Ploche ONE: Strata Vyjadrenie Reprimo, p53 indukované zastavenie bunkového cyklu génu koreluje s invazívnym scéne progresiu nádorov a P73 expresiu u rakoviny žalúdka

Abstract

Reprimo (RPRM), následný efektory p53 indukované zastavenie bunkového cyklu vo fáze G2 /M, bola navrhnutá ako supresorové gén nádoru putativní (TSG), a ako potenciálny biomarker non invazívne detekcie karcinómu žalúdka (GC). Cieľom tejto štúdie bolo zhodnotiť epigenetické umlčanie génu RPRM metylácie promótorom a jeho nádorové supresorové funkcie v bunkových líniách GC. Okrem toho, klinický význam RPRM proteínového produktu a jeho spojenie s p53 /P73 tumor supresorového rodiny proteínov bol preskúmaný. Epigenetické umlčanie génu RPRM metylácie promótorom bola hodnotená v štyroch GC bunkových línií. Expresia proteínu z RPRM bola hodnotená na 20 nádoru a bez nádoru uzavreté prípady. Klinický význam RPRM súvislosti s p53 /P73 tumor supresorového rodiny proteínov bola hodnotená v 114 prípadoch GC. Funkcia supresor sa skúmalo pomocou funkčných testoch. RPRM génová expresia bola v negatívnej korelácii s metylácie promótorom (Spearman rank r = 1; p = 0,042). RPRM nadmerná expresia inhiboval tvorbu kolónií a ukotvenie nezávislý rast. V klinických vzorkách, expresia génu RPRM proteínu bola detekovaná v 75% (15/20) z non-priľahlé nádorové sliznice, ale iba v 25% (5/20) žalúdočných nádorového tkaniva (p = 0,001). Klinicko-patologické korelácie straty RPRM expresie boli významne spojené s invazívnou fáze GC (fáza I a II-IV, p = 0,02) a pozitívna asociácia medzi RPRM a P73 génovej expresie proteínového produktu bolo zistené, (p 0,0001 a kappa hodnota = 0,363 ). Záverom možno povedať, epigenetické umlčanie génu RPRM metylácie promótorom je spojená so stratou RPRM expresie. Funkčné testy ukazujú, že sa správa ako RPRM TSG. Strata expresie proteínového produktu génu RPRM je spojená s invazívnou fáze GC. Pozitívne súvislosť medzi RPRM a P73 expresiu naznačujú, že ostatní členovia rodiny génu p53 sa môžu podieľať na regulácii expresie RPRM

Citácia :. Saavedra K, J Valbuena, Olivares W, Marchant MJ, Rodríguez A, Torres- Esta V, et al. (2015) Strata expresie Reprimo, p53 indukované zastavenie bunkového cyklu génu koreluje s invazívnym scéne progresiu nádorov a P73 expresiu u rakoviny žalúdka. PLoS ONE 10 (5): e0125834. doi: 10,1371 /journal.pone.0125834

Akademický Editor: Mohammed Soutto, Vanderbilt University Medical Center, Spojené štáty

prijatá: 16.januára 2015; Prijaté: 25.března 2015; Uverejnené: 08.05.2015

Copyright: © 2015 Saavedra et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje sú v papiera a jeho podporné informácie súbory

Financovanie: .. To funguje bola podporená granty CONICYT-FONDECYTo1014 (AHC) a CONICYT-FONDAP—30011 (AHC a JCR) od vlády Čile

konkurenčné záujmy :. autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

rakovina žalúdka (GC) je treťou najčastejšou príčinou úmrtí na nádorové ochorenia a piaty najviac spoločný zhubný nádor na celom svete [1]. Cez klesajúci výskyt GC, z časti kvôli uznanie určitých rizikových faktorov (napr Helicobacter pylori stroje a environmentálne faktory), zostáva jedným z najčastejších nádorových ochorení na celom svete a pokračuje byť klinická výzva [2 , 3]. Žalúdočné karcinogenézy zahŕňa postupné hromadenie genetických a epigenetických zmien, čo vedie k poruchy regulácie v expresii onkogénov a tumor supresorových génov (ZTS) [4]. Reprimo (RPRM) je novou domnelý TSG [5,6] a spojené s žalúdočnej karcinogenéze [7]. Okrem toho sme navrhli, že methylata RPRM bezbuněčný DNA môže byť potenciálny biomarker pre neinvazívnu detekcie GC o [8,9].

RPRM je vysoko glykozylovaný proteín lokalizovaný prevažne v cytoplazme a bol identifikovaná ako downstream efektor zastavenie bunkového cyklu p53 vyvolaného v G2 /M [10]. Správy naznačujú, že RPRM expresia je regulovaná dvoma mechanizmami, z ktorých jedna prechádza metylácie DNA v jeho promotorové oblasti [8] a druhý dráhy p53 [10]. Avšak, novšie štúdie neboli schopní potvrdiť tieto nálezy [6]. Na druhej strane, klinický význam RPRM bol študovaný málo [11]. V tejto štúdii sme hodnotili úlohu metylácie DNA v regulácii expresie RPRM, jej klinický význam a jeho spojenie s členmi rodiny p53 supresorového proteínu nádoru (tj. P53 a P73). Zistili sme, hustý metylácie v promotorové oblasti RPRM, ktorá bola spojená so stratou expresie v GC bunkových línií. V klinických prípadov, strata expresie bola spojená s invazivitě fáze GC. Ďalej sme pozorovali pozitívny asociácie medzi expresiou RPRM a P73, čo naznačuje, že ďalší členovia rodiny génov p53 môže byť nových kandidátov pre reguláciu expresie RPRM.

metódy

bunkových línií a vzorky tkaniva

štyri GC bunkové línie (AGS, SNU-1, KATOIII a NCI-N87) boli získané od American Type Culture Collection (ATCC), v decembri 2012, kultivované v médiu RPMI-1640 (Hyclone) a doplnená 10% fetálne hovädzie sérum (FBS) a udržiava sa pri teplote 37 ° C, 5% CO _{2. Dvadsať uzavreté v blízkosti sliznice (NTAM) vzorky nádorové a nenádorové boli vybrané pre hodnotenie RPRM výrazu. Šesť boli vybrané pre hodnotenie RPRM metylácie. Do štúdie bolo zaradených 114 pacientov GC bol vybraný pre klinicko-korelácií proteínového produktu RPRM génu. Tkanivové vzorky z jednotlivých prípadov bolo klasifikovaných v súlade s japonskou Research Society for žalúdočnej odporúčanie s rakovinou [12]. Všetky prípady sa regrutovali z Instituto de Chileno Japonesa Enfermedades Digestivas-nemocnice klinicko San Borja Arriarán (ICHJED-HCSBA), Santiago de Chile medzi 1993-2000 [13] a klinicko-funkcií sú uvedené v tabuľke 1. Táto štúdia bola schválená inštitucionálnej kontrola Doska Pontificia Universidad Católica de Chile (Comité de etike científica) a ICHJED-HCSBA (Comité de etike científica, Servicio de Salud Metropolitano Central, Santiago, Chile). Písomný informovaný súhlas bol získaný od každého účastníka zapojených do štúdie.}

Tissue microarray a Imunohistochémia

Tkanivové (TMA) sa vykonáva pomocou manuálnej Tissue Array II nástroja (Beecher Instruments), ako bolo predtým opísal [14,15]. Kľúčové úseky (4um) boli podrobené immunostaining zo strany Vectastain Elite Kit R.T.U (Vector Labs), podľa inštrukcií výrobcu. Protilátky použité v tejto štúdii boli RPRM (38 až 50, Sigma-Aldrich), p53 (klon 318-6-11, Dako Dánsko) a P73 proteín α (klon 24, Novacastra). Výsledky imunobarvení v celom nádoru a NTAM, rovnako ako TMA úseky boli považované za pozitívny na RPRM chcete > 30% z epitelových buniek ukázala, cytoplazmatickej farbenie, > 10% jadrovej farbenie na p53, alebo > 10% jadrovej /cytoplazmatickej farbenie na P73 , Vyhodnotenie imunohistochemické farbenie bolo vykonané nezávisle na sebe dvomi patológmi (JV & GC)., Ktorí boli oslepení na klinických údajov

bisulfitová sekvencovania a kvantitatívnej RT-PCR analýzu expresie

DNA z bunkových línií bola GC extrahuje TRIzolu činidlá (Life Technologies) podľa protokolu výrobcu, nasledovaný hydrogensiričitanovú premenou pomocou EZ metylácie DNA Gold kitu (Zymo Research). RPRM promótorom bol amplifikovaný z hydrogensiričitanovú upravenej DNA, za použitia primérov 5'-RPRM_B_FW TTGTAAAAGTAAGTAATAAAAAGTAAG-3 'a 5'-RPRM_B_RV CTACTATTAACCAAAAACAAAC-3', čo umožňuje detekciu 52 CPG miest v 509-bp promótorom. PCR produkty boli čistené pomocou súpravy pre gélovú extrakciu QIAXEN II (Qiagen) a ligovány do pGEM-T vektora. Produkt ligácia bol použitý na transformáciu kompetentných E
. coli TOP10
bunky, v súlade s postupom opísaným v Inoue et al. [16]. Transformanty sa selektovali na LB agarových platniach doplnených ampicilín (100 ug /ml), X-Gal (50 mg /ml) a IPTG (100 mM). Vzniknuté biele kolónie boli hodnotené kolóniou-PCR. Pozitívne klony boli pestované v tekutom médiu (LB /ampicilín) tak, neskoré exponenciálnej fáze (OD600 = 1) a DNA plazmidy boli purifikované s použitím čistého Výťažok miniprep systém súpravy (Promega). Promotorová oblasť RPRM bola sekvenovania za použitia univerzálne M13 (W 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3 'a 5'-RV CAGGAAACAGCTATGAC-3'), ktoré Macrogen (http://dna.macrogen.com). BIQ softvér pre analýzu bol použitý pre analýzu sekvenčných klonov. Všetky pozitívne pGEM-T klony boli kultivované na LB /ampicilín médiom a skladované pri -80 ° C (v 14% glycerolu). Celková RNA bola extrahovaná za použitia TRIzolu činidla (Invitrogen) a cDNA sa syntetizuje za použitia iScript cDNA Synthesis Kit podľa inštrukcií výrobcu (BIORADE). Následne, cDNA bola použitá pre každú PCR reakciu s každým pár priméru. Tieto RPRM špecifické primery: 5'-RPRM_FW GAGCGTAGCCTGTACATAATGC-3 'a 5'-RPRM_RV CCTTCACGAGGAAGTTGATCAT-3'. Real time RT-PCR analýza bola vykonaná za použitia LightCycler rýchly štart DNA MasterPlus SYBR Green I (Roche) v LightCycler 1.5 systéme Real-Time Detection (Roche). Relatívna kvantitatívna analýza normalizované na RPL-30 bol vykonaný pomocou porovnávacej prah cyklu spôsobom [17]. V RPL-30 špecifické primery sú nasledovné :. RPL-30_Fw 5'-ACAGCATGCGGAAAATACTAC-3 'a 5'-RPL30_RV AAAGGAAAATTTTGCAGGTTT-3'

validáciu RPRM protilátky metódou imunoblotu a imonufluoreskujúca

3x10 ^{5 AGS bunky boli prechodne transfekovány pCMV6 /RPRM alebo pCMV6 (origen) prázdnym vektorom, za použitia Lipofectamine 2000 (Invitrogen), podľa protokolu výrobcu. Štyridsať osem hodín po transfekciu boli bunky inkubované po dobu 24 hodín v RPMI 1640 s 10% FBS v prítomnosti alebo neprítomnosti inhibítora N-glykozylácie Tunicamicyn (10 ng /ml). Bunky boli zozbierané a celé fragmenty buniek boli získané za použitia Triton pufri (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M NaCl, 0,5% Triton X-100) s Protease Inhibitor Cocktail Kit (P8340, Sigma Aldrich) a fosfatázy Inhibítor Cocktail Kit ( sc-45045, Santa Cruz Biotechnology). Proteínové koncentrácie boli stanovené pomocou Quick Start Bradford činidlo (Bio-Rad). Päťdesiat ug proteínu, boli separované na SDS-PAGE 4% na 12%. Proteínov na géloch boli elektroblotovány na polyvinylidendifluoridovou membránu za použitia mini transblotter systému (Bio-Rad, Hercules, CA). Na polyvinylidendifluoridovou Membrány boli blokované v 5% mlieku v Tris-pufrovanom soľnom roztoku /Tween 20 (TBST) po dobu 1 hodiny. Primárna protilátkou anti-RPRM (38 až 50, Sigma-Aldrich) bol zriedený 1: 1000 v TBST /3% BSA /a membrány boli inkubované v primárnej protilátky pri teplote 4 ° C cez noc. Membrány boli trikrát premyté v TBST za každých 10 min. Anti-králičie peroxidáze konjugovanou sekundárnou protilátkou (Santa Cruz) bol zriedený 1: 2000 v TBST a inkubujú sa na membránach po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Membrány boli premyté ako je uvedené vyššie a vizualizované za použitia SuperSignal West Pico Chemoluminiscenčný substrát (Pierce) podľa protokolu výrobcu. Na vyhodnotenie bunkovej umiestnenie RPRM, bolo vykonané imunofluorescenčný test. AGS bunky prechodne transfekované pCMV6-RPRM alebo pCMV6 boli pestované na krycie sklíčko. Sú prechodne transfekovány AGS bunky boli fixované v 4% paraformaldehydu po dobu 20 minút pri teplote miestnosti a potom sa premyje trikrát vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátmi (PBS). Bunky boli permeabilizovány v 0,1% Triton-X-100 (Sigma-Aldrich) po dobu 10 minút, blokované v 3% BSA po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti, a následne sa značená anti-RPRM protilátky (1: 1000, 38-50, sigma-Aldrich). Po premytí PBS boli bunky inkubované s Alexa Fluór 488-konjugovanou protilátkou (1: 200, Molecular Probes, Invitrogen) po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Snímky boli získané pomocou fluorescencie laserovou skenovacej konfokálna mikroskopia (pozri podporné informácie S1 a S2 obr).}

Bunková kultúra a transfekcia

Pre stabilné transfekční pokusy, AGS bunky boli nanesené na 3x10 ^{5 buniek /100 mm kultivačných misiek a po 24 hodinách po transfekciu s pCMV6-RPRM alebo pCMV6 (origen) prázdnym vektorom za použitia Lipofectamine 2000 (Invitrogen), podľa protokolu výrobcu. Štyridsať osem hodín po transfekciu boli bunky kultivované za rovnakých podmienok s G418 (500 g /ml). Kultivačné médium bolo menené každých 24 hodín po dobu 14 dní.}

Colony testu tvorenie

testu tvorby kolónií, 200 bunky stabilne transfekované pCMV6-RPRM alebo pCMV6 prázdnym vektorom. Bunky boli kultivované v médiu RPMI-1640 (Hyclone) a doplneného 10% FBS. Kultivačné médium bolo menené každých 24 hodín. Kolónie boli zafarbené s použitím 0,4% kryštalickej fialovej (Sigma) v 50% metanolu, 21 dní po počiatočnom naočkovaní a spočítanie na 20 snímok urobených v rámci inverzného mikroskopu (Evos XL Jadro Cell Imaging System, Life Technologies). Každá transfekcia bola vykonaná trikrát. Okrem toho, sa replikujú experimenty boli vykonané za účelom získania ďalšie klony pre analýzu expresie.

Anchorage Rast nezávislý test

Anchorage nezávislý rast buniek bol analyzovaný nanesením 1% agaróza obsahujúce 2x10 ^{5 buniek stabilný prenesené pCMV6-RPRM alebo pCMV6 prázdnym vektorom v 6-jamkových doštičkách. Bunky boli kŕmené raz týždenne od prekrývajúce čerstvý roztok soft-agar, a kolónie boli vyfotografované po 4 týždňoch inkubácie. Tento experiment bol vykonaný v troch opakovaniach.}

Štatistická analýza

Spearmanův korelačný koeficient bol vypočítaný pre analýzu korelácie medzi RPRM metylácie a hladiny génovej expresie. Kategorické premenné boli analyzované Pearson Chi-kvadrát test (obojstranný), p-hodnota bola opravená použitím logistickej regresnej analýzy. Kontinuálne premenné boli analyzované pomocou Studentovho t
testu a dáta bola vyjadrená ako priemer ± SD. Kappa test bol použitý pre analýzu korelácie medzi expresiou RPRM a P73 expresiu. Štatistické analýzy boli vykonané pomocou SPSS verzia 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) štatistický balíček a software GraphPad Prism5 (La Jolla, CA, Spojené štáty). Všetky hodnoty boli dvojstranný, s výnimkou Spearman poradové korelácia. Štatistická významnosť bola definovaná ako P < 0.05.

Výsledky

RPRM metylácie a expresie v bunkových líniách karcinómu žalúdka

Predtým sme aj iní hlásili, že RPRM výraz môže byť obnovená demetyláciou agenta 5-aza -2-deoxycitidin (Pozri podporné informácie S3 a S4 figy) [5,8,18]. Avšak RPRM metylácie bola slabo koreluje s jeho expresie [18]. Pre ďalšie posúdenie spojenie medzi RPRM metylácie promótorom a expresie génov, kompletný promótor región RPRM génu bola analyzovaná DNA hydrogensiričitanovú sekvencovania v štyroch GC bunkových líniách (AGS, SNU-1, KATO III a NCI-N87) (obr 1A). To znamená, že stav metylácie CPG miest 52, ktorá sa nachádza medzi -207 a +302 nukleotidov vzhľadom k počiatku transkripcie (TSS), boli analyzované. Táto analýza ukazuje, hustý metylácie v bunkových líniách AGS a SNU-1 (89,6% a 86%, v danom poradí), v porovnaní s KATO III a NCI-N87 (79,7% a 51,8%, v uvedenom poradí), (p = 0,0002) (obr 1B) , Ďalej hladina RPRM expresie bola stanovená kvantitatívnej RT-PCR. Nízka expresia RPRM génu bola pozorovaná u AGS a SNU-1 v porovnaní s KATO III a NCI-N87 bunkových línií (p 0,0001) (obr 1C). Tým, korelačný analýza Spearmanův bola zistená značná miera bola nájdená negatívna korelácia medzi hustotou metylácie a génovej expresie RPRM (r = -1; p = 0,042) (obr 1D). Dohromady tieto nálezy naznačujú, že metylácie RPRM promotorové oblasti podstatne úlohu v regulácii RPRM prejavu.

RPRM metylácie a expresie v žalúdočných rakovinových tkanív

potvrdiť predchádzajúce dáta v GC tkanivách hladiny RPRM metylácie boli stanovené v 6 párovaných vzorkách nádorov a NTAM. Výsledky ukazujú vyššie úrovne metylácie v nádorových tkanivách v porovnaní s NTAM tkanív (viď obr 1E). Vyšetrovať expresiu proteínového produktu RPRM génu v tkanivách GC IHC bola vykonaná analýza. Pozitívne RPRM expresia bola pozorovaná hlavne v cytoplazme žalúdočných epiteliálnych buniek. RPRM génová expresia proteínu bola detekovaná u 75% (15/20) zo NTAM tkanív vzoriek. Avšak iba 25% (5/20) z nádorových vzoriek ukázala expresiu RPRM génu proteínového produktu (obrázok 2). Tieto rozdiely boli vysoko významné (p = 0,001), a naznačujú, že expresia RPRM je stratený v GC tkanivách. Zhodnotiť klinický význam tejto straty RPRM expresie bola hodnotená kohorta 114 prípadoch GC. Strata RPRM expresia bola nájdená u 62% (71/114) prípadov GC. Klinicko-patologické korelácie RPRM expresie sú uvedené v tabuľke 1. progresii stupňa I GC na stupňoch II-IV (p = 0,006) a lymfatických uzlín (p = 0,037) boli významne spojené so stratou expresie proteínového produktu génu RPRM. Avšak, logistické regresná analýza ukázala, že iba postup zo stupňa I až II-IV, je významne spojená so stratou RPRM génu proteínového produktu (p = 0,020).

Funkčný test RPRM v karcinómu žalúdka (tvorba kolónií a ukotvenie -independent rast)

Vzhľadom k tomu, strata RPRM expresie bola spojená v GC a hlavne s progresiou stupňa i až II-IV, je nádorový supresor úloha RPRM môže byť vierohodné. Z tohto dôvodu, funkčné testy, ako je vitro
formácie kolónií a testy rast na ukotvenie nezávislý boli vykonané na AGS bunke prenesené pCMV6 /RPRM (obr 3A). Non-exprimujúce AGS bunkové línie prenesené RPRM expresnými plazmidy vykazovali významne znížený počet kolónií v porovnaní s prázdnym vektorom pCMV6 - transfekované bunkové línie transfekované pCMV6-prázdnym vektorom (p menšie ako 0,05) (obr 3b). Účinok RPRM nadmerné expresie na rast na ukotvenie nezávislý na mäkkom agare testu tvorby kolónií bola tiež hodnotená na stabilných transfekciou AGS bunkové línie klonov. Kolónie boli počítané po prvom očkovaní a inkubácii na mäkkom agare počas 4 týždňov. Bunky transfekované prázdnym vektorom ukázala silný rast kolónií, podľa počtu a veľkosti kolónií. To sa výrazne znižuje, keď RPRM bola znovu exprimovaný v bunkách AGS (obr 3C).

Združenie RPRM expresie a p53 /P73 nádorového supresor rodiny proteínov v žalúdku rakoviny

RPRM bola definovaná ako p53 sprostredkovanej génovej v embryonálnych fibroblastov [18]. Avšak, bolo popísané, že regulácia RPRM expresie môže byť nezávislý na stave p53 génu v nervových bunkách ošetrených s meďou [19]. Na druhú stranu P73 môže aktivovať transkripciu p53-responzívne génov [20]. S ohľadom na toto nastavenie, sme hodnotili expresiu p53 a iný člen rodiny proteínov p53, P73 TSG. Expresia p53 bol lokalizovaný v jadrách buniek žalúdočnej sliznice. Pozitívna expresia p53 bola detekovaná v 23,5% (20/114) prípadov GC. Iba veľkosť nádoru bola spojená s expresiou p53 (p = 0,035, tabuľka 2). Expresia P73 sa nachádza v bunkových jadrách a cytoplazme epitelových buniek. Pozitívna expresia P73 bola nájdená u 30,6% (34/114) zo vzoriek GC. Je zaujímavé, že významné klinicko-patologické korelácie P73 expresie boli spojené s invazívnou fáze (fáza I 55,6%, 10/18 na stupňoch II-IV 25,8%, 24/93, p = 0,012) a lymfatických uzlín (p = 0,038) (tabuľka 2 ). Pretože straty expresie RPRM a P73 génu bielkoviny majú podobné klinicko-korelácia, sme hodnotili vzťah medzi prejavmi hladiny oboch proteínov. Za týmto účelom prípady boli rozdelené do štyroch skupín podľa expresiu RPRM a P73 proteínových produktov. Analýza ukázala, že 22 z 111 prípadov GC boli pozitívne na oba RPRM a P73 proteínmi, zatiaľ čo 57 z 111 boli negatívne. Táto asociácia bol štatisticky významný (p 0,0001). S hodnotou kappa 0,363 (tabuľka 3)

Diskusia

RPRM je vysoko glykozylovaný cytoplazmatický proteín, pôvodne identifikovaný ako downstream efektor p53 indukované zastavenie bunkového cyklu vo fáze G2 /M. Predtým bolo navrhnuté, že RPRM je umlčaný metylácie promótorom, hoci to bolo slabo koreluje s jeho expresie [5,8]. Okrem toho, RPRM bola navrhnutá ako domnelého nádorového supresorového génu v karcinómom obličiek a nádory hypofýzy [5,6]. V tejto štúdii sme preukázali, že RPRM expresie génu sa silne spojený s jeho promotorové oblasti metylačného statusu, čo naznačuje, epigenetické umlčanie RPRM génovej expresie. Okrem toho ukazujeme, že RPRM génu proteínového produktu bol znížený na GC tkanive v porovnaní s nerakovinnými žalúdočnej sliznice. Tieto výsledky sú podobné ako u Luo a kol
. [11], ktorý ohlásil stratu RPRM v GC v porovnaní so vzorkami žalúdočný vred tkanív. Okrem toho, naše zistenia o strate expresie RPRM v prechode z fázy I fáz II-IV, je klinicky relevantná. Luo et al
. [11] opisuje podobnú zistení, ale v malom množstve stupňa I GC prípadov (n = 15). Tieto nálezy môžu mať klinický význam ako prediktívne faktor pre progresiu GC. V súlade s touto stratou RPRM výrazu v progresii GC, našich funkčných testoch (tvorba kolónií a ukotvenie nezávislý rast) navrhol, predpokladaný tumor supresorové úlohu RPRM v GC.

Hoci p53 bol pôvodne opísaný ako RPRM cievky [10], klinické štúdie vykonané až doteraz neboli schopní potvrdiť takéhoto nálezu [6,18]. Tu sme zistili, že strata RPRM expresie koreluje so stratou expresie iného člena rodiny p53, P73. Aj keď P73 TSG je exprimovaný na veľmi nízkej úrovni v normálnych ľudských tkanivách [21], je nadmerne exprimovaný v mnohých rôznych ľudských nádorov ako je rakovina prsníka, neuroblastómu, pľúc, pažeráka, žalúdka, hrubého čreva, močového mechúra a vaječníkov [14,22]. Okrem toho bolo opísané, že P73 môže aktivovať transkripciu p53-responzívne gény, vrátane p21Waf1 /Cip1, Bax, MDM2, cyklin-G, GADD45 a IGFBP3 [20]. Teda na základe našich zistení, navrhujeme, aby RPRM expresia by mohla byť regulovaná P73 v p53-nezávislé spôsobom.

Stručne povedané, naše údaje naznačujú, že epigenetické umlčanie génu RPRM metylácie promótorom je spojená so stratou RPRM expresie a podľa toho, funkčné testy navrhnuté putativní supresorové nádorový úlohu RPRM v GC. V klinických vzorkách, RPRM je stratené pri invazívnych fázach GC a jeho expresie koreluje s účinnosťou P73, čo naznačuje, že ďalší členovia rodiny génov p53 sa môžu podieľať na regulácii expresie RPRM. Ďalší výskum je zaručené, že charakterizovať úlohu RPRM v progresii GC a overovanie biologických reguláciu RPRM tým P73.

Podporné informácie
S1 dát. . Údaje z ktorého štúdiu
doi: 10,1371 /journal.pone.0125834.s001
(ZIP)
S1 Obr. Účinky na Tunicamicyn RPRM proteínu.
RPRM je vysoko glykozylovaný cytoplazmatický proteín vizualizovať do 25 kD pomocou Western Blot je tunicamycin inhibítora glykozylácie (TK), premiestni 25 kD RPRM pásmo až 15 kD v bunkách s AGS RPRM nadmernej expresie (pCMV6 /RPRM) (RPRM predpovedal veľkosti 12 kD). Bunky boli inkubované po dobu 24 hodín v RPMI 1640 s 10% FBS v prítomnosti alebo neprítomnosti inhibítora N-glykozylácie tunicamicyn (10 ng /ml). RPRM expresia bola stanovená Western blot s použitím RPRM polyklonálnej protilátky (horný panel, riedenie 1: 1000, Sigma-Aldrich). Expresie beta-aktínu (dolný panel, riedenie 1: 2000, Santa Cruz) predstavuje zaťaženie bielkovín
doi :. 10,1371 /journal.pone.0125834.s002
(TIF)
S2 Obr. Lokalizácia RPRM výraz v expresiou AGS bunkové línie imonufluoreskujúca RPRM v žalúdku rakoviny AGS bunkové línie prenesené pCMV6 vektorom kódujúcim RPRM.
24 h po transfekciu bunky boli fixované v paraformaldehydu 4% a inkubované s anti-RPRM-králika (1 : 1000, 38 až 50, Sigma-Aldrich) a sekundárnou protilátkou Alexa Fluór-488 (1: 200, Molecular Probes, Invitrogen). Pozitívne vyjadrenia RPRM (zelená) je vidieť hlavne v cytoplazme. Snímky boli zachytené pri použití axióma Vision4 multikanálového softvéru vo fluorescenčným mikroskopom axióma Scope.A1- Zeiss
doi :. 10,1371 /journal.pone.0125834.s003
(TIF)
S3 Obr. RPRM expresia je umlčaná metylácie promótorom.
A) RT-PCR analýza expresie mRNA v RPRM AGS žalúdočné rakovina bunkové línie s a bez inhibítora DNA metylácie 5-azacytidin (1 uM počas 72 hodín). GAPDH bola použitá ako kontrola. B) Amplifikácia RPRM metyláciou špecifický PCR AGS žalúdočné rakovina bunkové línie. Amplifikácia metylovaného MYOD1 bol použitý ako kontrola. bunková línia AGS sa methyluje v oblasti promotora. NC: negatívna kontrola
doi :. 10,1371 /journal.pone.0125834.s004
(TIF)
S4 Obr. RPRM expresia je umlčaný metylácie promótorom (pôvodné gél).
) RT-PCR analýzy expresie mRNA v RPRM AGS žalúdočné rakovina bunkové línie s a bez inhibítora DNA metylácie 5-azacytidin (1 uM počas 72 hodín). GAPDH bola použitá ako kontrola. B) Amplifikácia RPRM metyláciou špecifický PCR AGS žalúdočné rakovina bunkové línie. Amplifikácia metylovaného MYOD1 bol použitý ako kontrola. bunková línia AGS sa methyluje v oblasti promotora. NC :. Negatívna kontrola
doi: 10,1371 /journal.pone.0125834.s005
(TIFF)

Poďakovanie

Radi by sme poďakovali Sabina Magedson za jej prínos v budove tkanivová. Radi by sme tiež poďakovali Hiroshi Kawachi pre histologické preskúmanie prípadov, Ignacio Wichmann za ich cenné pripomienky k našej rukopisu a Oslando Padilla za jeho významnú podporu pri štatistickej analýze.

• Ploche ONE: Affinity Zrenie monoklonálne protilátky 1E11 cielenými náhodnosti v regiónoch CDR3 optimalizuje terapeutickú protilátkou zacielenie HER2-pozitívnych žalúdočné Cancer
• Ploche ONE: Chrysin Zabraňuje nádoru Promoter vyvolanej MMP-9 Vyjadrenie tým, že blokuje AP-1 cez potláčanie EKR a JNK dráh v žalúdku nádorových buniek