Ploche ONE: Affinity Zrenie monoklonálne protilátky 1E11 cielenými náhodnosti v regiónoch CDR3 optimalizuje terapeutickú protilátkou zacielenie HER2-pozitívnych žalúdočné Cancer

abstraktné

Anti-HER2 myšou monoklonálna protilátka 1E11 má silné a synergické protinádorovú aktivitu v HER2-expresiou buniek karcinómu žalúdka pri použití v kombinácii s trastuzumabom. V súčasnosti tento optimalizované protilátky k ľudským liečiv. Po prvé, oblasti určujúce komplementaritu (CDR) z myší protilátky boli vrúbľovať na variabilných génov humánnej zárodočnej línie imunoglobulínových. Žiadny rozdiel v afinite a biologickej aktivity bol pozorovaný medzi chimérická 1E11 (ch1E11) a humanizovanej 1E11 (hz1E11). Ďalšie, afinitná zrenie hz1E11 bola vykonaná na nepravidelné CDR-L3 a H3 zvyškov s následnou prísnym výberom biopanningu. Miernejšie selekčný tlak zvýhodňuje výber z viacerých rôznych klonov, zatiaľ čo vyšší výber stringence za následok konvergenciu ryžovanie výstupu na menší počet klonov so zlepšenou afinitou. Klon 1A12 mal štyri substitúcie aminokyselín v CDR-L3, a vykazoval 10-násobné zvýšenie afinity v porovnaní s rodičovskou klonu a zvýšená účinnosť pri od in vitro
test anti-proliferačnej aktivity s rakovinou žalúdka HER2 overepxressing buniek. Clone 1A12 inhibuje rast nádoru NCI-N87 modelu xenoimplantátu s podobnú účinnosť ako samotný trastuzumab a kombinovaná liečba 1A12 a trastuzumabu úplne odstránené už vzniknutých tumorov. Tieto výsledky naznačujú, že humanizovaná a afinita zrel monoklonálna protilátka 1A12 je vysoko optimalizovaná molekula pre budúci vývoj terapeutické proti HER2-pozitívnych nádorov

Citácia :. Ko BK, Choi S, Cui LG, Lee YH, Hwang IS, Kim KT, et al. (2015) Affinity Dozrievanie monoklonálne protilátky 1E11 cielenými náhodnosti v regiónoch CDR3 optimalizuje terapeutickú protilátkou Zameranie HER2-pozitívne rakoviny žalúdka. PLoS ONE 10 (7): e0134600. doi: 10,1371 /journal.pone.0134600

Editor: Mitchell Ho, National Cancer Institute, NIH, Spojené štáty

prijatá: 14. apríla 2015, Prijaté: 12.07.2015; Uverejnené: 30. júla 2015

Copyright: © 2015 Ko et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje spadajú do papiera a jeho podporné informácie súbory

Financovanie :. Táto štúdia bola podporená AbClon Inc., a National Research Foundation of Korea (NRF) grantu HS k liečebným Bioconvergence Research Center (NRF-2013M3A6A4044991) , Komerčné Funder (AbClon Inc.) poskytla podporu vo forme platov pre autorov (BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK a JSL), ale nemal žiadnu ďalšiu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie zverejniť, alebo príprava rukopisu. Konkrétne role týchto autorov sú vyjadrené v sekcii "Autor príspevku"

konkurenčnými záujmami :. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK a JSL sú zamestnané AbClon Inc. a môžu vlastniť IDS zásob. HS je na platené poradenstvo k AbClon Inc. a tiež vlastné svoj sklad. Abclon sleduje patentov a vývoj produktu na zlúčeninách, ktoré sú spomenuté v tomto dokumente. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK a JSL sú v súčasnej dobe zamestnaný komerčným poskytovateľa finančných tohto výskumu AbClon Inc. a môže vlastniť svoj sklad. HS je v súčasnej dobe na platené poradenstvo pre AbClon Inc. tiež vlastné svoj sklad. AbClon má registrovaný patent v Kórei (KR10-1453462, protilátky schopné viazať sa špecificky k HER2) a podal prihlášku PCT (PCT /KR2014 /004317, protilátky špecificky sa viažuci k HER2), v ktorej BKK, YHL, H, KTK a JSL sú uvedené ako vynálezca. AbClon je tiež sleduje vývoj produktu na humanizovaných, afinitná zrelých protilátok, ktoré sú spomenuté v tomto dokumente. Tieto nemenia priľnavosť jednotlivých autorov do všetkých politík ploche jeden na zdieľanie dát a materiálov.

Úvod

Monoklonálne protilátky sú tradičné liečby v onkológii a autoimunitných ochorení, a očakáva sa, že hrajú dôležitú úlohu v budúcnosti liečby ochorení [1, 2]. Viac ako 30 rekombinantnej protilátky sú v súčasnej dobe schválené United States Food and Drug Administration, z ktorých približne polovica sú protirakovinové protilátky. Karcinómu žalúdka je jedným z najčastejších druhov rakoviny a je treťou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu na celom svete [3]. V karcinómu žalúdka, zvýšená expresia receptor epidermálneho rastového faktora (EGFR), ľudský receptor epidermálneho rastového faktora 2 (HER2), a HER3 je v korelácii so zlou prognózou [4, 5]. V poslednej dobe sa HER2 cielenie monoklonálne protilátky trastuzumab bol schválený pre liečbu HER2-pozitívnym karcinómom žalúdka a gastroezofageálneho spojenia založené na výsledkoch trastuzumabu s chemoterapiou vo HER2-pozitívnym pokročilým rakovina žalúdka (Toga) klinického hodnotenia [6].

Jednotlivé kombinácie vzájomne nekonkurenčnom protilátok zameraných na protinádorovú aktivitu rovnaký nárast receptor in vitro stroje a in vivo
. Kombinácia HER2 cielené protilátky, trastuzumabom a pertuzumab, ukazuje zvýšená účinnosť v karcinómov prsníka HER2-nadexprimující [7]. Prínosy pertuzumab a trastuzumab kombinácia bola ďalej preukázaná v predklinických a klinických štúdiách [8, 9]. Ďalšie protilátky HER2-zacielenie vykazujú lepšiu účinnosť v kombinácii, než ako jednotlivými agens, a preukázali konzistentné down-regulácia hladín HER2 a prospešných účinkov kombinácie na myšiach modeloch [10]. Zvýšená účinnosť protilátok kombinácie bola tiež preukázaná s protilátkami EGFR cielenie [11, 12] a vaskulárny endoteliálny rastový faktor receptor 3 (VEGFR3) -targeting protilátok [13].

Terapeutické protilátky sú zvyčajne navrhnuté tak, aby vo veľkej miere majú žiaduce biologické a fyzikálno-chemické vlastnosti, ako sú napríklad nízke imunogenity, vysokou afinitou a špecifickosťou, optimálna efektorové funkcie, a dobrú rozpustnosť a stabilitu [14]. Najmä, humanizácie protilátok a afinitný zrenia sú dve z najčastejšie používaných technických procesov pri vývoji terapeutických kandidátov protilátok. Imunogenicita terapeutické protilátky obmedzuje klinickú užitočnosť a účinnosť produkciou protilátok anti-drog [15], a humanizácie protilátok z myši alebo iných druhov je dnes štandardný postup pre vývoj terapeutických protilátok. Boli vyvinuté Niekoľko humanizácie metódy, ktoré používajú buď racionálne alebo empirické prístupy [16]. Región určujúce komplementaritu (CDR) štepenie prístup, ako metóda pre prekonanie ľudskej anti-chimérická protilátky (HACA) reakciu [17] je dobre zavedenou metódou humanizácie. Avšak, priame štepenie myšiach CDR do ľudskej akceptorové rámcové sekvencie často vedie k strate afinity, tak spätných mutácií zvyškov konzervatívneho úseku (Vernier zóna zvyškov) nosných štruktúra CDR slučiek, je často nevyhnutné [18]. Pre in vitro
afinitnej zrenia, tri diverzifikácia prístupy sú zvyčajne používajú: náhodnú mutagenézou pomocou napr. PCR náchylné k chybám, randomization cielených zvyškov za použitia degenerovaných oligonukleotidov a reťaze preskupovanie. V cielený prístup randomizácie, CDR sú logický cieľ pre randomizácii vo väčšine prípadov, pretože somatické hypermutace sa vyvinul do prednosť mutácie v CDR protilátky [19], a CDR-H3 a CDR-L3 spravidla dominujú interakciu s antigén-protilátka [ ,,,0],20]. Jeden z hlavných problémov spojených s cieleným randomizácii je výber pozície, ktoré nie sú nevyhnutné pre väzbu antigénu, ale ktoré môžu zvýšiť afinitu pri optimálnej substitúcia aminokyseliny je vyrobená. Alanín skenovania môže pomôcť určiť, zvyšky sa náhodne, najmä ak CDR sú dlhé. Niekedy, alanín mutácie sama o sebe zvyšuje afinitu protilátok [21].

Už skôr sme vyvinuli myšou protilátka namierená proti HER2 (klon 1E11), ktorý ukazuje, synergickú protinádorovú aktivitu v kombinácii s trastuzumabom v HER2 žalúdočné rakovina bunkové línie [22 ]. V tejto správe je návod, ako sme optimalizovali 1E11 pre terapeutické protilátky podľa CDR na humánne zárodočnej línie imunoglobulínových variabilných génov a afinitný zrenia prostredníctvom cieleného nepravidelné CDR-H3 a CDR-L3. Optimalizovaná 1E11 protilátkou (klon 1A12) vykazuje synergickú protinádorovú aktivitu HER2-pozitívnych modelov žalúdočné rakovina štepov v kombinácii s trastuzumabom. Bolo zistené, že pre klon 1E11, humánne zárodočné línie variabilné gény sú vhodnými akceptory pre humanizáciu bez afinity redukcie a substitúcia zvyškov CDR-L3, ktoré nie sú nevyhnutné pre väzbu antigénu stačilo k zlepšeniu afinity o viac ako 10-krát.

materiály a metódy

Bunkové línie a materiály

NCI-N87 bunky boli zakúpené od American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) a OE-19 bunky boli získané z Európskej zbierke bunkových kultúr (ECACC, Porton Down, UK). Bunkové kultivačné médium bolo RPMI-1640 doplnenom 10% fetálneho hovädzieho séra (FBS), a antibiotiká a bunky boli kultivované pri 37 ° C v atmosfére obsahujúcej 5% CO _{2. Trastuzumab a palivizumab bol vyrobený spoločnosťou Genentech (South San Francisco, CA, USA) a MedImmune, LLC (Gaithersburg, MD, USA), v danom poradí. ChromPure ľudského IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) bol použitý ako kontrolná protilátka ľudského IgG za in vitro
testoch. IgG protilátky boli vyrobené za použitia systému Freestyle 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a čistí za použitia proteín-A afinitnej chromatografie (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Endotoxín bol odstránený s endotoxínom Removal Kit (GenScript, Piscataway, NJ, USA), a hladiny endotoxínu boli stanovené za použitia Detection Kit endotoxínu (GenScript). Rekombinantné proteíny boli produkované ako vylučované proteíny, za použitia Freestyle 293 systému a čistí za použitia proteín-A alebo Ni-NTA chromatografiou (Qiagen, Valencia, CA, USA) pre Fc značené alebo His-proteínov, v danom poradí.}

alanín-skenovacie mutagenézy a Fab čistenie

Lokálne riadená mutagenéza pre skenovanie alanínu bolo vykonané pomocou PCR mutagenéza za použitia QuickChange Site-Directed mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Mutantný Fab proteíny boli vyjadrené a Vyčistený zhodnotiť význam jednotlivých zvyškov na väzbovú aktivitu antigénu. V stručnosti, Escherichia coli DH5a
buniek transformovaných vektorom nesúcim pComb3X mutantný gény Fab boli pestované pri 28 ° C v SB vývaru. Expresia bola indukovaná pomocou 1 mM izopropyl-p-D-1-thiogalaktopyranosidem ak je optická hustota (600 nm) kultúry dosiahne 0,8. Bunkové pelety boli resuspendované v chladenom extrakčnom pufri (120 mM Tris, pH 8,0, 0,3 mM EDTA a 300 mM sacharózy) a inkubované na ľade po dobu 30 minút pre periplazmatického extrakcie. Pridá sa chlorid horečnatý (2,5 mM) a čistého extraktu sa po odstredení k viazaniu voľného EDTA pred imobilizovaným iónom kovu afinitnej chromatografie (IMAC) čistenie. Purifikovanej Fab proteíny boli použité pre väzbové ELISA a k
_{off analýza pomocou povrchových Plasmon rezonancie (SPR).}

Afinitný maturácie

humanizovaná 1E11 klonom do vektora pComb3X vo formáte Fab bol použitý ako šablóna pre rozšírenie prekrytie polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) mutagenéza, ako bolo opísané skôr [23]. Tieto degenerované oligonukleotidy (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA) 5'-CTGCCCGAAGGTCCAGGGMNNMNNMNNMNNCTGCTGGCAGTAATAAGTAGC-3 '(reverzný) a 5'-GTCTACTATTGTGCTAGA42S43S11S11S24S14S34STTCGACTACTGGGGCCAGGG-3; (Dopredu) boli použité pre L-NNK a H-XXS knižnice, resp. N znamená A, C, G alebo T; M je C alebo A; a S je G alebo C. Číselná základnej polohy uviesť ručne zmieša nukleotidov skladajúci sa z 70% z jednej bázy a každej z ďalších troch báz 10%: 70% frekvencie základňa je G, A, T, C a po dobu 1, 2, 3 a 4, v uvedenom poradí. Pre knižnicu H-2AA, ekvimolárne zmes týchto vpred mutagénnych oligonukleotidov boli použité: 5'-GTCTACTATTGTGCTAGANNKNNKGGTGGGACCGCCTCCTTCGAC-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACNNKNNKGGGACCGCCTCCTTCGACTAC-3', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGNNKNNKACCGCCTCCTTCGACTACTGG-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTNNKNNKGCCTCCTTCGACTACTGGGGC-3' , 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGNNKNNKTCCTTCGACTACTGGGGCCAG-3 'a 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGACCNNKNNKTTCGACTAC TGGGGCCAGGG-3'. K znamená G alebo T. Po dvoch kolách rozšírenia prekrytie PCR, Fab knižnice DNA s randomizovanú CDR bola štepená Sfil, ligován do Sfil-rozštiepeného fagemidového vektora pComb3X, a elektroporácie do E
. coli ER2537
kmeň (New England Biolabs, Beverly, MA, USA).

vysokou afinitou spojiva boli vybrané za použitia rozpustného biotinylovaného HER2-ECD proteín. Korálky spojiva boli vopred ochudobnené inkubáciou fágové knižnice protilátok s 100 ul vopred blokované Dynabeads M-280 Streptavidin (Invitrogen) po dobu 1 hodiny pri pomalom otáčaní pri teplote miestnosti. Biotinylizované HER2-ECD proteín (100 nM- 12:01) sa pridá k pre-ochudobneného knižnice protilátok a inkubované po dobu 1 hodiny s rotáciou pri teplote miestnosti. Potom bolo pridané a inkubovať na rotátora po dobu 15 minút, 50 ul blokovaných streptavidínom magnetických guľôčok. Perličky boli premyté 10 krát 1 ml Tris-pufrovaný fyziologický roztok-Tween 20 (TBST) a dvakrát 1 ml PBS. Viazané fágy boli vymyté inkubácii guličiek s 1 ml 100 mM trietylamín po dobu 8 minút a potom sa neutralizuje 0,5 ml 1 M Tris, pH 7,4.

ELISA testu väzbové aktivita

Protilátky boli pridané do 96-jamkových Costar doštičkách oblasti polovice (Corning, Corning, NY, USA), produkt č 3690 potiahnuté 1 ug /ml antigénu. Po inkubácii pri teplote miestnosti po dobu 1 hodiny sa platne trikrát premyté TBST a inkubované s králičie protilátkou chrenovou peroxidázou anti-ľudský (HRP) (Pierce, Rockford, IL, USA) pre IgG a potkania anti-HA-HRP (klon F10, Roche Life Science, Bazilej, Švajčiarsko) pre Fab protilátky, resp. Doštičky boli premyté trikrát, (SurModics, Eden Prairie, MN, USA) bol pridaný tetrametylbenzidín (TMB) peroxidázový substrát a reakcia bola zastavená pridaním 1 N kyseliny sírovej (DukSan, Ansan, Kórea). Absorbancia pri 450 nm bola meraná pomocou Victor X3 nástroj (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

Surface Plasmon analýza

K
_{off analýzy fab proteínov, HER2-ECD-His proteín bol imobilná na povrch senzora CM5 čipu (GE Healthcare) s použitím metódy spojovacieho amínu pri teplote približne 2000 jednotiek odozvy (RU). Purifikovanej Fab proteíny boli injikované v koncentrácii 2 ug /ml a s prietokovou rýchlosťou 50 ul /min. Za k
off analýzu protilátok IgG, kozí anti-ľudský IgG (γ) (Invitrogen, kat. Č H10500) bol imobilná na CM5 čip senzoru s použitím aminového spájanie, a bol zachytený na protilátky 1 ug /ml počas 4 minút a stabilizovaná po dobu 5 minút pri rýchlosti prietoku 50 ul /min. HER2-ECD-His proteín bol injikovaný v koncentrácii 160 nM. Pre afinitnej meranie, protilátky boli zachytené na približne 50 RU kozí anti-ľudský IgG (gama) imobilná na CM5 čipe. HER2-ECD-His proteín bol injikovaný v koncentrácii v rozmedzí od 0 do 640 nM. Sensorgramy boli získané pre každú koncentráciu a vyhodnotené pomocou softvéru BIAevaluation. Pre epitopovou binning, IgG forma hz1E11 bol imobilná na samostatnej CM5 senzorového čipu plôch na asi 1000 jednotiek odozvy. HER2-ECD-His (320 nM) a protilátky (1 ug /ml) boli postupne pridané po dobu 4 minút a stabilizovaná po dobu 5 minút pri rýchlosti prietoku 50 ul /min.}

Životaschopnosť buniek Test

Bunky boli schovať v 96-jamkových doštičkách (Corning) v 10% FBS, obsahujúce médium a pre-kultivované po dobu 24 hodín. Tieto bunky boli ošetrené s protilátkami v uvedených koncentráciách a kultúry počas 4 dní. WST-1 činidlo (Dógen EZ-Cytox; Daeil Lab Service, Soul, Kórea) bola použitá na meranie životaschopnosti buniek. Relatívna životaschopnosť buniek sa vypočíta vydelením absorbancia každej jamky o priemernej absorbancie PBS-liečených jamiek na každej platni.

xenoimplantátu štúdie

athymických nude samice myší (Daehan biolinka, Chungbuk, Kórea ) boli injikované subkutánne do ľavej časti boku s 5 x 10 ^{6 z NCI-N87 buniek v Matrigelu (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Nádory sa nechali rásť na približne 200 mm 3 vo veľkosti, a myši boli náhodne rozdelení do skupín. Dostala zvieratá intraperitoneálne podávanie protilátok v uvedených dávkach dvakrát týždenne. Nádorové objemy boli vypočítané s použitím vzorca (L x W x W) /2, kde L predstavuje najväčší priemer nádoru a W predstavuje najmenší priemer nádoru. Dvojcestné ANOVA s opakovaným meraním a následne poštou testom Bonferroniho bola vykonaná pre štatistickú analýzu nádorových growth.All štúdií na zvieratách boli vykonané v súlade s pokynmi NIH je "Príručke pre používanie a ošetrovanie zvierat" a schváleného protokolu obdržal inštitúcie Animal Care and Use výboru spoločnosti.}

výsledky

Humanizácie 1E11 vykonaného CDR-štepením s ľudskými embryonálnymi génmi

k rozvoju humanizovanú protilátku, VH a VL sekvencie myšieho 1E11 boli porovnané s ľudským zárodočná v a J génových repertoáru pomocou IMGT /v-Quest analytických nástrojov [24]. Pre ťažký reťazec, IGHV3-48 * 03 a IGHJ4 * 01 vykazovali najvyššie homológie s 1E11 náprotivkami, zdieľa 85% a 87% identitu, resp. Pre ľahký reťazec ľudskej IGKV1-39 * 01 a * 01 IGKJ1 gény zobrazená identitu 80% a 81%, v danom poradí. Tieto ľudské gény boli vybrané ako akceptorové sekvencie na štepenie myšiach CDR. Medzi Vernier zóne, ktorá sa skladá zo zvyškov v úseku základnej štruktúry, ktoré sa podieľajú na prezentácii CDR štruktúry podporou CDR slučky [18, 25], ale iba jeden zvyšok v polohe 49 _{H ťažkého reťazca sa líšia medzi myšou a ľudskými sekvenciami. V dôsledku toho, humanizovaná 1E11, hz1E11, má iba jeden myšou zvyšky v konzervatívnych úsekoch (obrázok 1).}

väzbovú aktivitu hz1E11 k extracelulárnej oblasti (ECD) HER2 bola ekvivalentná k tomu ch1E11 (obr 2A), a afinita trastuzumabu, ch1E11 a hz1E11 bol 3 nM, 23 nM a 23 nM, v danom poradí. Zároveň potvrdil, že hz1E11 viazaný na sub-domény IV ako rodičovské ch1E11. Trastuzumab sa tiež viaže na sub-domény IV [26]. in vitro
anti-proliferačnej aktivity hz1E11 ako monoterapiu a v kombinácii s trastuzumabom boli tiež ekvivalentné k tým ch1E11 (obr 2C). V predchádzajúcej štúdii [22] bolo oznámené, že ch1E11 mal in vivo
protinádorový účinok porovnateľný s trastuzumabu v monoterapii, a kombinácia ch1E11 a trastuzumab viedlo k regresii nádoru (TGI) indexu z 95,1%. Podobne, hz1E11 ako jediný prípravok mal podobný in vivo
protinádorový účinok na trastuzumab (S1) a obr kombinácia hz1E11 s trastuzumabom tiež ukázala na dávke závislú protinádorovú aktivitu v modeli NCI-N87 xenografe myší ( obr 2D). Protilátka kombinácia liečby v dávke 1 mg /kg každý z hz1E11 a trastuzumab za následok podobné protinádorovú aktivitu s trastuzumabom jedinom ošetrení pri 10 mg /kg, a pri 2,5 mg /kg kombinácie a nad stanovený nádor stabilizované alebo začal regresia (štatisticky významný rozdiel [ P Hotel &0,05] bolo zistené u 2,5, 5, a /kg kombinácie 10 mg). Tieto výsledky ukazujú, že hz1E11 má afinitu a biologickú účinnosťou, ekvivalentné ch1E11, a že hz1E11 zvyšuje protinádorovú aktivitu trastuzumabu v kombinácii.

alanín skenovanie CDR-H3 a CDR-L3

na identifikáciu kritické zvyšky pre interakcie medzi antigénom a protilátkou, alanín skenovacia mutagenéza bola vykonaná v CDR3 oblastí ťažkého a ľahkého reťazca (CDR-H3 a CDR-L3). Účinky mutácií boli hodnotené analýzou väzbové aktivity prečistených proteínov Fab nepriamu ELISA. V CDR-H3, substitúciou alanínu v pozícii Gly98 _{H zrušila väzbu Fab na HER2, a G97 HA a T99 HA mutanty vykázali zníženú väzbovú aktivitu (obr 3A). V CDR-L3, alanín substitúcia mali oveľa menšie účinky (obr 3b). k
off hodnoty alanín skenovacia mutantov boli analyzované pomocou SPR proti immbolized HER2-ECD proteínu. Potvrdili sme, že G98A mutant ťažký reťazec úplne stratený väzbové aktivity a susedné T99 HA a G97 HA mutanty za následok 32-krát a 17-násobné zvýšenie k
off hodnotami , v uvedenom poradí (obrázok 3C). Tieto výsledky ukazujú, že ťažký reťazec Gly98 H je funkčne kritický a jeho susedné zvyšky sú tiež funkčne dôležité pre interakcie antigén-protilátka.}

Afinitný zrenia hz1E11

Afinitný zrenia hz1E11 bola vykonaná výstavbou ťažkého alebo ľahkého reťazca CDR3 variantov knižníc, nasleduje výber rovnovážnej knižníc fágového protilátok. Pre ľahký reťazec, glutamín zvyšky v polohách 89 _{L a 90 L neboli diverzifikované, pretože glutamín sa bežne vyskytujú v týchto polohách deviatich aminokyseliny longCDR-L3 sekvencie na 59% a 73% frekvencie, respektíve [ ,,,0],27]. Pozícia 91 L-94 L boli náhodne rozdelené pomocou NNK degenerované Kodona (L-NNK). Pre ťažký reťazec, pozície 95 H -100 H randomizovaných pomocou XXS Kodona (H-XXS), ktorý bol navrhnutý tak, že v prvej a druhej nukleotidových polohách diverzifikované kodóne bázy divokého typu došlo u 70 % pravdepodobnosť, každý z ostatných troch báz došlo v 10% frekvencií, a tretí písmená kodóny boli syntetizované za použitia ekvimolárne zmesi G a C (obr 4A). Spojiva s vysokou afinitou boli vybrané z vysoko stringentních alebo nízke stringence ryžovanie (Tabuľka 1).}

V porovnaní s nízkou prísnosti ryžovanie knižnice L-NNK, v ktorom 100% sekundárnych, z tretej, a štvrté guľaté výstupné klony premietané boli ELISA pozitívne, pre vysoké prísnosti ryžovanie štvrtý-guľatý výstup nepriniesla žiadne spojivá vôbec a iba jedna tretina treťom kole výstupných klonov boli ELISA pozitívne (tabuľka 1). Vybrané klony z knižnice CDR-L3 zahŕňala mnoho sekvencií, ktoré mali všetky štyri randomizovanej pozície CDR-L3 zmutovaný, na rozdiel od CDR-H3 knižníc, z ktorých väčšina vybraných klonov nerozdeleného sekvencie divokého typu v polohách 97 _{H -100 H (pozri nižšie). Rôzne stratégie ryžovanie prinieslo rôzne sekvencie s obohacovaním vzormi. Napríklad variant klon ľahký reťazec 1A12 (Q 89LQNAYAPWT 97l) sa izoluje z vysoko stringentních posúvanie, ale nie z nízkej prísnosti ryžovanie, a ťažký variant reťazca klonu 1B12 (N 95HYGGTASFDY 102H) bol vybraný len z vysoko stringentních ryžovanie. Zaujímavé je, že 59% jedinečných protilátok u 4 ^{th výstup s nízkym prísnosti ryžovanie L-NNK knižnice mali alanín v polohe 92 L, v súlade s alanín snímacie analýzou (obrázok 4B).}}

Takmer všetky klony, ktoré boli izolované z knižnice H-XXS mal rovnakú sekvenciu 97 _{H -100 H ako rodičovského klonu, a jasne ukazuje obohatenie Asn-Tyr postupne v 95-96. Pre ďalšie posúdenie príspevok zvyškov CDR-H3 na antigén-protilátka, väzba, ďalšie knižnice CDR-H3 bol konštruovaný s dvojkomorovým NNK náhodný kodónov skenovaním CDR-H3 (H-2AA, obr 4A). V low-prísnosti ryžovanie, mutanti v polohách 95 H, 96 H, 99 H, 100 H, a 100a H bolo vybrané v prvom kole ryžovanie, ale iba mutanti v polohách 95 H a 96 H boli obohatené vo štvrtom kole výstupe (tabuľka 1). Nepodarilo sa nám zistiť mutantov v polohách Gly97 H a Gly98 h za všetkých stratégií a výstupov ryžovanie.}

Affinity a väzbové aktivita vybraných klonov

Aby bolo možné posúdiť kombinovaný efekt z variantov afinitnej zrelých ťažkého a ľahkého reťazca, IgG protilátky s kombináciou z afinitnej zrelých ťažkých a ľahkých reťazcov boli vyrobené a ich k
_{off hodnoty boli určiť pomocou SPR analýzy (tabuľka 2). Medzi dvoma variantmi ľahkých reťazcov a dvoch variantov ťažkého reťazca 1A12 odvodený od L-NNK ukázali najväčšie zlepšenie (16-krát). Kombinácia ľahkého reťazca 1A12 s optimalizovaným ťažkého reťazca klonu 1B12 viedlo k 24-násobné zlepšenie K
off cez rodičovskej hz1E11, zatiaľ čo pre iné kombinácie k
off hodnoty boli podobné alebo väčšie ako 1A12. Vzhľadom k tomu, 1,5-krát Ďalšie zlepšenie kombináciou L-1A12 + H-1B12 nebola podstatne veľké, klony 1A12 a 1F11 (varianty ľahkého reťazca), boli vybrané pre ďalšiu charakterizáciu, aby sa minimalizoval rozdiel sekvencie z afinitnej zrelých protilátok z rodičovskej klon. Disociačnej konštanty pre afinitou zrejúce klony, určuje tiež SPR analýzy, bolo viac ako 10-krát nižšia ako u rodičovského klonu hz1E11 a porovnateľná s trastuzumabom (tabuľka 3).}

Na určenie, či afinita -matured hz1E11 klony sa viažu na rovnaký epitop ako rodičovský hz1E11, väzba 1A12 a 1F11 na HER2-ECD, ktorý bol vopred naviazaným k hz1E11 bola analyzovaná pomocou SPR. Oba klony boli schopné viazať sa na monomérne HER2-ECD-His proteínu zachyteného imobilná 1E11, zatiaľ čo trastuzumab mohol (obr 4C). Ďalej bolo potvrdené, že 1A12 epitop neprekrýva s tým trastuzumabu (obr 4D). Klony 1A12 a 1F11 tiež váži na sub-domény IV rovnako ako ich rodičovskej klonu hz1E11 (obr 4E). Tieto údaje naznačujú, že epitopy 1A12 a 1F11 neboli zmenené v procese zrenia afinity.

Účinnosť afinity zrel hz1E11 klony

Oba 1A12 a 1F11 protilátok preukázala mierne zvýšené anti-proliferačnú aktivity ako jediný prostriedok v porovnaní s hz1E11 na NCI-N87 a OE-19 žalúdočných nádorových bunkových línií, ktoré nadmerne exprimujú HER2 (Obr 5A a 5B), zatiaľ čo v kombinácii s trastuzumabom, ich anti-proliferačnej aktivity bola vyššia ako trastuzumab sám a ekvivalentné hz1E11 s trastuzumabom , Anti-proliferačnej aktivita 1A12 a 1F11 bol potvrdený in vivo
v NCI-N87 modelu xenoimplantátu. Superior protinádorový účinok bol zjavný v kombinácii s trastuzumabom k tomu samotného každého agenta v oboch štepov modeloch (obr 5c).

Diskusia

Napriek povzbudivým klinické výsledky získané s HER2 zacielenia trastuzumab v liečba rakoviny žalúdka, sú tu stále potrebné pre účinnejších HER2 cielenej liečby [6]. Kombinácia nesúťažia protilátok zameraných na receptory, ako je napríklad HER2, EGFR, a VEGFR3, môže zvýšiť protinádorovú účinnosť v predklinických modeloch [11-13, 28]. Pertuzumab, ďalšie HER2-protilátková zameriavači, je schválený pre použitie v kombinácii s trastuzumabom v liečbe metastatického karcinómu prsníka [29]. V predchádzajúcej štúdii sme vyvinuli nový HER2 protilátková zameriavači, 1E11, ktorý bol preukázané, že významnú protinádorovú aktivitu v monoterapii a synergický účinok v kombinácii s trastuzumabom in vitro stroje a in vivo
[22]. Protinádorová aktivita 1E11 a kombinácie trastuzumab je lepšie nielen trastuzumab jedinom ošetrení, ale aj na kombináciu pertuzumab a trastuzumabu. V tejto správe je humanizácie a následná afinitná zrenia myšieho hybridómu odvodené 1E11 monoklonálne protilátky je popísaná.

Základné postupy, ako znížiť potenciálny imunogenecita iné ako ľudské variabilné oblasti CDR-štepením do ľudského rámca výrazne znížiť imunogenicitu terapeutických protilátok [15, 17]. Superhumanization za použitia ľudských rámcov zárodočnej ako predloha bola navrhnutá ako nadradený metodiky humanizácie sa zabránilo domnelá efektorových T-bunkové epitopy odvodené od somatických hypermuations ľudskej rámca [30-32]. Bolo navrhnuté, že protilátky kódované zárodočnými génových segmentov sú konštrukčne flexibilné a schopné prispôsobiť väzbou na mnoho rôznych antigénov [33-35]. CDR myšou protilátky 1E11, ako aj jeden zvyšok v Vernier zóne V _{H (Ala49 H) boli vrúbľovať na zárodočnej línie variabilné ľudskej a spojovacie gény s najvyššou homológiou k transparentného protilátky (obrázok 1). Výsledná humanizovaná protilátka, hz1E11, ukázala takmer totožný afinitu a biologickú aktivitu transparentného protilátky (obrázok 2).}

Voľba zvyškov pre náhodnosti je kritickým krokom v cielenej náhodného prístupu afinitnej maturácie a to z praktických obmedzení protilátky veľkosti knižnice a výber technológií. Alanín skenovanie a in silico
analýze sekvencie protilátky, najmä v CDR, sú užitočné pre výber cieľových zvyškov náhodnosti a uľahčiť proces zrenia afinity. V alanínu analýze snímania CDR-H3 hz1E11 sa G98A mutant úplne stratil väzbovú aktivitu a G97A mutant, vykazovali zníženú väzbovú aktivitu (obr 3A). Priama zmena základnej zvyšku paratop obvykle vedie k úplnej strate väzbové schopnosti protilátky [26, 33, 36]. Z tohto dôvodu bol použitý viac konzervatívny prístup k CDR-H3 randomizácii, s použitím buď ručne zmiešaný oligonukleotid, ktorý je predpnutie smerom k rodičovskej sekvencie, alebo s oddelenými NNS náhodné skenovanie kodóne CDR-H3. Ako sa dalo očakávať na základe analýzy alanín skenovanie, takmer všetky klony, ktoré boli izolované z knižníc CDR-H3 mal sekvenciu 97 _{H-100a H rovnako ako rodičovský klon (G 97HGTAS 100Ah) .}

alanín výsledky skenovania ukazujú, že všetky zvyšky CDR-L3 sú postrádateľné, aj keď niektoré z mutácií zdá sa, že zníženie afinity (obr 3b). Preto, štyri pozície CDR-L3 (91 _{L-94 L) boli úplne náhodne pomocou NNK degenerovaný kodón. Sekvenčné analýza vybraných klonov potvrdila analýza alanínu skenovanie; väčšina z vybraných klonov z knižnice CDR-L3 sa všetky štyri randomizovanej pozície CDR-L3 sa zmenila z rodičovskej zvyšku, na rozdiel od optimalizácie výsledkov CDR-H3, v ktorom väčšina z vybraných klonov z knižnice mali rovnakú sekvenciu ako rodičovskej hz1E11 v strednej časti CDR (Tabuľka 1). Klony s väčšie zlepšenie afinity pochádza z knižnice CDR-L3. Je pravdepodobné, že sa CDR-H3 z hz1E11 je už blízko optimálne a väčšina mutácií, a to najmä v oblasti 97 H-100 H, sú škodlivé pre viažu, zatiaľ čo sekvencie CDR-L3 nie je ako optimálne a mutácie v tejto oblasti môžu viesť k významnému zlepšeniu afinity. Knižnica ryžovanie výstupy L-NNK boli obohatené s klony s hydrofóbnou aminokyselinou v polohe 91 L, malé aminokyseliny 92 L, a aromatickou aminokyselinou v 93 L. Tento vzor je trochu odlišné od rodičovskej CDR-L3 sekvenciu Q 89LQLYSTPWT 97l a opäť naznačuje, že CDR-L3 sekvencie rodičovskej 1E11 protilátky bol optimálny, a tak mal priestor pre afinitnej zlepšenie.}