne protilátky (Santa Cruz Biotechnology) zriedený 1: 2000 po dobu dvoch hodín pri teplote miestnosti. Tieto pásy boli detekované pomocou rozšírenej systému chemiluminiscencie (Amersham Biosciences).

Imunohistochémia

Dve sady tkanivá boli získané od SHANXI CHAOYING biotechnológie CO., LTD. Jeden z nich bol rakovina žalúdka tkanivo a uzavreté priľahlé normálne žalúdočné tkaniva, druhá bola rakovina žalúdka tkaniva a uzavreté lymfatických uzlín .Tissue poľa boli zbavené vosku v 60 ° C po dobu 2 hodín, vysoká teplota pre obnovu antigén po dobu 10 minút, rehydrované inkubované v 10% normálnym kozím sére po dobu 1 hodiny, potom inkubované s králičie polyklonálne anti-ľudské myozínových II A (zriedený 1: 100; Cell Signaling Technology) cez noc pri 4 ° C. Sklíčka sa promyly v PBS trikrát za každých 5 min. Tkanivá boli inkubované v kozím anti-králičím sérom (Dako) po dobu 1 h, opláchnuté PBS. Rezy boli detekované pomocou DAB a kontrastne hematoxylínom. Intenzita sfarbenia bola hodnotená v štyroch krokoch stupnice (0, 1+, 2+ alebo 3+) a percento pozitívnych buniek bol odhadnutý tromi rôznymi patológov (0 = žiadna, 1 = menej ako 1%, 2 = 1 -10%, 3 = 10-30%, 4 = 30 až 70%, 5 = > 70% nádorových buniek). Celkové priemerné skóre boli potom rozdelené do štyroch kategórií: negatívny (bez zistiteľné farbenie pri hodnotení v porovnaní s nešpecifické pozadie farbenia, slabá (+), stredná (++) alebo silný (+++) a v porovnaní s použitím Mann-Whitneyho testu

Štatistická analýza

t test (dvojstranný), One-way ANOVA a Mann-Whitney testu boli použité na analýzu in vitro a in vivo dáta pomocou softwaru SPSS 12.0 (Chicago, IL , USA) hodnota P <. 0.05 bola definovaná ako štatisticky významný * P
. < 0,05; ** P
. < 0,01

Výsledky

úroveň rokov-7f expresie bolo často znížená ľudského GC metastatického bunkových líniách a tkanivách

sme skúmali úrovne expresie mRNA rokov-7f v dvoch pároch ľudských nádorových bunkových línií, žalúdočných GC9811, GC9811 -P a SGC7901-NM, SGC7901-M. Ako je znázornené na obrázku 1A, expresie rokov-7f bola nižšia u GC buniek, GC9811-P a SGC7901-M, s vysokým metastatickým potenciálom, pričom nechal-7F bol vysoko exprimovaný v GC buniek, GC9811 a SGC7901-NM, s nízkym metastatickým potenciálom. Pre ďalšie overenie rolu Let-7f v žalúdočnej rakovinové bunky metastáz, sme porovnali úrovne expresie rokov-7f v čerstvých vzorkách rakovina žalúdka u ľudí tkanív s metastázami z ôsmich jedincov (Tabuľka S1) k normálnej žalúdočnej tkanív (ng), základným žalúdočné rakovinové tkanivá (GC) a vzdialených metastatický rakovina žalúdka tkaniva (MC), respektíve od real-time PCR. Je zaujímavé, že tam bol pozoruhodný upregulace Let-7f v MC a GC, v porovnaní sa nechal-7F expresiu v NG (obrázok 1B). Pozorovali sme, že buď stratu alebo znížená expresia rokov-7f v nádoroch a ich metastatických tkanív za následok zvýšenú metastáz pri karcinóme žalúdka tkanivách. Výsledky naznačujú, že všetky expresie rokov-7f negatívne korelovala úzko so zníženou GC metastáz a mohla hrať dôležitú úlohu v patologických procesoch. Máme teda za predpokladu, klinickú a bunkovú koncepčné dôkaz pre metastatické spínačom v rozvoji rakoviny, ktorý by naznačoval kľúčovú úlohu pre vyjadrenie Let-7f vo vývoji rakoviny.

Let-7f inhibuje invazívne a metastatické schopnosti GC buniek in vitro

Vzhľadom k tomu, nechajú-7f pôsobí ako miešadla v invázii a metastatických procesoch, sme skúmali účinky zníženej rokov-7F na menej metastatických bunkových líniách a zvýšenie nechať-7F na viac-metastatických bunkových línií. Na dosiahnutie tohto cieľa, krátke interferujúce RNA (siRNA) oligonukleotidy rokov-7f boli konštruované a zavádzajú do GC9811 buniek a SGC7901 -NM buniek pre metastáz testoch in vitro, ako GC9811-rokov-7F-siRNA bunky, SGC7901-NM-rokov-7f -siRNA bunky a kontrolné bunky. Súčasne napodobniť-rokov-7f a negatívne kontrolné oligonukleotidy boli tiež vyrobené a zavedené do GC9811-P buniek a SGC7901-M buniek pre metastáz testoch in vitro, ako GC9811-P-rokov-7F-mimické bunky, SGC7901-N-si nechala -7f-napodobniť bunky a kontrolné bunky. Deplécia rokov-7F výrazne narušená schopnosť GC9811 buniek migrovať a inváziu cez Matrigelu potiahnuté membrány alebo non-Matrigel potiahnuté membrány voči obsahujúcim sérum médium v ​​modifikovanom teste komory Boyden (obrázok 2A). Zvýšená expresia rokov-7F významne potlačil schopnosť GC9811-P buniek migrovať a inváziu do Matrigelu potiahnuté membrány alebo non-Matrigel potiahnuté membrány voči médiu obsahujúcom sérum v upravenej Boyden komory testu (obrázok 2b), v porovnaní s kontrolné bunky. Podobné výsledky boli nájdené v SGC7901-NM bunkách (obrázok 3A) a SGC7901-M buniek (obr 3b), pričom dajte-7F knockout v bunkových líniách GC malo za následok vyššie sadzby invázie a migrácie.

Let-7f inhibuje nádorové invázie a metastázy v modeli xenoimplantátu holé myši

GC9811-P alebo nádorové bunky SGC7901-M transfekované lentivirus pGCsil-GFP rokov-7F alebo negatívna kontrola pGCsil-GFP bolo do holých myší a myší boli usmrtené štyri týždne po očkovaní. Počet metastatického nodi bola dramaticky znížená v nahých myší injektovaných s pGCsil-GFP rokov-7F transfekciou buniek, v porovnaní s negatívnymi kontrolami (obr 4A, 4B). Tieto dáta poskytujú silný dôkaz, že Let-7f môžu inhibovať nádorovú inváziu a metastázy in vivo.

Let-7f downreguluje myosin IIA expresie zamerala sa priamo na jeho 3 'UTR

Ak chcete ďalej skúmať mechanizmus, ktoré umožňujú-7f potláča GC invázie a metastáz, sme analyzovali potenciálny downstream nádorových metastáz súvisiacich cieľových génov in silico. Zamerali sme sa na let-7F cieľových génov, najmä tie gény, ktoré boli migrácie a /alebo invázie súvisiace, a zistil, že myosin IIA, ktoré sa podieľajú na podpore migrácie alebo invázie nádorových buniek, môže byť cieľový gén Let-7f. V snahe určiť, či myosin IIA je upravené rokov-7F prostredníctvom priamej väzby na jeho 3 'UTR, sme vyrobené plnej dĺžke divokého typu a mutantných fragmentov MYH9 mRNA 3' UTR, a vloží ich do oblasti bezprostredne za luciferázový reportéri gén (Obrázok 5A). Následne, nech-7f napodobňovať oligonukleotidy boli kotransfekovány s rôznymi luciferázy 3 'UTR konštrukty do GC9811 P-buniek. Zistili sme, že nech-7F znížil relatívne aktivity luciferázy v divokého typu 3 'UTR MYH9 (obrázok 5B). Avšak, aktivita luciferázy nemal prudko poklesne v UTR s väzobných miest mutant, v porovnaní s náprotivkami mut typu (obrázok 5c). Tieto údaje potvrdzujú, že MYH9 je priamym cieľom nechať-7F.

RT-PCR ukázala, že expresia MYH9 v GC9811 buniek a SGC7901-NM buniek transfekciou umožňujú-7F-napodobňuje je downregulated v porovnaní s týmito bunkami transfekovanými s kontrolnými konštrukty (Obrázok 5d). Western blotting Výsledky ukázali, expresie myozínových IIA v GC9811 a SGC7901-NM bunky transfekované rokov-7 f-napodobňuje sú down-regulované v porovnaní s tými, prenesené s negatívnou kontrolou (obr 5E). Furthmore, PCR v reálnom čase ukazuje, že relatívna expresia mRNA MYH9 v GC tkanivách a vzdialené metastatické tkaniva sú down-regulované v porovnaní s ich normálnym priľahlými non-rakovinové vzoriek (obrázok 6a). Imunohistochemické vyšetrenie ukázala, že expresia myozínových IIA v GC lymfatických uzlín je up-regulovaná v porovnaní s jeho primárnou GC tkanív (tabuľka 2, obrázok 6C, obr S1B), a je up-regulovaný v GC tkanive v porovnaní s jeho zodpovedajúce priľahlou normálny žalúdok tkanivo (tabuľka 1, obrázok 6B, obr S1A) .Tieto údaje ukazujú, že nechal-7F môže down-regulujú expresiu mRNA MYH9 a môže potláčať transláciu proteínov z toho

Diskusia

. Táto štúdia sme preukázali, že expresia let-7F v bunkových líniách metastatické GC bola downregulated v porovnaní s rokov-7F expresie v nemetastázujúce GC buniek. Ektopická expresia a siRNA porazený z Let-7f potvrdila svoju inváziu potláčajúce aktivitu in vitro a in vivo. Okrem toho ukazujeme, že MYH9 je priamym cieľom pre Let-7f a to či-7f sprostredkované potlačenie MYH9 je závislá na jeho 3 'UTR. Preto tieto výsledky zdôrazňujú význam rokov-7f ako nádorový supresor v bunkovej invázii a metastázy od cielenie MYH9 u karcinómu žalúdka.

Nedávne štúdie ukazujú, že miRNA môžu pôsobiť ako aktivátory alebo inhibítory nádorových metastáz [27] , Napríklad, microRNA-10b [28], Mir-373 a mier-520C [29], [30] stimulovanej migrácie a invázie nádorových buniek u karcinómu prsníka. Navyše, mier-155 môže podporovať invázie tumoru a metastáz karcinómu prsníka downregulating svoj cieľ, RhoA [31] a podporovať nádorovú inváziu a metastázy v pankrease karcinómu potrubí potlačením expresie TP53INP1 [32]. Rodina miRNA-200 (miRNA-200A, miRNA-200B, miRNA-200C, miRNA-141 a miRNA-429), môžu inhibovať nádorovú inváziu a metastázy reguláciou EMT [33]. MIR-126 bolo zistené, že inhibuje bunkovú adhéziu, migráciu a inváziu čiastočne prostredníctvom potlačenie CRK v modeli in vitro non-malobunkového karcinómu pľúc [34]. Bolo preukázané, že mier-29c je výrazne znížená vo vysoko invazívne a metastatické nazofaryngálne karcinóm [35]. Mir-218 inhibuje inváziu a metastázovaniu rakoviny žalúdka zacielením Robo1 receptor [26]. Hoci mnoho štúdie boli vykonané, aby vyšetrila mechanizmus miRNA a nádorových metastáz, mechanizmus nebol jasný. A čo je najdôležitejšie, majú málo štúdií bolo vykonané na mechanizmy regulácie GC metastáz u microRNA.

Gen rokov-7f sa nachádza v 9q22.3, a podieľa sa na rôznych fyziologických a patologických procesoch, vrátane angiogenézy [36], imunocytov diferenciácie [37], replikačná starnutie [38], zastavenie rastu [39], pľúcnej arteriálnej hypertenzie a karcinogenézy [23]. Let-7f je downregulated v niekoľkých malignít. Vysoko vyznačujúci príkladom je renálny karcinóm, v ktorom nechal-7F downregulaci viedlo k významnému poklesu v kalikreín (KLK) Výraz [40]. KLKs môže byť tiež zameraný Let-7f v rakoviny vaječníkov [25]. V papilárne karcinóm štítnej žľazy, znížená expresia rokov-7f by mohlo byť zásadný molekulárnej udalosť v RET /PTC malígne transformácie [41]. V prípade rakoviny prsníka primárne, ale nechať-7F bola up-regulovaná v porovnaní s normálnymi susednými nádorovom tkanive [22]. V našej štúdii sme preukázali, že let-7f sú tiež downregulated v MC tkanív a bunkových línií GC s vysokým metastatickým potenciálom, a budeme ďalej skúmať mechanizmus, ktorým let-7f znižuje nádorové invázie a metastázy.

MYH9 je gén pre non-sval myosin ťažkého reťazca (IIA NMHCIIA), ktorého mutácie sú zodpovedné za komplexné poruchy názvom MYH9 súvisiacich ochorení, vyznačujúci sa tým, kombinácia rôznych fenotypických vlastností [42]. NMMHC-IIA, polypeptidy 1960, s preloženého molekulovej hmotnosti 220 kDa, je konvenčné, non-sarkomerových myosin exprimovaný vo väčšine buniek a tkanív. Jeho funkcie patrí role v cytokinesis, pohyblivosť buniek a udržiavanie tvaru bunky [43]. Mnohé štúdie naznačujú, že MYH9 /NMHC-IIA má kľúčovú úlohu v nádorovej bunke invazívne behavior.For napríklad fosforylácie EGF-závislé na myosin-IIA ťažkého reťazca má priamu úlohu v sprostredkovaní motility a chemotaxie v MDA-MB-231 ľudskej bunky karcinómu prsníka [44]. Myosin IIA sa zdá byť hlavným bunkovým cieľom mts1 [45], malé vápnik viažuci proteín metastasin-1, a ko-lokalizovaný s mts1 k prednej hrane migrácii nádorových buniek [46]; mts1 vplyvmi ako zostava Správanie myozínových IIA a jeho fosforylácia [47], [48]. Nedávna správa dotýka MYH9 (NMHC-Ha) ako cieľ SRF, čo prispieva k invázie a metastáz pri karcinóme prsníka [49]. Naše údaje ukazujú, že MYH9 je priamym cieľom Let-7f, ktorá inhibovala invázie a metastáz väzbou 3 'UTR MYH9, čo viedlo k down-reguláciu expresie myosin IIA.

Na záver, naše štúdia ukazuje, že nechal-7F môže potlačiť inváziu a metastázovaniu rakoviny žalúdka priamo viazať 3 'UTR MYH9, svoj cieľ. I keď tam je ešte veľa čo učiť o úlohe Let-7f v žalúdku rakoviny vzniku nádorov, dajte-7f nám poskytuje nové potenciálne cieľ pre liečbu rakoviny žalúdka.

Podporné informácie
Obrázok S1.
expresiu MYH9 s exemplármi nádor žalúdka. (A) Expresia MYH9 v primárnej rakoviny žalúdka (PZ) a jeho priľahlé normálne žalúdočnej tkanive (N) pomocou IHC. (B) Expresia MYH9 v primárnej rakoviny žalúdka (Ca) a jeho uzavreté lymfatických uzlín tkanivo (M) pomocou IHC
doi :. 10,1371 /journal.pone.0018409.s001
(TIF)
Tabuľka S1.
patologickým je k dispozícii v 8 čerstvých žalúdočných nádorových vzoriek.
doi :. 10,1371 /journal.pone.0018409.s002
(DOC)

Poďakovanie

Sme vďační Zheng Chen za vynikajúce vedenie v priebehu experimentu

• Ploche ONE: onkogénne ČAGA podporuje riziko karcinómu žalúdka cez aktiváciou EKR signálnych dráh: vnorená štúdia prípadov a kontrol
• Ploche ONE: Wnt /β-katenin Zvyšuje cyklooxygenázy-2 (COX2) transkripčný aktivitu v žalúdku nádorových buniek