Ploche ONE: Let-7 microRNA Rodina je selektívne vylučuje do extracelulárnej prostredia prostredníctvom exosomy v bunke metastatické rakovina žalúdka Line

abstraktné

Pozadie

exosomy hrajú významnú úlohu v bunke, aby -buniek komunikácie, zacielenie bunky k prenosu exosomatických molekuly, vrátane proteínov, mRNA, a microRNA (miRNA), pomocou endocytózy podobné dráhy. miRNA sú malé nekódujúca RNA molekuly s priemerom 22 nukleotidov, ktoré regulujú rad biologických procesov, vrátane rakoviny patogenézy a sprostredkovávajú génu down-regulácia zacielením mRNA pre indukciu degradácie RNA a /alebo interferujúce s prekladom. Nedávne správy naznačujú, že miRNA môže byť stabilne detekované v cirkulujúcej v plazme a sére od miRNA sú balené podľa exosomy ktoré majú byť chránené pred degradáciou RNA. Preto profilovanie exosomatických miRNA sú v núdzi objasniť medzibunkovej signalizáciu a objaviť novú značku ochorenia rovnako.

Metodické /hlavných zistení

exosomy boli izolované z kultivovaných rakovinových bunkových línií a ich kvalita bola overená podľa analýzy transmisný elektrónové mikroskopie a western blotting. Jeden z testovaných bunkových línií, je metastatického karcinómu žalúdka bunková línia, AZ-P7a, ukázal najvyšší RNA výnos uvoľnených exosomy a výrazný tvar v morfológii. Okrem toho, RNA bola izolovaná z buniek a kultivačného média, a profilov z týchto troch miRNA frakcií boli získané pomocou microarray analýzy. Porovnaním intenzity signálu microarray dát a nasledujúce overenie pomocou RT-PCR analýzy sme zistili, že nechať-7 miRNA rodina bola bohatá ako v intracelulárnu a extracelulárnej frakcie z AZ-P7a buniek, zatiaľ čo nízke metastatické AZ-521, rodičovskú bunkou rad AZ-P7a, rovnako ako iných nádorových bunkových línií ukázala, žiadny takýto sklon.

Závery /Význam

obohatenie rokov-7 miRNA rodiny v extracelulárnych frakcií, najmä v jej exosomy z AZ-P7a buniek môže odrážať ich onkogénne vlastnosti, vrátane vzniku nádorov a metastáz. Vzhľadom k tomu, nechajú-7 miRNA zvyčajne hrajú úlohu tumor potláčajúce za projekty zamerané onkogény, ako je RAS stroje a HMGA2
Naše výsledky naznačujú, že AZ-P7a bunky uvoľňujú Let-7 miRNA cez exosomy do extracelulárnej prostredie udržiavať ich onkogenézy

Citácia :. k Ohshima, Inoue k, Fujiwara A, Hatakeyama k, Kanto k, Y Watanabe, et al. (2010) Nech-7 microRNA Rodina je selektívne vylučuje do extracelulárneho prostredia prostredníctvom exosomy v bunkovej línii metastatický karcinóm žalúdka. PLoS ONE 5 (10): e13247. doi: 10,1371 /journal.pone.0013247

Strih: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Nemecko |

prijatá: April 14, 2010; Prijaté: 10.09.2010; Uverejnené: 08.10.2010

Copyright © 2010 Oshima et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Práca bol podporený grantom v spolupráci s inovatívnou technológiou a Advanced Research vo vývojových priestore (CITY oblasť) od Ministerstva školstva, kultúry, športu, vedy a technológie v Japonsku. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

bunky vylučujú rôzne typy malých membránových mechúrikov. Exosomy sú jedným z vačkov s priemerom 30-100 nm a physicochemically odlišný od iných vylučované vačkov [1]. Vnútri exosomy, celulárnej génové produkty, vrátane proteínov, mRNA, a microRNA (miRNA) sú zabalené a tieto molekuly môžu byť prenesené do buniek príjemcu, aby predložili svoje molekulárnej signalizáciu, ako onkogenézy [2] - [4] a imunitné reakcie [1], [ ,,,0],5]. Exosomy sú uvoľňované v mnohých typoch buniek [6], ktoré patria nádorové bunky, epitelové bunky a hematopoetických buniek, ako sú retikulocytov, cytotoxické T lymfocyty, vírus Epstein-Barrovej-transformovaných B-buniek, žírnych buniek, dendritických buniek a krvných doštičiek. Vylučované exosomy boli izolované a charakterizované in vitro
z kultivovaných bunkových línií [7], spolu s in vivo
v telesných tekutinách [7], vrátane krvi, [8], moču, [9], slín [10], plodová voda [11], a malígne pleurálne efúzie [12]. Vzhľadom k tomu, pozorované u mnohých typov buniek proliferujúcich, je mysliteľné, aby zhorší nádorových buniek, o čom svedčí ich väčšiu prítomnosť v plazme a pleurálna efúzia od pacientok s karcinómom [8], [12]. Táto zvýšená prítomnosť v neinvazívnych telesných tekutinách pacientov s rakovinou sa zrýchlil na profil molekulárnych zložiek v exosomy pre objavovanie klinicky užitočných nádorových markerov a biomarkerov [3], [7], [13].

miRNA sú trieda nekódovacích malých RNA, ktoré sa podieľajú na post-translačnú reguláciu génovej expresie tým, že inhibuje ako stabilitu a transláciu mRNA [14]. Nedávne dôkazy ukázali, že miRNA mutácie alebo misexpression korelujú s rôznymi ľudských nádorov a ukazujú, že niektoré miRNA môže fungovať ako onkogény alebo nádorových supresor [15], [16]. Aby bolo možné analyzovať RNA, je vždy zvážiť ich stabilitu pred degradáciou RNázy. Nedávne výsledky ukazujú, že endogénne plazmatické miRNA vo vzorkách krvi sú stabilne detekovateľné vo forme, ktorá je odolná voči RNázové aktivity [17], o čom svedčí identifikácie miRNA v telesných tekutinách ako sú krv [17] - [24], v moči [25], a slín [10], [26].

Kultivované rakovinové bunky boli použité k hľadaniu nádorovej markery. A najmä určenie proteíny a peptidy vylučujú do kultivačného média bol vyvinutý proteomiky založené na prístupe [27], [28]. Čo sa týka molekulárnej podpis v exosomy, proteomiky, ako aj Transkriptomika analýzy boli vykonané odhaliť tumorigenezi a identifikovať nádorový marker kandidátmi [2] - [4], [7], [29]. Tu, na identifikáciu miRNA vzťahujúce sa k tvorbe nádorov a metastáz, sme vykonali rozsiahlu analýzu miRNA v troch bunkových frakciách, vrátane buniek, exosomy a médiá z kultivovaných buniek. Poradie údajov o týchto intracelulárnych a extracelulárnych miRNA získaných microarray analýzy sme zistili, že rodina let-7 miRNA je bohatá na všetkých frakcií z AZ-P7a buniek, metastatickým karcinómu žalúdka bunková línia, ktorá produkuje homogénne a kondenzovanej morfológiu, a s vysokou hodnotou zotavenie miera exosomatických miRNA. Tieto nálezy boli odlišné od iných bunkových línií vrátane rakoviny pľúc bunkových líniách (SBC-3, NCI-H69, a DMS53), kolorektálny karcinóm bunkové línie (SW480 a SW620) a AZ-521, rodičovské bunkové línie AZ-P7a. Vzhľadom na to, že umožňujú-7 rodinných funkcií miRNA hlavne ako tumor supresorové gény [30] zacieliť onkogény, ako je RAS stroje a vysoká mobilita skupina A2 ( HMGA2
) [31], navrhujeme, aby AZ -P7a bunky selektívne vylučujú rokov-7 miRNA do extracelulárneho prostredia cez exosomy udržiavať ich tumorigénny a metastatické sklonov.

Výsledky

Izolácia exosomy z bunkových línií rôznych rakovinových

exosomy sú vyrobené z vnútorných buniek do extracelulárneho prostredia cez exocytózou podobné cesty [1]. Okrem telesných tekutín, ako sú séra a plazmy z periférnej krvi [7], [8], exosomy sa nachádzajú v prostredí kultivovaných buniek [7], čo uľahčuje identifikáciu exosomatických molekúl, vrátane proteínov, mRNA a miRNA pre cieľom pre ich klinické použitie. Profilovanie také exosomatických molekuly, produkované v kultivovaných nádorových buniek viedla k objaviť nové kandidátnej marker a antigén pre diagnostiku a imunoterapiu onkologických [7]. V tejto štúdii, za účelom profilovanie exosomatických miRNA sme prvýkrát izolovaný exosomy z kultivačného média 46 rakovinových bunkových línií s rôznymi typmi tkanív, ktoré zahŕňajú 8 pre žalúdok, 16 pľúc, 5 pre hrubého čreva, 9 pre pankreas, 3 pre prostatu a 5 pre prsníka. Potom, čo boli bunky pestované počas 48 hodín, exosomy boli zbierané s kombináciou následné odstredenie a molekulovej hmotnosti cut-off membrány, ako je opísané v časti Materiály a metódy. Ich čistota exosomatických frakcií bola stanovená pomocou analýzy transmisný elektrónové mikroskopie a western blotting. Transmisný elektrónová mikroskopia ukázala, kruhového tvaru vezikulárnych membránové štruktúry, približne v rozsahu 100 nm v priemere. Medzi tri bunkové línie, SBC-3, AZ-521, a AZ-P7a, je zaujímavé, že morfológia z AZ-P7a bunkami bol viac homogénny a kondenzuje, než ostatné bunky (obrázok 1A). Immunoelectron mikroskopia ukázala, že častice extracelulárnej izolované z kultivačného média AZ-P7a buniek malo imunoreaktivitu s protilátkou proti CD63, jeden z exosomatických membránových proteínov, na kapsulárnych membrány (obrázok 1B). Prítomnosť známych exosomatických proteínov, vrátane CD29 /D1-integrínu, AIP1 /Alix a nádorové susceptibility génu 101 (Tsg101) bola potvrdená analýzou Western blot, zatiaľ čo proteín lokalizovaný do endoplazmatického retikula, Bip /Grp78 bola nedegovateľná (obrázok 1C). Tento výsledok ukazuje, že kontaminácia materiálom získaným z iných bunkových kompartmentov v exosomatických frakciách bola minimálna. Výťažok exosomatických proteínov z AZ-P7a buniek bola 10 krát vyššia, než je z AZ-521 buniek; ~ 2.5 Mg proteíny boli získané od 1 x 10 ^{8 AZ-P7a buniek.}

Obohatenie exosomatických RNA odvodených od AZ-P7a buniek

Po izolácii, exosomatických celkovej RNA boli izolované z 46 kultivované bunkové línie. Zaujímavé je, že RNA výnosy z AZ-P7a buniek bola oveľa väčšia, než tie, ktoré z iných buniek (obrázok 2A). Distribúcia v dĺžke ukázala prítomnosť veľkého množstva malých RNA v exosomy (stredového panelu, obrázok 2B). Je potrebné poznamenať, že je tu významný rozdiel v celkovom exosomy a úrovne exosomatických miRNA medzi pacientmi s adenokarcinómu pľúc a kontroly [8]. AZ-P7a bunková línia bola stanovená reinokuláciu parentálnej buniek, AZ-521 u myší, bola zaznamenaná vysoká peritoneálnej-metastatické potenciál [32], [33]. To znamená, že vysoké výťažky oboch RNA a bielkovín spolu s morfologickými vlastnosťami v AZ-P7a buniek môže byť pripísané ich vysokej tumorogénny alebo metastatických sklony. Vzhľadom k tomu, miRNA boli detekované v telesných tekutinách bez buniek [17] - [20], tiež vykonané priame izoláciu celkovej RNA z kultivačného média bez postupu pre izoláciu exosomy. Suma celkových RNA z kultivačného média boli vo všeobecnosti vyššie ako tie, ktoré z exosomy (obrázok 2A). Distribúcia RNA o dĺžke ukázala, že miRNA frakcie boli zistené v rozmedzí 10-40 dĺžka nukleotidov v RNA pripravenej z kultivačného média (pravý panel), ako aj exosomy (centrum panel) od AZ-P7a bunkách (Obrázok 2B). V súlade s protokolom pre výrobu je pre Bioanalyzer, vrcholy s dlhšou ako 40 nukleotidov dĺžky obsahovať ďalšie malých RNA, vrátane tRNA na 70 ~ 90, 5S ribozomálnej RNA pri 100 a 5.8S ribozomálnej RNA na 150 ° C, ako bolo pozorované v intracelulárnu frakcii (ľavý panel) , Tieto výsledky naznačujú, že miRNA môžu existovať v médiu mimo exosomatických frakcie, aj keď sa predpokladá, že RNA, ktoré majú byť chránené pred RNáz, ako je zabalený v exosomy. Najmä v porovnaní s adherentní bunky, prírastok RNA výnosov bola pozoruhodne vyššia u plávajúcich buniek (NCI-H69 a Lu-135), alebo bunky sa zmesou populácie plávajúce a adherentní bunky (Colo205), ktorá sa môže prejaviť tým, kontaminácie RNA prístrešok z lyžovaných buniek, ktoré boli trvalo vľavo v médiu.

miRNA profilovanie pomocou microarray analýzy

miRNA profily v intracelulárnu a extracelulárnej frakcie boli stanovené pomocou microarray analýzy pre sedem bunkových línií karcinómu vrátane az- 521, AZ-P7a, SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 a SW620. Vzorky z kultivačného média, rovnako ako exosomy poskytovanej hybridizačný signály (obrázok 3), čo ukazuje na existenciu miRNA v týchto vzorkách. Až do súčasnosti, ich analyzovanie dát microarray pre miRNA medzi vzorkami, neboli vykonané žiadne jasné metódy pre normalizáciu intenzity signálu, pretože je ťažké nájsť vhodný vnútorný štandard materiálu [34]. Tak dát microarray miRNA boli všeobecne analyzované, bez normalizácie, za predpokladu, že celkové množstvo vstupnej RNA sú konštantné medzi vzorkami [34], [35]. V tejto štúdii, po spriemerovania dát miRNA microarray medzi dvoma opakovaniami, sme zaradil miRNA podľa ich intenzity signálu. Zistili sme, že Let-7 miRNA rodinu, ako je let-7a, nechajte-7b, nechajte-7c, nechajte-7d, nechajte-7E, nechajte-7F, nechajte-7 g a nechala-7i boli detekované s relatívne vysokých signálov po väčšinu z intracelulárnych frakcií zo siedmich bunkových línií (tabuľka 1, obrázok 3). Avšak, žiadne alebo malé intenzity signálu pre miRNA let-7 boli zistené v extracelulárnych frakcií s výnimkou oboch extracelulárnych frakcií z AZ-P7a bunky a kultivačné médium frakcie z NCI-H69 buniek (tabuľka 1, obrázok 3). Zvlášť, v oboch extracelulárnych frakcií z AZ-P7a buniek, všetky osem rokov-7 miRNA boli zistené aj keď hodnosť rokov-7g bola nižšia ako u iných sedem rokov-7 miRNA. na odlišných vzorcov rokov-7 úrovní miRNA medzi tromi bunkových frakciách, sme rozdelili siedmich bunkových línií do troch skupín (obrázok 3) nasledovne; (1) AZ-P7a, bunky, ktoré umožňujú-7 miRNA boli nájdené vo všetkých troch frakciách, (2) AZ-521 spolu s SBC-3, DMS53, SW480 a SW620, bunky, ktoré umožňujú-7 miRNA boli všeobecne nájdené v iba intracelulárne frakcie (3), NCI-H69, bunky, ktoré umožňujú-7 miRNA boli nájdené v intracelulárnych frakcie, rovnako ako v médiu kultúry do určitej miery.

RT-PCR analýzy intracelulárnu a extracelulárnu akreditívov 7 miRNA rodina

My potom vykonáva kvantitatívnej RT-PCR pre Let-7 miRNA rodiny osem na overenie dát mikročipu. let-7 miRNA boli ľahko detekované v intracelulárnu a extracelulárnej frakcií z AZ-P7a bunkách (obrázok 4A) a AZ-521 bunkách (Obrázok 4B). Hladiny rokov-7 miRNA na vstup RNA boli vo všeobecnosti vyššie v extracelulárnej frakcií z AZ-P7a bunkách než z AZ-521 buniek. Pre normalizáciu hladiny cieľovej miRNA získaných pomocou RT-PCR, U6 snRNA sa zvyčajne používa ako vnútorná kontrola. sme pozorovali prítomnosť U6 snRNA vo všetkých troch frakciách z AZ-P7a buniek a AZ-521 bunkách (Obrázok 4C), a potom porovnáva hladiny rokov-7 miRNA medzi zodpovedajúcich frakcií z týchto dvoch bunkových línií. Po normalizácii hladiny Let-7 miRNA vrátane rokov-7a, nechajte-7b, nechajte-7c, nechajte-7d, dajte-7E, a nechať-7i v oboch frakcií exosomy a živnej pôdy z AZ-521 bunky boli znížená v porovnaní s tými z AZ-P7a buniek. Naopak, nebol žiadny veľký rozdiel v úrovni intracelulárnym rokov-7 miRNA. Ďalej v porovnaní úrovne exosomatických rokov-7a z AZ-P7a buniek z iných nádorových bunkových línií, vrátane SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 a SW620, a zistili, že hladina let-7a iba z SW620 bunky bol pomerne blízko (0,7násobek) na úrovni od AZ-P7a bunkách (Obrázok 4E). Je potrebné poznamenať, že intracelulárne hladina let-7a z SW620 buniek bola približne 3,5 krát hojnejší než z AZ-P7a buniek. Na základe týchto výsledkov sme predpokladali lokalizáciu rokov-7a vo ​​frakciách buniek a exosomy (obrázok 5), a ďalšiu analýzu. Normalizovať hladiny U6, sme vypočítali relatívna úrovne rokov-7a balené v exosomy na úrovni bunkovej rokov-7 a (obrázok 4F). V dôsledku toho je množstvo exosomatických rokov-7a bol oveľa väčší v AZ-P7a bunkách ako šiestich ďalších buniek, čo naznačuje, že AZ-P7a bunky selektívne a aktívne vylučuje rokov-7 miRNA rodinu do extracelulárneho prostredia cez exosomy.

Diskusia

V tejto štúdii sme zistili, že rodina let-7 miRNA bol secernovaný do extracelulárneho prostredia cez exosomatických dopravy, ktorý bol špecifický pre metastatického karcinómu žalúdka bunkové línie, AZ-P7a. let-7 miRNA rodina u človeka sa skladá z 10 sekvencie z 13 prekurzorov [30]. Všeobecne platí, že nech-7 miRNA pôsobiť ako nádorový supresor zacielením onkogény napríklad RAS stroje a HMGA2 stroje a necháme-7 miRNA sú downregulated v mnohých druhov rakoviny solídnych orgánov [31]. AZ-P7a bunky majú schopnosť metastatické s peritoneálnej šírenie u nahých myší [32], [33]. Preto navrhujeme, aby uvoľňovanie exosomatických prenájmu-7 miRNA do extracelulárnej životné prostredie viedol k poklesu anti-karcinogénne účinky v bunkách, ktoré vedú k zachovaniu ich onkogenézy a invasiveness. Na druhej strane, nech-7 miRNA menej často hrajú onkogénne funkciu, kvôli zvyšovaniu expresie hypometylácii na let-7 lokuse [36], alebo cielenie kaspázy-3 mRNA [37]. V tomto prípade je uvoľnenie exosomatických prenájmu-7 miRNA môže spôsobiť transformáciu v cieľových bunkách prenosom ich onkogénne vlastnosti.

U pacientov s rakovinou pľúc, celkovej hladiny exosomy a ich miRNA vzrastať v porovnaní s kontrolami [8 ]. Bolo preukázané, že nádorové exosomy vyvolať imunitnú únikový mechanizmus rakoviny spontánne apoptózy T buniek [38] - [40]. V tejto štúdii sme ukázali homogénne morfológiu a obohatenie RNA v exosomy z metastatických AZ-P7a buniek. To sa môže prejaviť ich nádorového bujnenia.

miRNA sú veľmi stabilné v krvnej plazme a sére od chránená pred RNases [17]. Tak, že je úroveň miRNA testované pre klinickú diagnózu ako nádorových markerov a biomarkerov. Ako sa to stalo? Chin a kol. navrhli dve hypotézy pre zdroj miRNA na cirkulujúcich krvných vzoriek; to môže byť spôsobené v dôsledku úmrtia nádorových buniek a lýzy alebo uvoľnenie nádorovými bunkami do extracelulárneho mikroprostredia krvných ciev [19]. Na rozdiel od adherentních buniek sme pozorovali, že množstvo celkových RNA v médiu boli relatívne vyššie ako v exosomy pre bunky s plávajúcou vlastnosti, ako NCI-H69, Lu-135 a Colo205. Tento prírastok pravdepodobne za následok kontamináciu RNA z mŕtvych buniek v médiu.

Na objave nových nádorových markerov v krvi a biomarkerov, omics prístupy vrátane proteomiky a Transkriptomika sú vedené buď priamu analýzu krvných vzoriek alebo aplikácie profilovanie vo vzorkách tkanív. Tam sú protichodné správy, ak je, či profily miRNA a mRNA v krvi sú rovnobežné s profilu nádoru. Podpis exosomatických miRNA odráža pôvodných nádorových buniek u pacientov s adenokarcinóme pľúc [8] a rakoviny prsníka [41]. Na druhej strane, Skog et al. ukázali, že microarray analýzy pre mRNA získaných z glioblastómu buniek a zodpovedajúcich exosomy odhalených mRNA výhradne zistené v mikrovesikly, špekulovať, že mRNA sú lokalizované do určitej oblasti cytoplazmy [3]. Okrem toho, Tanaka et al. preukázali, že hladina MIR-92a znížila v krvnej plazme pacientov s akútnou leukémiou, zatiaľ čo jeho silná expresia bola zistená vo vzorkách tkanív [24]. Naše výsledky na selektívne rozmnoženiu Let-7 miRNA rodinou v AZ-P7a buniek odvodených exosomy fit s poslednom prípade. Ak cieľovej molekuly sú miRNA odvodené od cirkulujúcich nádorových buniek, naznačuje, že starostlivý prieskum je potrebné použiť miRNA profily v tkanivových vzoriek pre detekciu vo vzorkách séra alebo plazmy.

Vzhľadom k tomu, exosomy sú vyrábané v krvotvorných bunkách, rovnako ako epitelové bunky , obehové krvi obsahuje exosomy odvodené od oboch typov buniek. Všeobecne platí, že vyšetrovať exosomatických profily proteínov, mRNA a miRNA v sére a plazme, exosomy odvodených z nádorov epitelu vlastnosťami sú oddelené od tých, od hematopoetických buniek [8], [13]. To sa vykonáva pomocou afinitnej purifikácie s protilátkami proti molekulám, ako je EpCAM, ktoré exprimujú na povrchu epitelových buniek. Naše zistenia, že tam boli podobné hladiny Let-7 miRNA rodiny medzi exosomy a kultivačné médiá od AZ-P7a bunkách naznačujú, že tieto úrovne Mirna možno merať bez izolácie exosomy z klinických vzoriek, ako sú sérum a plazmu.

záver táto štúdia preukázala, že let-7 miRNA rodina je bohatá na exosomy z metastatickým žalúdočné rakovina bunkové línie, AZ-P7a buniek. Vzhľadom k tomu, nechať-7 miRNA sa zúčastňuje proliferácie procese [31], ich sekrécie exosomatických môže hrať dôležitú úlohu pri vzniku nádorov a metastáz.

Materiály a metódy

Bunková kultúra

ľudskej rakoviny žalúdka bunkové línie (AZ-521, MKN45, KATOIII a NUGC-3), ľudské pľúcnej rakoviny bunkové línie (SBC-3, Lu-65, Lu-135, a KNS-62), a ľudské pankreatické nádorové bunky ( oblek-2) boli zakúpené od japonského Collection of Research Bioresources. rakovinové bunky ľudského žalúdka (SNU-1), ľudského karcinómu pľúc bunkové línie (DMS-53, DMS114, NCI-H69, A549, NCI-H1299, NCI-H1155, NCI-H520, NCI-H1560, SK-MES-1, a HCC827), ľudské bunky mezoteliomu (pomstou-H211), ľudský kolorektálny karcinóm bunkové línie (SW480, SW620, Colo205, lovou, a HCT116, ľudské pankreatické rakoviny bunkové línie (BxPC-3, ASPC-1, Panc-1, MIAPaca- 2, HPAF-II, PL45 a Capan-2), ľudských buniek rakoviny prostaty línie (PC-3, SU145 a LNCaP), a ľudské bunkové línie karcinómu prsníka (T-47D, MCF7, SK-BR-3, BT -474, a MDA-MB-231) boli zakúpené od typu American Culture Collection. MKN28 (rakovinové bunky ľudského žalúdka) a PSN-1 (ľudské pankreatické nádorové bunky) boli zakúpené od Immuno-Biological Laboratories a Európskej zbierke bunkových kultúr, resp . rakovina žalúdka ľudských bunkových línií, AZ-P7a [32], [33] a MKN45P [42] boli darom od Drs. Yutaka Yonemura a Yoshio Endo. V AZ-521 a AZ-P7a bunky, neboli pozorované žiadne produkty RT-PCR 14 retrovírusov, vrátane HPV16, EBV, CMV, SV40, HBV, HCV, BKV, JCV, HHV7, HTLV1, HTLV2, HIV1, HIV2 a ADV typu 1 (dáta nie sú ukázaná), s výnimkou infekcie týmito retrovírusy v oboch bunkových línií , Bunky boli udržiavané v médiu RPMI-1640 (Sigma-Aldrich), doplnenom 10% tepelne inaktivovaného fetálneho séra hovädzieho dobytka (Invitrogen), 100 U /ml penicilínu a 0,1 mg /ml streptomycínu.

produkciu a izoláciu z exosomy

adherentní bunky boli schovať na 150 mm miskách pri príslušnom počte buniek v rozmedzí od 3 x 10 ^{6-1 × 10 7 buniek na misku, zatiaľ čo plávajúce bunky boli vrúbľovať do 75 cm 2 fľaše na 2 ~ 2.5 × 10 7 buniek na banky. Bunky boli kultivované v kompletnom médiu RPMI-1640 25 ml a 50 ml na riad a baniek, v uvedenom poradí, počas 24 hodín pri teplote 37 ° C a 5% CO _{2, dvakrát sa premyjú fyziologickým roztokom pufrovaným fosforečnanom (PBS), a inkubujú sa 48 hodín vo bez fenolové červeno, RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) s obsahom 10% tepelne inaktivovaného fetálneho séra hovädzieho dobytka, ktorá bola predtým ochudobnený cudzorodej mikrovesikly cez noc centrifugáciou pri 100000 x g. Exosomy boli izolované z celkového počtu buniek v rozsahu od 6 x 10 7-3 x 10 8 buniek, ako je opísané skôr [29]. Stručne povedané, kultivačné médium bolo odobrané a centrifugovány pri 800 x g počas 5 min a ďalšie 2000 x g 10 minút, aby sa odstránili bunky zdvihnuté. Supernatant sa podrobí filtrácii na 0,1 um pórov polyétersulfón membránovým filtrom (Corning) pre odstránenie bunkového odpadu a veľké vesikuly, nasledované zakoncentrováním 100.000 Mw cut-off membránu (CentriPlus-70, Millipore). Objem kalu bol znížený z približne 250 až 500 ml na približne 30 ml. Supernatant bol potom ultracentrifugován pri 100,000 x g počas 1 hodiny pri teplote 4 ° C za použitia 70-tich rotora (Beckman Coulter). Výsledné pelety sa resuspendujú v 6 ml PBS a ultracentrifugován pri 100,000 x g počas 1 hodiny pri teplote 4 ° C za použitia 100T rotora (Beckman Coulter).}}

Transmisný elektrónová mikroskopia

granulovaní exosomy boli zmiešané s rovnakým množstvom čerstvo pripraveného 2% glutaraldehydu v PBS, inkubované cez noc pri 4 ° C, fixované s 1% oxidu osmičelého v PBS pri teplote 4 ° C po dobu 2 hodín, a dehydratáciu v odstupňované rade etanolu. Po dehydratácii, boli vzorky prenesené do propylénoxidu a vložený do epoxidovej živice Quetol 812 (Nisshin EM). Ultratenké rezy boli narezané s UltraCut UCT (LEICA), farebné uranylacetátem a citrátom olovnatým, a pozoroval sa JEM-1230 elektrónového mikroskopu (JEOL). Immunoelectron mikroskopická analýza bola vykonaná v súlade s metódou opísanou Xiao et al. [43] s drobnými úpravami. V stručnosti, exosomy boli zmiešané a inkubované s myšou anti-ľudská CD63 monoklonálne protilátky (katalógové č. Sc-51662, Santa Cruz) po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Vzorka bola vynechaný na povrchu membrány z medeného pletiva (kolodiový /uhlík potiahnutý 400 mesh, Nisshin EM) a inkubované po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Po premytí s PBS, immunogold konjugovanou kozí anti-myší IgG (katalógové č. EM.GMHL15, BBInternational) zriedený v 1:20 bolo upustené na membránu. Medené pletivo sa vznášal v kvapôčkach sa jeho povrchu membrány stretávajú sa pri izbovej teplote po dobu 30 minút. Po premytí s PBS, uranylacetátem kvapiek bola uvedená na povrch medi mesh a zafarbia sa pri teplote miestnosti po dobu 30 s. Exosomy s čiernymi časticami koloidného zlata na kapsulárnych membrány boli označené ako pozitívne pod transmisnom elektrónovom mikroskope.

Western blot analýza

Bunky a exosomatických frakcie boli premyté, resuspendované v lyzačním pufri [7,5 M močoviny (Sigma-Aldrich), 2,5 M tiomočoviny (Sigma-Aldrich), 12,5% glycerolu (Wako), 50 mM Tris, 2,5% n-oktyl-beta-D-glukozid (Sigma-Aldrich), 6,25 mM Tris (2- karboxyethyl) fosfínu hydrochloridu (Sigma-Aldrich), 1,25 mM inhibítora proteázy (katalóg č. P2714, Sigma-Aldrich)], a inkubované po dobu 1 hodiny pri 4 ° C za použitia Rotator RT-50 (TAITEC). Po centrifugácii pri 14000 x g počas 60 minút pri teplote 4 ° C, supernatant sa oddelí a koncentrácia proteínu bola stanovená Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad). Časť proteínu (10 ug) boli denaturovaný varom v Laemmliho vzorkovej pufri, beh na 10% SDS-polyakrylamidových géloch a prenesené do Immobilon-P PVDF membrány (0,45 um veľkosť pórov, Millipore). Bloty boli blokované po dobu 1 hodiny s 5% netučného sušeného mlieka v Tris-pufrovanom soľnom roztoku obsahujúcom Tween 20 (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl a 0,01% Tween 20). Po blokovaní boli membrány inkubovali s každou primárnej protilátky alebo antiséra, vrátane králičie anti-Tsg101 séra (katalógové č. T5951, Sigma-Aldrich), kozie anti-AIP1 /Alix sérum (katalógové č. Sc-49268, Santa Cruz), myšou monoklonálnou anti-CD29 /β1-integrín (katalóg č. sc-610468, BD Biosciences) a myšou monoklonálnou anti-Bip /Grp78 (katalóg č. 610979, BD Biosciences) pri zriedení 1: 200 po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Bloty boli potom inkubované so zodpovedajúcim anti-IgG sekundárnou protilátkou konjugovanou s chrenovou peroxidázou (Jackson Laboratories), v riedení 1: 2,000 po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Špecifické proteíny boli vizualizované za použitia systému ECL (GE Healthcare) a FUJIFILM luminiscenčné Image Analyzer LAS3000 (Fuji Film). Molekulová hmotnosť proteínu bola odvodená pomocou Precision Plus Protein Standards (Bio-Rad Laboratories).

RNA Isolation

Pre izoláciu RNA z kultivačného média, bunky boli schovať, ako je popísané vyššie. 48 h po pestované, kultivačné médium bolo odobrané a centrifugovány pri 800 x g počas 5 min a ďalšie 2000 x g počas 10 minút. Supernatant sa podrobí filtrácii na 0,22 um pórov polyétersulfón membránovým filtrom (Corning), nasledované koncentráciou s 5,000 Mw cut-off membrány (Centricon Plus 70, Millipore). Konečný objem roztoku bolo približne 10-20 ml z pôvodného objemu 250-500 ml. Supernatant sa zmieša s rovnakým objemom QIAzol lyzačný roztok (Qiagen) a nasledoval postup pre izoláciu RNA popísané nižšie. Celková RNA bola izolovaná z buniek, exosomy alebo kultivačnom médiu pomocou miRNeasy Mini Kit (Qiagen) podľa pokynov výrobcu. Pre odstránenie genómovej DNA, 40 ug bunkového celkovej RNA boli inkubované s 40 jednotkami RQ1 prosté RNázy DNázy (Promega) pri teplote 37 ° C počas 30 min za prítomnosti 40 jednotiek RNasinu Plus RNase Inhibitor (Promega). Pre celkové RNA z exosomy a kultivačného média, všetky množstvá surových produktov boli spracované rovnakým spôsobom, s výnimkou použitia 5 U DNázy. RNA sa čistí pomocou RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen) podľa inštrukcií výrobcu. Vzorky RNA boli kvantifikované s Nanodrop spektrofotometra (Thermo Fisher Scientific) a hodnotená pomocou Agilent Small RNA Kit a Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies).

Microarray analýza

miRNA profilovanie, 100 ng a 20 ng bunkových a extracelulárnych celkovej RNA, v danom poradí, boli fluorescencie značené pomocou miRNA Kompletné Etiketovacie reagent a Hyb Kit (Agilent Technologies) podľa protokolu výroba je (Agilent miRNA microarrays verzia 2.2). Komplexná analýza miRNA bola vykonaná s použitím ľudskej miRNA microarray Kit (8 × 15 K) Ver.3.0 (Agilent). Hybridizačný signály boli detekované s DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies). Naskenované obrázky boli analyzované pomocou funkcie extrakcie softvér a analýza dát bola vykonaná za použitia Agilent softvéru GeneSpring GX (Agilent Technologies). V popisované v tomto rukopise údaje boli uložené v NCBI je génovej expresie Omnibus (GEO) a sú prístupné prostredníctvom GEO Series prístupovým číslom GSE21350: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE21350).

reverznej transkripcie (RT) a kvantitatívnej RT-PCR pre miRNA analýzu

hladiny kvantitatívne Mirna boli stanovené pomocou real-time RT-PCR s Applied Biosystems 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems), TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems) pre ľudskú nechať-7 a (test ID 000377), let-7b (test ID 002619), dajte-7c (test ID 000379), dajte-7 d (test ID 002283 ), nech 7E (test ID 002406), dajte-7f (test ID 000382), dajte-7g (test ID 002282), dajte-7i (test ID 002221) a U6 snRNA (test ID 001973) ako vnútorná kontrola , Desať ng celkovej RNA sa podrobí reverznej transkripcii s TaqMan® Universal PCR Master Mix č AmpErase (Applied Biosystems) a príslušných TaqMan činidiel pre cieľové gény. RT-PCR bola vykonávaná v celkovom objeme 20 ul reakčnej zmesi v súlade s protokolom pre výrobu je. Amplifikácia bola vykonaná nasledujúcim spôsobom: 95 ° C počas 10 minút, 40 cyklov 95 ° C počas 15 sekúnd a 60 ° C počas 60 s. Vzorky boli analyzované v troch vyhotoveniach ako biologické replikáciu alebo štyroch ako technický replikáciu. Hladiny miRNA boli definované od prahovej hodnoty cyklu (Ct), porovnávacie metódou Ct a normalizáciou na úrovni U6 snRNA v každej vzorke. Fold zväčšuje alebo zmenšuje v každej úrovni miRNA z testovaných bunkových línií boli stanovené v závislosti na úrovni bunkovej línie AZ-P7a.

Poďakovanie

Ďakujeme členovia Shizuoka Cancer Center Research Institute pre ich mnoho užitočných návrhov. Ďakujeme tiež Drs. Yutaka Yonemura a Yoshio Endo za dar bunkových línií AZ-P7a a MKN45P.

• Ploche on: Gene Expression Podpis získaného chemorezistence k cisplatine a fluorouracil kombinovaná chemoterapia v žalúdočnej pacientov s rakovinou
• Ploche ONE: hypoxiou indukovatelný faktor 1α Určuje, rakovina žalúdka chemosenzitivity cez moduláciu p53 a NF-kB