Ploche ONE: Chrysin Zabraňuje nádoru Promoter vyvolanej MMP-9 Vyjadrenie tým, že blokuje AP-1 cez potláčanie EKR a JNK dráh v žalúdku nádorových buniek

abstraktné

Cell invázia je kľúčovým mechanizmom nádorových metastáz a malignity. Matrix metaloproteinázy-9 (MMP-9), je dôležitým proteolytický enzým podieľajúci sa na procese inváziu nádorových buniek. Vysoké hladiny expresie MMP-9 u karcinómu žalúdka pozitívne koreluje s nádorovú agresivitou a majú významný negatívny koreláciu s časmi prežitia pacientov. V poslednej dobe, mechanizmy potlačenie MMP-9, ktorú phytochemicals sú stále predmetom vyšetrovania. Chrysin, prirodzene sa vyskytujúca chemická látka v rastlinách, bola hlásená k potlačeniu metastázovaniu nádorov. Avšak, účinky chrysin na MMP-9 expresie v karcinómu žalúdka neboli dobre preštudovaný. V tejto štúdii sme testovali účinky chrysin na MMP-9 expresiu v rakovinových bunkách žalúdka, a určuje jeho základný mechanizmus. Skúmali sme účinky chrysin na MMP-9, expresiu a aktivitu prostredníctvom RT-PCR, zymografií, promótorom štúdie, a western blotting v ľudských nádorových bunkách žalúdka AGS. Chrysin inhibuje forbol-12-myristát-13-acetátom (PMA) indukovaná expresia MMP-9 v spôsobom závislým od dávky. Za použitia AP-1 vějička oligodeoxynukleotidy, sme potvrdili, že AP-1 bolo veľmi dôležitá transkripčný faktor pre MMP-9 expresie. Chrysin zablokované AP-1 prostredníctvom potlačenie fosforylácie c-Jun a c-Fos prostredníctvom blokovanie /2 a ERK1 /2 dráhy JNK1. Okrem toho, AGS bunky vopred ošetrené s PMA vykazovala výrazne lepší invazívnosti, ktorý bol čiastočne zrušený chrysin a MMP-9 protilátky. Naše výsledky naznačujú, že Chrysin môže pôsobiť aspoň časť svojho protinádorového účinku tým, že riadi expresiu MMP-9 prostredníctvom potlačenie AP-1 aktivitu prostredníctvom bloku JNK1 /2 a ERK1 /2 signálnych dráh v karcinómu žalúdka AGS buniek.

Citácia: Xia Y, Lian S, Khoi PN, Yoon HJ, Joo YE, Chay KO, et al. (2015) Chrysin inhibuje nádor Promoter vyvolanej MMP-9 Vyjadrenie tým, že blokuje AP-1 cez potláčanie EKR a JNK dráh v žalúdočnej rakovinové bunky. PLoS ONE 10 (4): e0124007. doi: 10,1371 /journal.pone.0124007

Akademický Editor: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, Spojené štáty americké

prijatá: 05.10.2014; Prijaté: 09.03.2015; Uverejnené: 15.apríla 2015

Copyright: © 2015 Xia et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje sú v novinách

Financovanie :. Táto práca bola podporená grantom výskum (0720570) z National Cancer Center (www.ncc.re.kr), dotácie Basic Science Research Program prostredníctvom National Research Foundation of Kórea (NRF) financovaný Ministerstvom školstva, vedy a technológie (2010-0009910, www.moe.go.kr) a Medical Research Center (2012-000-9442) grant od kórejského Science and Engineering Foundation ( www.nrf.re.kr). Všetky vyššie uvedené investori nemal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

rakovina žalúdka v súčasnej dobe radí na druhé miesto v celosvetovej úmrtnosti na rakovinu, sa odhaduje 990.000 nových prípadov a 738,000 úmrtí na rakovinu vzniknutých po celom svete každý rok, aj keď incidencia karcinómu žalúdka sa v posledných niekoľkých desaťročiach [1,2] znížil. Distant orgán alebo tkanivo metastáza je znamením zlou prognózou u pacientov s karcinómom žalúdka. Metastáza je najviac fatálne charakteristika zhubných nádorov, čo predstavuje viac ako 90% uhynutých zvierat s nádorom súvisiace [2]. Bolo preukázané, že chemoterapia a radiačná terapia môže významne predĺžiť a zlepšiť kvalitu života pacientov v tých prípadoch, [3,4]. Nádorové bunky metastáz je veľmi zložitý proces, ktorý zahŕňa množenia sa, migrácie, invázie, adhézie a následné a angiogenézy v iných orgánoch alebo tkanivách [3].

Vzhľadom k tomu, invázie, je jednou zo základných vlastností malígnych nádorových buniek, riadenie invázie, je dôležitým terapeutickým cieľom. Bunka-extracelulárnej matrix (ECM) interakcie, odpojenie intercelulárnej adhézie, degradáciu ECM, a invázie do lymfatických ciev a sú dôležité kroky rakoviny invázie a metastáz [5]. Invázia tumoru vyžaduje zvýšenú expresiu matrixových metaloproteinázy (MMP) [6]. MMP, rodina endopeptidáza zinok-dependentný rakoviny, ktoré indukujú bunkovú inváziu a šírenie, hrajú rozhodujúcu úlohu v metastáz cez degradácii ECM a bazálnej membrány [7]. Matrix metaloproteinázy-9 (MMP-9), známy ako 92 kDa typu IV kolagenázy alebo gelatináza B, je jednou z najdôležitejších MMP, a je kódovaný génom MMP-9 u ľudí [8]. Bolo oznámené, že nadmerná expresia MMP môže zvýšiť nádorových buniek a metastáz oddelenia, ktoré sú spojené s malígnym stavom a zlým klinických výsledkov v rôznych druhov rakoviny, vrátane rakoviny žalúdka [9,10].

Vzhľadom k funkcii MMP 9 v priebehu malignity, potlačenie hladín MMP-9 je dôležitou stratégiou pre riadenie rakoviny. V posledných rokoch sa stále viac a viac pozornosť bola zameraná na zistenie inhibítor MMP-9, a to najmä z prirodzene sa vyskytujúcich materiálov. Kim et al. zistili, že silibinín inhibuje PMA-indukovanú expresiu MMP-9 prostredníctvom potlačenie EKR fosforylácie v MCF-7 ľudských buniek rakoviny prsníka [11]. V poslednej dobe, Khoi a kol. uvádzajú, že (-) - epigalokatechín-3-gallát bloky nikotínu-indukovanej expresie MMP-9 a invazívnosť prostredníctvom potlačenie NF-kB a AP-1 na endotelových bunkách ECV304 [12]. Chrysin, 5,7-dihydroxyflavone, druh prirodzene sa vyskytujúce flavonoid, bolo známe, že inhibujú angiogenézu a metastázy [13,14]. Lin et al. preukázané, že potláča Chrysin IL-6 indukovanú angiogenézu cez down-reguláciu rozpustný receptor IL-6 /gp130 /JAK1 /STAT3 /VEGF signálnej dráhy [13]. V poslednej dobe sa uvádza, že Chrysin by mohli zvýšiť apoptózu kaspasy závislá na regulovaný TRAIL v HCT 116 bunkovej línii a CNE1 buniek [15]. Yang et al. zistili, že Chrysin potlačená invázie buniek v spôsobom závislým od dávky v TNBC bunkách. Okrem toho Chrysin znižuje tvorbu metastáz molekuly, spojené s vimentin, slimáky a slimáky, a blokuje Akt signálne dráhy [16]. Avšak, inhibičné účinky na chrysin MMP-9, ako aj mechanizmus, neboli dostatočne skúmaný, a to najmä v rakovinových bunkách žalúdka. V tejto štúdii sme skúmali účinky chrysin o PMA-indukovanú MMP-9 expresie v karcinómu žalúdka, a ukázalo sa jej základný mechanizmus.

Materiály a metódy

Bunková kultúra a kultivačné podmienky

AGS rakovina žalúdka bunková línia bola získaná z American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Bunky boli kultivované v RPMI-1640 doplnenom sérom 10% fetálne bovinné (FBS) a 0,6% penicilínu-streptomycínu pri teplote 37 ° C v atmosfére obsahujúcej 5% CO _{2. Na stanovenie účinkov chrysin na PMA indukovanú expresiu MMP-9, boli bunky vopred ošetrené rôznymi koncentráciami chrysin a potom sa spracuje s PMA. Hladina MMP-9 messenger RNA (mRNA) bola stanovená reverznej transkripcie-polymerázovej reťazovej reakcie (RT-analýzy PCR). Úloha špecifických signálnych dráh v PMA-indukovanej expresie MMP-9 boli skúmané predbežným spracovaním buniek AGS s inhibítorom PD98059 EKR 1/2 (New England Biolabs, Beverly, MA), pričom SP600125 inhibítora JNK (Calbiochem, La Jolla , CA) sa SB203580 inhibítor p38 MAPK (Calbiochem, La Jolla, CA), a Chrysin (Sigma Aldrich, USA) po dobu 1 hodiny pred stimuláciou s PMA.}

životaschopnosť buniek

Cells ( 5 x 10 ^{3) boli inkubované v 96-jamkové doštičke v médiu RPMI s 10% FBS s obsahom 0-100 uM chrysin po dobu 24 hodín, a bunkového dýchania bola stanovená zavedená 3- [4,5-dimetyl-thiazol-2 yl] -2,5-difenyltetrazolium bromid (MTT; Sigma-Aldrich) test. Po inkubácii 10 ul 5 mg /ml MTT bolo pridané do každej jamky 96-jamkové doštičky a inkubované pri 37 ° C po dobu 2 hodín. Formazánu Získané granule boli rozpustené v 100% dimetylsulfoxidu, a absorbancia pri 570 nm bola detekovaná s 96-jamkové ELISA čítačkou (Biotek Inc., Winooski, VT, USA).}

Želatína zymografie

Bunky vopred ošetrené s alebo bez chrysin po dobu 1 hodiny boli ošetrené 100 nM PMA počas 20 hodín. Po inkubácii sa vybralo supernatantu média a vykonáva želatínu zymografií skontrolovať MMP-9 aktivitu. Následne sa médium sa zmieša s rovnakým objemom 2P-9 activityrazolium B [62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 25% glycerol, 4% SDS a 0,01% brómfenolovej modrej] a vloží do 7,5% akrylamidu na: bisacrylamide (29: 1, Bio-Rad, USA) gél obsahujúci 625 ug /ml želatíny (Sigma). Po elektroforéze bol gél premytý 2,5% Triton X-100 trikrát (20 minút na čase), a potom inkubované po dobu 24 hodín pri teplote 37 ° C, v inkubačnom pufri [50 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl, 5 mM CaCl _{2 a 1 uM ZnCl 2]. Gély boli farbené Coomassie Brilliant Blue R250 (Bio-Rad, USA) po dobu 3 hodín, a potom sa opláchnu. Proteolytické aktivita sa prejavuje ako jasná pásom proti modrom pozadí zo sfarbených želatíny. Kontrola zaťažovania želatíny zymografií: Coomassie brilantná modrá R-250 moridlo na 10% dodecylsulfát sodný polyakrylamidovom gélu bez želatíny, ukázať rovnaké množstvo supernatantu bolo nanesené na každej dráhy}

reverznej transkripcie-PCR
<. p> Celková RNA bola extrahovaná z buniek za použitia TRIzolu činidla AGS (Invitrogen). Jeden ug celkovej RNA bolo použité pre syntézu prvého vlákna DNA komplementárna s použitím náhodných primerov a M-MLV transkriptázy (Promega). Komplementárna DNA bola podrobená PCR amplifikácii s primérov pre GAPDH a MMP-9 s použitím PCR master mix riešenia (intronom, Kórea). Špecifické priméry sekvencie boli nasledovné: GAPDH zmysel, 5'-TTG TTG CCA TCA ATG ACC CC-3 'a antisencie GAPDH, 5'-TGA CAA GGT CGT AGT GG TGA-3' (836 bp); a MMP-9 zmysel, 5'-AAG TGG CAC CAC CAC AAC AT-3 'a MMP-9 antisencie, 5'-TTT CCC ATC AGC GCC ATT GT-3' (497 bp); c-Jun sense 5'-GGA AAC GAC CTT CTA TGA CGA TGC CCTCAA-3 ', a c-Jun antisencie, 5'-GAA CTC CCC CTG CTC ATC TGT GTT CAC CTT-3' (287bp); c-Fos sense 5'-CAG TCA GAT CAA GGG AAG CCA CAG ACA TCT-3 'a c-Fos antisencie, 5'-GAA GAT GGC TAA TGC AGC CAA ATG CCG CA-3' (246bp). Podmienky PCR boli nasledovné :. Denaturácia pri teplote 94 ° C počas 30 sekúnd, teplotná hybridizácia pri 52 ° C počas 20 sekúnd a predĺženie pri 72 ° C počas 30 sekúnd

Meranie MMP-9 promotorovou aktivitu

transkripčný regulácia MMP-9 bola skúmaná prechodnú transfekciu MMP-9 promótor-luciferázového reportérového konštruktu (pGL4-MMP-9). Plasmid pGL4-MMP-9 promótor (preklenutie nukleotidov od -925 až +13) bol láskavo poskytnutý Dr. Young-Han Lee (Konkuk University, Korea). AGS bunky boli schovať a pestované až dosiahli 70% zhlukovania. Potom pGL4-MMP-9 promotorové plazmidy boli transfekovány do buniek za použitia Fügen 6 (Promega, USA) podľa protokolu výrobcu. PRL-TK bol transfekován ako vnútorná kontrola. Bunky boli inkubované v transfekčním médiu po dobu 12 hodín a potom sa spracuje s PMA počas 4 hodín. Účinky chrysin na MMP-9 promotorové aktivity boli stanovené predbežné spracovanie buniek s chrysin po dobu 1 hodiny pred pridaním PMA. Štúdia ko-transfekcia vykonávali v prítomnosti alebo neprítomnosti expresného vektora kódujúceho dominantný negatívny mutant MEK-1 (PMCL-K97M), dominantný negatívny mutant JNK (PMCL-TAM67), alebo dominantný negatívny mutant p38 MAPK (PMCL-MP38 ), ktorý bol láskavo poskytnutý Dr. NG Ahn (University of Colorado-Boulder, CO), Dr. M. J. Birrer (NCI, Rockville, MD) a Dr. J. Han (Scripps Research Institute, CA), resp. Bunky boli zozbierané pomocou bunkovej kultúry lyzačného činidla (Promega, USA), a Luciferase aktivity boli stanovené za použitia luminometra (Centro XS lb960 mikrodoštičkách luminometra Berthold Technologies, USA) podľa protokolu výrobcu.

Transient transfekcia AP-1 reporterového

AP-1 luciferázový reportéri plazmid bol zakúpený od firmy Clontech (Palo Alto, CA, USA). Pri AGS bunky dosiahli 60-70% zhlukovania, boli premyté Opti-MEM médiom a transfekovány PGL-3, vektora obsahujúceho AP-1 Reportéra použitie Fügen 6 (Promega) podľa protokolu výrobcu. Bunky reportéri transfekciou vystaví sa pôsobeniu chrysin po dobu 1 hodiny a potom sa spracuje s 100 nM PMA počas 4 hodín a luciferázové aktivity boli merané za použitia luminometra.

transfekcia AP-1 falošné oligodeoxynukleotidy

na AP-1 väzobné miesto ATGAGTCAT, sme navrhli AP-1 návnada phosphorothioated dvouřetězcové oligo deoxynukleotid (odn) nasledovne, 5'-CGsT CTT CTG GAA AGT CAT ATG TTC ACT CAG AAG ACsG-3 ', a 3 "-GsCA GAA GAC TCA GTA CTT AAG TAC TGA GTC TTC TsGC-5 '. Keď AGS bunky rástli do 60-70% zhlukovania, AP-1 a odn pGL4-MMP-9 promotorové plazmidy boli kotransfekovány do buniek za použitia Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) podľa protokolu výrobcu. Po inkubácii po dobu 20 hodín, transfekované bunky boli ošetrené s PMA počas 4 hodín a Luciferase aktivity boli merané za použitia luminometra.

Western blot analýza

AGS bunky ošetrené PMA boli premyté fosfátom pufrovaný fyziologický roztok (PBS), oddelený pomocou Trypsín-EDTA pufru a skladované pri -70 ° C až do použitia. Bunkový proteín bol extrahovaný pufrom RIPA [1% NP-40, 0,5% deoxycholát sodný, 0,1% dodecylsulfát sodný (SDS)] a inhibítory proteázy (aprotinínu, leupeptinu, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), benzamidinu, inhibítor trypsínu, orthovanadátu sodného ). Päťdesiat mikrogramov proteínov sa potom oddelí elektroforézou na 10% SDS-polyakrylamidovom gélu a prenesené na Hybond-P membrán (Amersham Pharmacia Biotech). Membrány boli blokované v roztoku TBST s obsahom 5% odstredené mlieko, inkubované s primárnou protilátkou v blokovacím roztoku cez noc pri teplote 4 ° C a trikrát premyté 0,1% Tween-20 v Tris pufrovanom fyziologickom roztoku (TBST) v 10 minútových intervaloch , Chrenovej peroxidáze konjugovanou sekundárnou protilátkou (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) bola použitá na detekciu imunoreaktívnych proteínov chemiluminiscencie. Boli použité nasledujúce protilátky: anti-fosfo-P44 /42 MAPK (EKR-1/2) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-fosfo-JNK /Šapka (Cell Signaling Technology), anti-MMP 9 (Cell Signaling Technology), anti-fosfo-c-Fos (Cell Signaling Technology), a anti-fosfo-c-Jun (Cell Signaling Technology). Celkové množstvo bielkoviny boli testované premytím prenesené membránu stripovacím roztokom zloženým zo 100 mM 2-mercaptoetanolu, 2% SDS, a 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,7) počas 30 minút pri teplote 50 ° C, a membrána bola potom re-sondovania buď s anti-β-aktínu (Cell Signaling Technology), anti-totálny ERK1 /2 (Cell Signaling Technology), anti-totálny JNK /Šapka (Cell Signaling Technology), anti-c-Fos (Santa Cruz Biotechnology , Inc., CA, USA), alebo anti-c-Jun (Santa Cruz).

Matrigel invázie test

test invázie buniek bola vykonaná za použitia 10-jamkové chemotasis komoru (Neuro sonda, Gaithersburg, Maryland, USA) s 8 um pórov membrány (Neuro Probe) s 10% FBS obsahujúcim RPMI ako chemoatraktantu v dolnej komore. AGS bunky (10 ^{5 do 280 ul) boli pridané do hornej komory s PMA v prítomnosti chrysin, MMP-9, protilátky alebo nešpecifické IgG a inkubované napadnúť Matrigelu po dobu 24 hodín. Za účelom zistenia účinku chrysin a inhibítory signalizácie na PMA-indukovanú bunkovú inváziu, AGS Bunky boli vopred inkubované s chrysin, kurkumín, PD98059, alebo SP600125 po dobu 1 hodiny, a inkubované s PMA pre inváziu dobu 24 hodín. Non-napadajúce bunky na hornom povrchu každej membrány boli vyňaté z komory a invázne bunky na spodnom povrchu každej membrány boli zafarbené s Quick-Diff škvŕn kit (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) , Po dvoch vodných umýva, komory boli ponechané sušiť na vzduchu. Počet invázii buniek bola počítaná za použitia mikroskopu s fázovým kontrastom.}

štatistiky

Dáta sú uvedené ako priemer ± SD, a predstavujú strednú hodnotu z aspoň troch samostatných experimentov vykonávaných v triplikátech. Rozdiely medzi každé dva dátovej sady boli stanovené pomocou t-testy. Rozdiely sú popísané ako významné v texte zodpovedajú P Hotel <0,05.

Výsledky

inhibičný účinok chrysin na PMA stimulovanej MMP-9 výrazom

vyšetrovať supresívny účinok proti chrysin upregulaci MMP-9, AGS bunky vopred ošetrené s chrysin boli inkubované s PMA a boli vykonané želatína zymografie a RT-PCR analýzu. Ako je znázornené na obr 1A, PMA stimulovaných MMP-9 bola inhibovaná chrysin v spôsobom závislým od dávky, ako je znázornené pomocou testu želatína zymografie. Pred experimentu, či chrysin priamo inhibuje aktivitu MMP-9, alebo inhibuje expresiu MMP-9 je ešte neznámy. K odpovedi na túto otázku, sme spoločne inkubované s AGS-sekretovaný MMP-9 sa chrysin počas 3 hodín, a želatína zymografie bola vykonaná na kontrolu konečnej hladiny MMP-9 aktivity. Ako Fig 1B ukazuje, Chrysin nemôže ovplyvniť vylučovaný MMP-9 aktivity. Takže sme predpokladali, že inhibícia chrysin proti MMP-9 môžu byť prostredníctvom potlačenie expresie MMP-9. Na overenie tejto hypotézy, reverzné transkripcii PCR a MMP-9 promótor testy boli vykonávané na kontrolu hladiny transkripcie MMP-9. Ako je znázornené na obr 1C, po ošetrení chrysin, PMA-indukovanej MMP-9 mRNA znížená spôsobom závislým od dávky. Okrem toho, MMP-9 promótor aktivita luciferázy bola inhibovaná chrysin v spôsobom závislým od dávky (obrázok 1D). A western blotting tiež ukázala, že inhibičný účinok na chrysin MMP-9 expresie (obrázok 1E). Koncentrácia chrysin použité v tejto štúdii nemal vplyv na životaschopnosť buniek (obr 1F). Tieto výsledky naznačujú, že Chrysin inhibuje MMP-9 aktivity v bunkách AGS prostredníctvom zníženia transkripcie účinnosti.

Role of AP-1 v PMA-indukovanej expresie MMP-9

Ako uvádza predchádzajúcu literatúry, AP-1 je najdôležitejšie transkripčný faktor v MMP-9 expresie [17]. V tejto štúdii, pre potvrdenie, že AP-1 je kriticky nutné v tomto predmete, činné sme AP-1 návnada phosphorothioated dvouřetězcové oligodeoxynukleotid (odn) a pGL3-AP-1 luciferázy plazmidu čo-transfekciu do buniek AGS. Tieto ko-transfekované bunky boli ošetrené s PMA a Luciferase aktivity je možné stanoviť za použitia luminometra. Ako je znázornené na obr 2A, PMA-indukovanej luciferázové aktivity MMP-9 promótorom boli inhibované v AP-1 klamné ciele. Dôsledne, AP-1 návnada tiež inhiboval PMA indukovanú MMP-9 mRNA expresie (obr 2B). Ukázalo sa, že zrážanie na AP-1 Zložka c-Fos a c-Jun tiež znížila PMA-indukovanej expresie MMP-9 (obr 2c). Okrem toho, kurkumín, inhibítor AP-1, bol tiež použitý pre kontrolu rolu AP-1 v PMA-indukovanej expresie MMP-9. Vzhľadom k tomu, dát RT-PCR ukazuje, kurkumín inhiboval PMA-indukovanú expresiu MMP-9 v spôsobom závislým od dávky (obrázok 2D). Vyššie uvedené dáta naznačujú, že AP-1 je základným faktorom MMP-9 expresie. Po preukázaní kľúčovú úlohu AP-1 v vysokými hladinami MMP-9 expresie, my sme predpokladali, že mechanizmus inhibícia chrysin z MMP-9 expresie bol cez potlačenie AP-1 aktivitu. Následne AGS bunky prenesené s AP-1 luciferázové reportéri plazmidy boli vopred ošetrené chrysin, a potom stimulované PMA. Ako je znázornené na obr 2E, Chrysin potlačená PMA indukovanú AP-1lucifease aktivitu spôsobom závislým od dávky, čo ukazuje, že Chrysin má schopnosť znižovať AP-1 aktivitu.

Chrysin inhibuje PMA indukovanú MMP-9 expresia tým, že inhibuje transkripčný faktor AP-1 prostredníctvom potlačenie c-Jun a c-Fos fosforylácie

je dobre známe, že c-Jun a c-Fos sú zložky AP-1 dráhy [18]. Chceli sme zistiť, mechanizmu inhibičného účinku chrysin je na AP-1, a šetrenie, či Chrysin skutočne vykonávala jeho vplyv na c-Jun a c-Fos. Merali sme celkové množstvo mRNA ako c-Jun a c-Fos pomocou RT-PCR. Ako je znázornené na obr 2F, Chrysin neinhiboval expresných hladín c-Jun a c-Fos mRNA. Ďalej, otestovať, či Chrysin inhibuje aktiváciu c-Jun a c-Fos, western blotting bol vykonaný pre monitorovanie fosforylovaný c-Jun a c-Fos. Obr 2G a 2F ukazujú, že Chrysin robil potláčajú PMA-indukovanej c-Jun a c-Fos fosforylácii spôsobom závislým od dávky.

Chrysin inhibuje c-Jun a c-Fos fosforylácii blokovaním JNK a EKR signalizáciu cesta

Ďalej sme skúmali, ako Chrysin potlačená c-Jun a c-Fos fosforylácii. Vzhľadom k významnej role MAPK hrá v aktivácii AP-1, sme skúmali úlohu MAPK v MMP-9 výrazu. Ako je znázornené na obrázku 3a, medzi inhibítory MAPK, PD98059 (ERK1 /2 inhibítor), SP600125 (/inhibítor JNK1 2), a SB203580 (inhibítor p38 MAPK), iba PD98059 a SP600125 boli schopné inhibovať PMA indukovanú MMP-9 expresiu , ktorá uviedla, že ERK1 /2 a JNK1 /2 dráhy môžu mať zásadný význam pre PMA-indukovanej MMP-9 výrazu. Ďalej, s MEK-dominantné negatívne plazmidu PMCL-K97M, JNK-dominantné negatívne plazmid PMCL-TAM67 a p38 MAPK-dominantné negatívne plazmid PMCL-MP38, sme potvrdili kritickej role EKR a JNK v MMP-9 prejavu u karcinómu žalúdka AGS bunky (obr. 3B) Okrem toho, ako je znázornené na obr 3C, ERK1 /2 a JNK1 /2 sú kriticky nutné pre AP-1 aktiváciu PMA, preukázať experimentu sa MEK a JNK dominantné negatívne plazmidy. Ďalej sme skontrolovali role JNK1 /2 a ERK1 /2 v c-Jun a aktivácia c-Fos. Ako je znázornené na obr 3D, SP600125 a PD98059 potlačená PMA-indukovanej c-Jun a c-Fos fosforylácii, v danom poradí, čo ukazuje, že JNK1 /2 je kriticky proti prúdu od c-Jun, zatiaľ čo ERK1 /2, je kriticky proti prúdu od c-Fos. Vzhľadom k tomu, sme zistili, že JNK1 /2 a ERK1 /2 hrá zásadnú úlohu v MMP-9 expresie pomocou AP-1, sme predpokladali, že Chrysin môže pracovať prostredníctvom inhibície JNK1 /2 alebo ERK1 /2 k potlačeniu expresie MMP-9. Overiť hypotézu, western blotting bol vykonaný na stanovenie účinku na chrysin JNK1 /2 alebo ERK1 /2 fosforylácie. Ako obor 3E a 3F show, liečba PMA viedlo k pozoruhodnému nárastu JNK1 /2 a EQF P42 /44 fosforylácie; Avšak, v prítomnosti chrysin, PMA-indukovanej JNK1 /2 a ERK1 /2 fosforylácie bola inhibovaná spôsobom závislým od dávky.

Vplyv chrysin na bunkovej invazívnosti

Je známe, že vysoké hladiny MMP-9 expresie sú dôležité pre invazívneho fenotypu nádorových buniek. Skúmať vplyv chrysin na PMA-indukovanú bunkovú inváziu, sme sa zaoberali invázie buniek modifikovaným Boyden invázne komory. AGS bunky inkubované v PMA viedlo k zvýšeniu počtu napadnutých buniek, ktoré prešli umelú Matrigelu. Avšak, v prítomnosti chrysin alebo MMP-9, protilátky, počet napadnutých buniek sa znížil, čo naznačuje, chrysin môže potlačiť PMA-indukovanú bunkovú invazívnosti inhibíciou MMP-9 expresie (obr 4A a 4B). Okrem toho sa ukázalo obr 4C Chrysin znížila PMA-indukovanú AGS invázii v spôsobom závislým od dávky. Ďalej sme skúmali účinok inhibítora signalizácie na PMA-indukovanú AGS invázie buniek. Ako je znázornené na obr 4D, Chrysin, kurkumín, PD98059 a SP600125 inhibujú invázie buniek indukovanú PMA, čo naznačuje, že Chrysin pravdepodobne inhibuje PMA indukovanú MMP-9 pomocou AP-1, potláčaní, ktorý je výsledkom blokovanie dráhy JNK1 /2 a ERK1 /2 .

Diskusia

Prirodzene sa vyskytujúce zlúčeniny s protirakovinových aktivít interferovať s vývojom nádoru a progresie rakoviny inhibíciou rôznych mechanizmov, vrátane bunkovej migrácie, invázie a metastáz. Chrysin, prírodný flavonoid bežne nájsť v mnohých rastlinných výťažkov, med a propolis, má chemopreventivní vlastnosti, ako sú anti-proliferatívne a pre-apoptózy aktivity pri rôznych nádoroch [19,20]. Avšak vlastnosti proti invázii chrysin neboli dostatočne študované v rakovinových bunkách žalúdka. Je dobre známe, že MMP sú silou zničenie extracelulárnej matrix, ako aj hlavné induktormi bunkovej invazívnosti. Skúmali sme inhibičné účinky na expresiu MMP chrysin do buniek karcinómu žalúdka. Chrysin inhiboval expresiu MMP-9 (obr 1) a ďalších MMP, ako sú inhibítory MMP-2 a MMP-7 (dáta nie sú uvedené). Regulácia mechanizmus chrysin môže byť závislý na každom MMP, a v tejto štúdii sme sa zamerali na MMP-9 pravidlá nariadenia.

PMA, forbol-12-myristát 13-acetát, proteín kináza aktivátor, sa bežne používa ako biomedicínsky výskumný nástroj v modeloch rakoviny. V tejto štúdii sme zistili, PMA zvyšuje MMP-9 aktivity prostredníctvom up-reguláciu jeho úrovne expresie. V prítomnosti chrysin, PMA-indukovanej MMP-9 sa znížila v závislosti na veľkosti Chrysin-závislým od dávky (obrázok 1A). Avšak zdá sa, že inhibuje Chrysin MMP-9 nie preto, že inhibícia MMP-9 aktivity enzýmu, ale vzhľadom na jeho potlačenie expresie MMP-9. Vyšetrovať mechanizmus, podľa ktorého Chrysin inhibuje PMA indukovanú MMP-9 vyjadrenie, snažili sme sa zistiť základné transkripčný faktor (y) v PMA- indukovanej MMP-9 expresného dráhy. Bolo oznámené, že AP-1 je pozitívny regulátor MMP: AP-1 element nachádza medzi -72 a -66 hrá hlavnú úlohu v transkripčný regulácii génovej expresie MMP-1, a mutácie tohto prvku výrazne znížiť bazálny aktivitu a schopnosť reagovať na MMP-1, promótorom na vonkajšie podnety [21]. V promótorom upstream regulačné sekvenciu MMP-9, sú dve AP-1 väzbové miesta (-533 a -79), ktoré hrajú zásadnú úlohu v MMP-9 expresiu v ľudských bunkách Caska [22]. V našej štúdii, AP-1 falošné oligodeoxynukleotidy, AP-1 kurkumín inhibítora, c-Jun a c-Fos siRNA rušená PMA-indukovanú MMP-9 expresie (obr 2A-2D), ktorý poskytol priamy dôkaz, že AP-1 je kriticky je vyžadované pre zvýšenie MMP-9 v transkripcii buniek karcinómu žalúdka. Na základe vyššie uvedených výsledkov, sme vyvodiť, že Chrysin inhibuje MMP-9 expresiu potlačenie AP-1 aktivitu. Obr 2E znázorňuje overenie našej špekulácie: Chrysin môže výrazne znížiť AP-1 aktivitu spôsobom závislým od dávky. V súlade s našou súčasnej zistenie, že chrysin inhibuje AP-1 cielené génu MMP-9 prostredníctvom potlačenie AP-1 aktivitu, ale tiež bolo popísané, že Chrysin inhibuje ďalšie AP-1 cieľových génov, ako sú VEGF, COX-2 a ICAM-1 [ ,,,0],23-25]. V súlade s ostatnými zisteniami, že bolo zistené, že luteolín, rastlina flavonoid s podobnou štruktúrou chrysin, výrazne inhibuje LPS-indukovanej DNA väzbovú aktivitu AP-1 [26]. Avšak, inhibičné schopnosti a mechanizmus chrysin na AP-1 neboli úplne preskúmané pred tejto štúdii. Preto ďalší študovali mechanizmus, ktorý inhibuje Chrysin AP-1.

Okrem sprostredkovania expresie MMP-9, AP-1 tiež obaja indukuje expresiu inváziu aktivátorov a potláča invázie potlačovatelé. Ako taký, AP-1 je základný transkripčný faktor pre reguláciu invazívnych súvisiacich génov [27]. AP-1 sa skladá buď homodimery členov Jun rodiny alebo heterodiméry medzi členmi c-Fos a c-Jun rodín. Ako c-Jun a c-Fos sú fosforylované a aktivuje EQF, P38 a JNK kináza systémy [28-30]. S cieľom preveriť mechanizmus inhibícia Chrysin AP-1, sme skúmali c-Jun a c-Fos, dve hlavné súčasti AP-1. Zistili sme, že Chrysin inhibuje c-Jun a aktiváciu c-Fos blokovaním ich príslušných fosforylácii. V súlade s našimi zisteniami, niektorí predchádzajúcej literatúre tiež uviedol, že ostatné flavóny napr. quercetin, znížená AP-1 aktivity prostredníctvom potlačenie c-Jun v translokáciu do jadra [31].

sme ďalej záujem o inhibičný mechanizmus chrysin sa na c-Jun a c-Fos. JNK (c-Jun N-terminálne kinázy), člen (mitogénom aktivovanej proteínkinázy) rodina MAPK, ktorý reguluje rad biologických procesov podieľajúcich sa vzniku nádorov, je považované za nevyhnutné, kináza aktivácia c-Jun [32] , EKR, extracelulárna signalizácia regulovaná kináza zohráva úlohu v regulácii rôznych bunkových procesov, ako je proliferácia, diferenciácia a vývoja [33], a bolo hlásené, že je dôležitý regulačný kinázy c-Fos aktivácia [34]. V tejto štúdii sme zistili, priamy dôkaz v karcinómu žalúdka AGS buniek, ktoré JNK je kriticky potrebné pre aktiváciu c-Jun, zatiaľ čo EKR kináza je rozhodujúca pre c-Fos aktivácia (znázornenej na obr 3D).

Based na základe vyššie uvedeného uzavretia, aby sa ďalej skúmať mechanizmus chrysin tohto potlačenie MMP-9, sme zistili, že chrysin mal schopnosť blokovať JNK1 /2 a ERK1 /2 fosforyláciu (obr 3e a 3f). V súlade s týmto zistením, tiež boli opísané inhibičné účinky iných flavóny na ERK1 /2.

Liu et al. uvádzajú, že apigenin, je polyfenolické flavon (4,5,7-trihydroxyflavone), nájdený v rôznych bylín a zelenej listovej zelenine, inhibuje migráciu buniek prostredníctvom potlačenie ERK1 /2 fosforylácie v ľudských bunkách hladkého svalstva močového mechúra [35]. Bolo tiež objavené Ishikawa a kol. že H _{2O 2 zvyšuje apoptózu, čo vedie k rýchlemu fosforylácie JNK, EKR a p38 MAPK, zatiaľ čo quercetin môže zrušiť aktiváciu týchto troch MAPK v odozve na H 2O 2 [ ,,,0],36].}

v tejto štúdii sme skúmali inhibičný účinok chrysin na MMP-9 a expresie ukázala, základný mechanizmus v karcinómu žalúdka AGS buniek prvýkrát. Na základe našich zistení, popisujeme hypotetický schematický model, znázorňujúci mechanizmus chrysin inhibíciu MMP-9 expresiu, ako je znázornené na obr 5. Ďalšie štúdie by mali byť vykonávané zistiť, či je základná enzým pred oboch JNK1 /2 a ERK1 /2, kriticky riadenie JNK1 /2 a ERK1 /2 fosforyláciu. Ak áno, Chrysin môže priamo komunikovať so základným enzýmom, ktorý by mal byť dôkladne skúmané ako potenciálne protirakovinových liek.

Rôzne adjuvantnej terapeutické stratégie na potlačenie metastázovaniu nádoru a zabrániť opakovaniu nádoru boli preskúmané a poskytujú mnoho možností pre spätné získavanie prostriedkov pacientov. V poslednej dobe, použitie prírodných fytochemikálií získala rozsiahlu štúdiu pre prevenciu rakoviny [37]. Okrem toho, diétne príjem fytochemikálií nedávno získal pozornosť v žalúdku prevencii rakoviny [38]. V tejto štúdii sme zistili, že bunky ošetrené chrysin môže znížiť rakovinu invazívnosti cez inhibíciu MMP-9 expresie prostredníctvom potlačenie JNK /c-Jun a EKR /c-Fos signálnych dráh. Tieto nálezy môžu poskytnúť užitočné dôkazy pre vývoj budúcich protirakovinové postupov liečby rakoviny žalúdka.

• Ploche ONE: Strata Vyjadrenie Reprimo, p53 indukované zastavenie bunkového cyklu génu koreluje s invazívnym scéne progresiu nádorov a P73 expresiu u rakoviny žalúdka
• Ploche ONE: Deregulácia medzi Mir-29b /c a DNMT3A je spojená s epigenetické umlčanie génu CDH1, ktoré ovplyvňujú bunky migrácie a invázie v žalúdočnej Cancer