Ploche ONE: malá molekula R1498 ako dobre tolerovaná a orálne aktívny kinázy inhibítorom hepatocelulárneho karcinómu a žalúdka liečby rakoviny prostredníctvom Targeting angiogenézy a mitózy Cesty

Abstraktné

Proteínové kinázy hrajú dôležitú úlohu v rozvoji nádoru a progresie. Veľa inhibítorov kináz uzavreli trhu a vykazujú sľubné klinický prínos. Tu popisujeme objav nové malé molekuly, dobre tolerovaná, orálne aktívny inhibítor kinázy, R1498, väčšinovo cielenie ako angiogénny a mitotické dráhy pre liečbu hepatocelulárneho karcinómu (HCC) a rakovina žalúdka (GC). Rad biochemických a bunkových testoch založených na uvedené, že cieľová kináza zhluk R1498 zahrnuté Aurora kináz a VEGFR2 et al. R1498 mali za následok mierne vitro
inhibíciu rastu v na paneli nádorových buniek s IC50 rozsahu mikromolov. in vivo
protinádorová účinnosť R1498 bola hodnotená na paneli GC a HCC xenografe v paralelnom porovnaní s inou sorafenib multikinázový inhibítor. R1498 vyššiu účinnosť a profil toxicity oproti sorafenibu u všetkých testovaných modelov s > 80% inhibícia rastu nádoru a regresii nádoru v niektorých xenogratfts. Terapeutický potenciál R1498 bolo tiež zdôraznené jeho účinnosť na tri ľudské GC primárneho nádoru odvodených modelov štepov u 10 až 30% nádorových regresné sadzby. R1498 bolo preukázané, že aktívne inhibovať aktivitu Aurora A in vivo
, a znížiť vaskularizáciu v nádoroch. Okrem toho R1498 predstavil dobrý in vivo
expozície a terapeutické okienko vo farmakokinetických a dávkami štúdia na zistenie rozsahu. Tézy dôkazy naznačujú, že R1498 je silný, dobre tolerovaná, orálne aktívny inhibítor multitarget kinázy s jedinečným antiangiogenetické a antiproliferatívne profilu, a poskytujú silnú dôveru pre ďalší rozvoj pre HCC a GC terapie

Citácia :. Zhang C, Wu X, Zhang M, L Zhu, Zhao R, Xu D, et al. (2013), malá molekula R1498 ako dobre tolerovaná a orálne aktívny kinázy inhibítorom hepatocelulárneho karcinómu a žalúdka liečbe rakoviny cez Targeting angiogenézy a mitóza dráh. PLoS ONE 8 (6): e65264. doi: 10,1371 /journal.pone.0065264

Editor: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Francúzsko

Prijaté: 22. februára 2013; Prijaté: 23.apríla 2013; Uverejnené: 05.06.2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Platcovia nemal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

protichodnými záujmami: Všetci autori sú zamestnanci alebo skorší zamestnanci Roche R &D Center (Čína) okrem Taiping Chen. , ktorý je zamestnancom CRO spoločnosti s názvom Crown Bioscience Inc. Peking, Čína. To však nič nemení priľnavosť jednotlivých autorov do všetkých politík ploche jeden na zdieľanie dát a materiálov.

Úvod

Proteínové kinázy slúžiť ako ciele pre terapeutickú intervenciu v rakoviny, ktorá je overeným a dokazuje úspešnej a široká aplikácia inhibítorov proteín kinázy v rôznych druhov rakoviny, a to buď ako monoterapiu alebo v kombinovaných režimoch. Avšak, ako je heterogénne ochorenie spôsobeného akumulačné multi-génových mutácií, skôr než poháňané jediným kinázy mutant, rakoviny, ktoré držia dobré reakcie na terapiu jedným činidlom sú veľmi obmedzené. Okrem toho, získaná rezistencia nádorov pomôcť sami rýchlo unikať z chemoterapie, potom relapsu. Komplex úchylné signalizácia u rakovín priťahuje vývoj stratégií, ktoré sa zameriavajú viac biologických dráh týkajúce sa biológie nádorov, ako je proliferácia, metastázy a anti-apoptózu. Jedna stratégia zahŕňa racionálne liekových kombinácií. Napríklad, kombinácia VEGF cielené monoklonálnej protilátky s konvenčnou chemoterapiou preukázal významný prospech v prežitie v prsníka, hrubého čreva a pľúc [1]. Ďalšie stratégiou je vyvinúť zlúčeniny, ktoré pokrývajú viac mechanizmy v rámci jedného agenta. Tento prístup má niekoľko potenciálnych výhod oproti kombináciu stratégií, vrátane jednoduchosť cesty vývoja, rýchlosť uvedenia na trh a menšie prekrytie vedľajších účinkov. V súčasnej dobe, inhibítor multikinázový sorafenib sa používa ako prvú líniu liečby pokročilého a metastatického HCC s zlepšenie strednej doby prežitia z 7,9 mesiaca (placebo skupina) na 10,7 mesiacov [2]. Avšak liečba s výsledkami sorafenibu u štatisticky významné, ale klinicky mierne, zlepšenie celkového prežitia, čas do progresie a kontrolu chorôb sadzba [3]. Medzitým, tradičné cisplatinou terapia je stále široko používaný v klinickej praxi pre pokročilých a metastatické GC. Pre HER2 /neu nadmernou expresiou žalúdočných adenokarcinómov, trastuzumab v kombinácii s chemoterapiou predlžuje medián celkového prežívania 11,1 mesiacov (chemoterapia sám) na 13,8 mesiacov [4]. Aj keď companioned diagnostická metóda bola založená na cieľovej obrazovky pacientov, trastuzumab nemá žiadnu aktivitu vo veľkom podskupine pacientov nesúcich vysokej úrovne HER2 /neu s dôvodom byť identifikovaná [5]. Vzhľadom k vysokej úmrtnosti HCC a GC a bežných liečebných režimov s obmedzeným výsledkom, stále existuje obrovská nenaplnená medicínska potreba pre oba typy rakoviny.
Terapia

Angiogenézy na báze rakoviny, vrátane anti-VEGFR-2 protilátky, malé molekuly proti VEGFR -2 signalizácia [6], [7], a VEGFR chimérický proteín [8], bolo preukázané, že účinná stratégia pre liečenie viac typov rakoviny. Okrem toho, účinnosť multikinázový inhibítorov sunitinib a sorafenib by čiastočne pripísať VEGF signalizácia blokovanie [9]. Avšak, počet pacientov, sú vnútorne rezistentné alebo po niekoľkých liečebných cykloch [10] vyvinúť rezistencia na anti-antiangiogenetické terapia, [11]. Preto sa očakáva, že klinické štúdie kombinujúci angiogénnych inhibítorov a lieky s alternatívnym mechanizmom účinku na zlepšenie účinnosti alebo prekonať rezistenciu k antiangiogenetické liečbu [12]. To bolo všeobecne známe, že zvýšená expresia Aurora kináz v rôznych druhov rakoviny sa podieľa na procese vzniku nádorového ochorenia [13], [14]. inhibítor aurora kinázy VX-680 bol schopný účinne inhibovať rast rakovinové bunky in vitro stroje a in vivo
a následne vstúpil do klinických štúdií, čo naznačuje, že Aurora kinázy sú druggable ciele [15] .

s ohľadom na akumulačné dokazuje angiogenézy a Aurora kináz pri karcinóme a ich terapeutickej hodnoty svedčia biologickými a inhibítorov s malými molekulami, sme objavili inhibítor kinázy, R1498, čo podstatne ovplyvnilo kľúčové dráhy angiogenézy a mitosis. R1498 má jedinečný profil inhibícia kinázy, vysokú účinnosť a dobré farmakokinetické a toxikokinetické profily, všetky tieto podporovať ďalšie klinický vývoj.

materiáloch a metódach

Ethics Prehlásenie

Použitie a starostlivosť o pokusných zvierat bolo schválené používanie a ošetrovanie výboru pre ústavné zvierat (IACUC), Roche R &D Center (Čína). Crown Bioscience, CRO servisná spoločnosť zaväzuje k ochrane súkromia pacientov a sledovať všetky etické princípy pre materiály pacienta odvodené, zhromaždených čerstvo vyradených ľudských nádorových vzoriek, s IRB (miestnej nemocnice ekvivalent výbor) schvaľovanie a požiadaviek pacienta súhlasu. Všetky bunkové línie boli zakúpené od ATCC, USA, alebo Shanghai Institutes of biochémie a bunkovej biológie, čínskej akadémie vied

Zlúčeniny

R1498 (čistota väčšia ako 98%). Bol syntetizovaný Roche R & D Center (Čína). U enzymatických testoch a in vitro testy na báze buniek
v, R1498 sa rozpustí v DMSO ako 0,01 mol /l zásobného roztoku. V prípade štúdií na zvieratách, R1498 sa rozpustí v 1% Klucel EF /0,1% polysorbátu 80 /0,09% metylparabén /0,01% propylparabénu vo vode, roztok bol pripravený na týždennej báze. Sorafenib bol syntetizovaný Roche R &D Center (Čína) a rozpustí sa v Cremophor EL /etanol (50:50, Sigma) k príprave 5 mg /ml zásobného roztoku A, balených a skladovať v izbovej teplote. Tento zásobný roztok sa pripravuje čerstvý každé 3 dni. Konečné dávkovači roztoky boli pripravené v deň použitia zriedením zásobného roztoku sterilizovanú vodou.

bunkové línie

Všetky bunkové línie z Americkej Typická stanici (ATCC) a bunkové banky, Shanghai inštitúty biochémie a bunkovej biológie, Chinese Academy of Sciences boli udržiavané pri teplote 37 ° C s 5% CO _{2 zvlhčenej atmosfére v rastovom médiu doporučujeme od predajcov a podrobia in vitro testami
medzi priechody 8 ~ 15 bunkové línie pre štúdie na zvieratách boli medzi dvoma pasážami 5 ~ 10. Ľudské pupočnej žily endotelových buniek (HUVEC), získané z Allcells (Emeryville, CA) bola udržiavaná v EGM-2 (Lonza, Allendale, NJ) sa rast endotelových buniek stravy a 10% fetálneho hovädzieho séra (Invitrogen, Carlsbad, CA).}

Cell Test proliferácie

Každá bunková línia bola schovať na 96-jamkové doštičky pre tkanivové kultúry (Corning, NY) vo vopred stanovenej hustote v 180 ul kompletného média, ktoré sú pripojené cez noc a spracuje sa zlúčeninou na ďalšiu 72 h. Potom sa médium sa odstráni a nahradí sa 10% CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonsko) v kompletnom médiu, a potom inkubované dosky po ďalšie 2 hodiny. OD _{450 bola meraná pomocou spektrofotometra SpectraMax 190 (MDS, Sunnyvale, CA). Pozadie absorbancie OD polotovaru bola odpočítaná od všetkých jamiek. Potom inhibícia rýchlosť (IR) bola stanovená podľa vzorca :. IR (%) = (OD DMSO-OD zlúčenina) /OD DMSO x 100%}

V VEGF-indukovanej HUVEC proliferačnej test sa HUVEC suspendované v 170 ul EGM-2 s 0,5% FBS boli schovať a inkubované cez noc. Potom, čo bunky spojené, 10 ul 1 ug /ml rekombinantného ľudského VEGF 165 (R &D systems, Minneapolis, MN) bol pridaný do každej jamky s 20 ul roztoku zlúčeniny pripravenej v EGM-2 s 0,5% FBS. Test CCK-8 ako je uvedené vyššie bol použitý pre stanovenie životaschopnosti buniek.

kinázovej Testy

Afinita R1498 proti 402 kináz bola stanovená KINOMEScan® (Ambit Biosciences, San Diego, CA) a údaje boli prezentované ako hodnoty disociačná konštanta (Kd) [16]. Inhibícia na kinázovej aktivity Aurora kináz a VEGFR2 sa ďalej charakterizuje testu kinázovej aktivity ž'-Lyte za zodpovedajúce koncentrácie ATP.

HUVEC Tube Formation Test

testu HUVEC tvorba trubice bola vykonaná tak, ako bolo oznámené predtým [17]. Stručne povedané, Matrigel ™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), sa nechá roztopiť pri 4 ° C po dobu 3 ~ 4 hodín. 100 ul kvapaliny Matrigel ™ sa pridá k vopred chladený 96-jamkové tkanivové kultivačné doštičky a doštička bola inkubovaná pri 37 ° C, 5% CO _{2 zvlhčenej atmosfére po dobu 1 hodiny sa spevniť Matrigel ™. Bunky HUVEC boli kultivované v EGM-2 s 0,5% FBS cez noc, a schovať na 90 ul EGM-2 s 0,5% FBS pri hustote 2,2 x 10 ^{5 buniek /ml na Matrigelu ™ potiahnuté dosky. Bunky boli liečené zlúčeninou alebo ekvivalentné množstvo DMSO. Doštička bola inkubovaná pri teplote 37 ° C, 5% CO 2 zvlhčenej atmosfére počas 7 hodín, potom sa bunková morfológia bol zachytený pomocou mikroskopu s fázovým kontrastom (IX71, Olympus, Hamburg, Nemecko).}}

Western Blot

bunkový lyzát bol pripravený v pufri RIPA a kvantifikované metódou kyseliny bicinchoninic (BCA) (Pierce, Rockford, IL). Tridsať mikrogramov proteínu na vzorku sa nanesie na 4 ~ 12% NuPAGE® Novex SDS gélu (Invitrogen). Proteín sa prevedie pomocou iBlot® suchého blotting zariadenia (Invitrogen) na nitrocelulózové membrány. Po blokovanie nešpecifickej väzby s TBS /Tween 20 (0,1%) (TBS /T), obsahujúcim 5% odtučnené mlieko po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti, bola membrána inkubovaná v fosfo-Aurora A (Thr288) (C39D8) králičie monoklonálna protilátka ( cell Signaling Technology,ij9 CST, Beverly, MA) alebo fosfo-Histon H3 (Ser10) králičie polyklonálne protilátky (CSTϊ1) (1: 1000 v TBS /T, ktorý obsahuje 3% hovädzieho sérového albumínu (BSA), a jemne trepanie pri 4 ° C cez noc. membrána sa premyje TBS /T trikrát pre odstránenie nenaviazanej protilátky, potom inkubované so sekundárnou protilátkou (HRP-konjugovaným kozím anti-myším IgG alebo kozí anti-králičí IgG, 1: 10000, KangChen Biotech, Shanghai, Čína) po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti, v danom poradí. Proteínové pásy boli vizualizované pomocou rozšírenej chemiluminiscencie (ECL) kit (Pierce, Rockford, IL).

imunofluorescenčný

Bunky nasadené na komoru rezy boli fixované v 4% paraformaldehydu pri teplote miestnosti, potom sa permeabilizovány 0,15% Triton-X100 v TBS a blokované 3% BSA v TBS /T. primárnej protilátky (fosfo-Aurora a (Thr288) (CSTĵ7), fosfo -Histone H3 (Ser10) (CSTϊ1) a MPM2 (anti-fosfo-Ser /Thr-Pro) Millipore-368) boli inkubované s sklíčka vo vlhkom komore pri teplote 4 ° C cez noc. Sekundárne protilátky Alexa Fluor® 488 kozí anti-králičie IgG (H + L), alebo Alexa Fluor® 594 kozí anti-myší IgG (H + L) (Invitrogen) boli použité v tomto poradí po dobu jednej hodiny po tom, čo bola sklíčka premytá TBS dôkladne. Potom, čo boli odstránené nenaviazané protilátky, bola sklíčka vysuší a namontované s montážnou DAKO antifide médiá. Snímky boli zachytené s IX71 za vhodných excitačné aj emisné filtre.

prietokovej cytometrie

obsah DNA bol meraný pomocou FACS-Calibur cytometra (Becton Dickinson, San Jose, CA) a distribúcie bunkového cyklu bola vypočítaná tak, ako bolo opísané skôr [18].

tubulín in vitro
polymerizačné test

in vitro
tubulín polymerizácie test bol vykonaný, ako bolo opísané skôr [18 ]

jednorazová dávka Farmakokinetická (SDPK) Študijné

použitie a starostlivosť o pokusného zvieraťa bola schválená Institutional Animal starostlivosť a používanie výboru, Roche R &. D Center (Čína). Samce nahých myší (telesná hmotnosť: 19 až 24 g) boli použité v SDPK štúdii. Pred farmakokinetickej štúdii, zvieratá boli náhodne rozdelení do skupín pre odber vzoriek (3 zvieratá na časový bod). Ďalších desať myší boli použité pre zhromaždené v plazme polotovaru pre kalibračnej krivky. Myši boli cez noc na lačno pred perorálnym podaním.

Krvné vzorky boli odoberané pomocou retro-orbitálnej punkciou v pred dávkou a 0,033, 0,083, 0.25,0.5, 1, 2, 4, 6, 8, a 24 hodinách po podaní dávky. Vzorky plazmy a formulácie dávky boli skladované pri -20 ° C až do bioanalýzu. Získavanie dát a riadiaci systém boli vytvorené pomocou programu Analyst 1.4 softvér od spoločnosti ABI Inc. koncentrácie v plazme pod limitom kvantifikácie (LOQ = 1 ng /ml), boli označené ako nula. Farmakokinetická analýza dát bola vykonaná pomocou noncompartmental modulov analýza v WinNonlin Professional V5.2 (Pharsight, USA) .v biologická dostupnosť sa vypočítala ako F (%) = (Dávka _{iv × AUC PO (0-∞)) /(Dávka po x AUC IV (0-∞)) * 100%. U krysy, psy a opice SDPK, že boli odoberané vzorky krvi z krčnej žily punkcie.}

xenoimplantátu štúdie účinnosti s bunkových línií a pacientom Odvodené Nádory

Použitie a starostlivosť o pokusného zvieraťa bola schválená Institutional Animal Care and Use výbor, Roche R &D Center (Čína). Nádorové bunky boli Inokulované do pravého boku Balb /c nu /nu
samice holých myší (5 ~ 6 týždňov, 16 ~ 18 g, získané z Sino-britskej SIPPR /BK Lab. Animal Ltd, Shanghai, Čína) pri optimálnej hustote na základe našej vlastnej validačnej štúdie. Potom, čo nádor bola založená a dosiahol 100 ~ 150 mm ^{3, myši boli náhodne rozdelené do desiatich myší na skupinu a boli liečení v súlade s plánom. Rast nádoru bol zaznamenaný trikrát týždenne s meraním dĺžky (L) a šírka (W) pomocou posuvného merítka a vypočíta ako objem nádoru (TV, mm 3) = 0.5 * L * W * W (mm) , inhibícia rastu nádoru bola vypočítaná ako% TGI = (1- (priemerný objem tumoru v liečenej skupine v prvom zväzku denné priemerné nádoru liečenej skupiny na koncovom deň) /(priemerný objem tumoru v kontrolnej skupine na prvom objem denný priemer nádoru v kontrolnej skupine na koncovom deň)) x 100%. Tumor regresia jednotlivých myší bola definovaná. - Objem nádoru na konci je menší ako objem nádoru, kedy sa začala liečba}

V ľudskej modely primárny nádor, čerstvé ľudské žalúdočné nádorové tkanivá boli priamo implantované do neobéznych diabetických a ťažké kombinovanej imunitnej deficitom (NOD-SCID) myší do 5 hodín po chirurgickom zákroku s 5 mm ^{3 fragmenty vytvoriť primárny nádor modelov xenoimplantátových. Každý model nádoru bola overená aspoň tromi sériovými in vivo
pasážach demonštrovať stabilitu transplantácie. Nádory z priechodov 4-7 boli podkožne Inokulované do pravého trokar bokov myší Balb /C nu /nu samice nahých myší (5 ~ 6 týždňov, 16 ~ 18 g). Liečba začala, keď objem nádoru dosiahol 100 ~ 150 mm 3. Meranie a prevádzka nádor protokol je rovnaký ako bunková línia odvodená nádorového modelu.}

Imunohistochémia

8 um parafínu vloženej nádorového tkaniva kĺže pripravené z nádorom in vivo účinnosti
štúdie sa zahrieva v suchej peci pri teplote 60 ° C po dobu 1 hodiny, potom zbavené parafínu a hydrolyzuje Leica autostainer XL ST5010 pri izbovej teplote. Antigén získavanie sa vykonáva pri teplote 95 ~ 99 ° C v citrátovom pufri (0,01 M, pH 6,0) sa zahrieva lekárskym mikrovlnnej rúre pri teplote 92-98 ° C počas 5 min, potom sa ochladí na teplotu miestnosti. Potom peroxidáze blokujúce činidlo (DAKO, DK-2600, Glostrup Dánsko) bolo nanesené na uhasenie endogénne peroxidázy. Sklíčka sa vyliahli v blokujúcom séra po dobu 20 minút, potom sa vzťahuje 100 ul fosfo-Aurora A (Thr288) (C39D8) králičie mAb (CSTij9, 1: 200 v TBS /T) alebo králičie anti-ľudský CD31 polyklonálna protilátka ( Santa Cruz Biotech, SC-8306, Santa Cruz, CA, USA; 1: 200 v TBS /T) pri 4 ° C cez noc, potom sa inkubujú v 100 ul DAKO Envision + /HRP, králik /myš po dôkladne sa premyje TBS. Sto mikro litrov substrátu, chromogénneho roztoku (DAB) boli aplikované na sklíčka a inkubované pri izbovej teplote po dobu 10 minút. Doštičky boli mierne opláchnuté pod tečúcou vodou po dobu 15 minút. Counterstain a dehydratácia bola vykonávaná XL ST5010 pri izbovej teplote. Nakoniec bola sklíčka osadené Permount montážnym médiom (Fisher Scientific, Miami, FL).

Dávka diaľkomeru a toxikokinetické štúdie

dávkovom rozmedzí zistení a toxikokinetické štúdie bola vykonaná u potkanov a Beagle psy na základe in vitro
metabolitov identifikácii. Krýs Wistar (samci: 3, samica 3 v každej skupine, z Vital River, Beijing, Čína) bola na lačno cez noc, a potom sa dostal skúšobné výrobky, ako sú 0, 6,25, 50 a 100 mg /kg dvakrát denne na žalúdočné sondou po 14 -Day kontinuálny režim. Pohyblivosť pozorovania bol aplikovaný na dennej báze nájsť maximálne tolerantní dávky pre zvieratá. Zvieratá bola usmrtená D14, a nasledujúce pozorovanie toxikológie boli vykonané, vrátane zmeny telesnej hmotnosti, klinickým pozorovaním, pitva, hematológie chémie a histopatológie. V deň 1 a deň 14, krvné vzorky boli získané pomocou jugulárnej žily punkciou zo všetkých zvierat (ak je nažive, za použitia EDTA-K2 rúrky). Vzorky boli opatrne zmiešané a umiestnené na rozdrvený mokrom ľade až do odstredenia, ktorý bol vykonaný ihneď. Vzorky boli stočené počas približne 15 minút pri teplote 4 ° C, 2700 otáčok za minútu. Výsledná plazma bola oddelená, prevedená do jedinečne označených jasných polypropylénových skúmaviek a okamžite zmrazí cez pevný oxid uhličitý (suchý ľad), kým sa prenesie do približne -80 ° C. Každé zviera bolo odobratá krv v nasledujúcich časových bodoch: približne 5 min, 15 min, 30 min, 1, 2, 4, 8 a 24 hodín po prvej dávke v konkrétny deň. Tieto koncentrácie liečiva v plazme bola stanovená pomocou LC-MS /MS. Farmakokinetická analýza bola vykonaná pomocou WinNonlin softvéru (verzia 5.2, Pharsight Corporation, CA, USA) a farmakokinetické parametre boli vypočítané za použitia Non-kompartmentový metódu modelu.

psov Beagle (cca 8-10 mesiacov od Beijing Marshall Biotechnology Co. Ltd., Beijing, Čína) boli podrobené protokolu štúdie, ako je popísané vyššie. Každá skupina má jeden pes a jedna fena sa dávky testované látky boli nasledovné: 0, 1, 7,5 a 15 mg /kg, v danom poradí. Použitie a starostlivosť o pokusného zvieraťa bola schválená Institutional Animal starostlivosť a používanie výboru, Roche R &. D Center (Čína)

Analýza dát a štatistiky

Nezávislý t test bol použitý pre kontinuálnu dát analýza a χ2 test bol aplikovaný na kategoriálních dát. Údaje boli považované za významné, keď p hodnoty boli. ≪ 0,05

Výsledky

1. Charakterizácia R1498 ako inhibítor multikinázový

Pyrazolobenzodiazepine analógový R1498, s lešenie založené na fúzii benzodiazepíny a pyrazolového kruhu (obrázok 1A), bol predtým identifikovaný ako slabý cyklin-dependentnej kinázy 2 (CDK2) inhibítor [19]. Táto molekula ukázalo charakter multikinázový inhibítor, keď sme analyzovali knižnice inhibítor kinázy. Profil inhibícia kinázy z R1498 (1 uM) bol charakterizovaný pomocou KINOMEScan® na koncentrácii ATP okolo Km každého kinázy. Miera inhibícia R1498 je viac ako 80% proti 39 kináz von 402 kináz, vrátane 359 divokého typu kináz a 43 kinázy mutantov (obr S1). Disociačné konštanty (Kd) 39 hit kináz boli následne stanovené a kinázy s Kd < 0,2 uM boli ukázané na obrázku 1B. Väčšina z možných zásahov patrí do rodiny tyrozín kinázy (TK) a AGC rodiny. Okrem toho, Z-Lyte skúška bola vykonávaná pre ďalšie stanovenie inhibície kinázovej aktivity R1498. Výsledky ukázali, že IC50 pre R1498 boli 25 ± 6, 67 ± 4 167 ± 13 nM proti VEGFR2, Aurora kinázy A a B, v tomto poradí (obrázok 1C). Potom je naša štúdia bola zameraná na anti-angiogénny a anti-mitotické dráhy majorly postihnutých R1498.

Panel 16 rakovinových bunkových línií, vrátane karcinómu pečene, karcinómu žalúdka a karcinómu nosohltanu bunkových línií, bol použitý na určenie in vitro
anti-proliferačnú schopnosť R1498. Väčšina bunkových línií sú stanovené z ázijských druhov rakoviny, ako ázijské prevládajúci rakoviny sú naše zameranie. Hepatokarcinom a rakovina žalúdka panel bunkové línie boli citlivejší na liečbu R1498 než nosohltana nádorových bunkových línií. Celkový priemerný IC50 boli 7.81, 7.55 a 30.07 uM, čo zodpovedá epatocellular karcinóm, karcinóm žalúdka, karcinóm nosohltanu a bunkových línií, resp. Citlivosť bunkové línie odvodené z ázijskej populácie (BEL-7402, QGY-7701 a QGY-7703), bola porovnateľná s citlivosťou Hep3B, ktorý bol z kaukazskej (obrázok 1D).

2. R1498 inhibuje Aurora kináz a indukuje zástavu bunkového cyklu

Aurora kináza inhibícia R1498 bol vizualizovaný pomocou imunofluorescencie v rakovina žalúdka bunkové línie SGC-7901. Priame miesta fosforylácie fosfo-Aurora kináza A (T288) a fosfo-Histon H3 (S10) boli použité na označenie kinázovej aktivity Aurora A a B, respektíve [20], [21]. Fosfo-Ser /Thr-Pro mitotický proteín monoklonálne(MPM2) bol použitý ako mitotického markeru (červená) pre označovanie mitotických buniek. Aurora kináza A (T288) fosforylácie vyskytuje v centrosome z mitotických buniek (zelené). Potom, čo boli bunky ošetrené s 5 uM MR1498 po dobu 24 hodín, Aurora T288 zelená ložiská v mitotických bunkách sa stal slabšie alebo zmizlo (obrázok 2A, horný panel), čo ukazuje, že aktivita Aurora kinázy A poklesol po spracovaní R1498. Fosforylácie Histon H3 (S10) je lokalizovaný hlavne v centromér mitotických buniek. Potom, čo boli bunky ošetrené R1498, fosfo-Histon H3 (S10) výrazne znížili (zelená). Tieto pozorovania naznačujú, že aktivita Aurora kinázy B tiež klesol na liečbu R1498. Tieto výsledky boli potvrdené imonufluoreskujúca Western blot. Ako je znázornené na obrázku 2B, fosforylácie fosfo-Aurora kinázy A (T288) a fosfo-Histon H3 (S10) sa znížil v závislosti od koncentrácie pri akútnej liečbe u R1498.

inhibícia Aurora kináz A a B produkuje rôzne fenotypové zmeny v bunkovom cykle. Potlačenie Aurora A indukovanej bunkového cyklu G2 fázy zástavou [22], zatiaľ čo inhibícia na Aurora kinázy B je hlásené, že spôsobuje Polyploidia u buniek v dôsledku endoduplication bez cytokinesis [15]. Potom, čo boli bunky ošetrené 10 uM R1498, ako SGC-7901 (rakovina žalúdka buniek) a BEL-7402 (hepatocelulárny karcinóm), ukázala, G2 /M fáze zastaviť a akumuláciu polyploidie buniek. Bel-7402, bunky distribúciu v G2 /M fázy sa zvýšila z 25,6% na 57,0%, medzitým bunky s ^ 4 obsah N DNA sa zvýšila z 6,7% na 17,6%. SGC-7901 bol citlivejší, s G2 /M populácie zvýšil z 25,2% na 75,5%, a polyploidné bunky sa zvýšila z 3,1% na 21,6% (obrázok 2C). Stabilizátor mikrotubulov (napríklad Taxol) a destabilizer (napríklad kolchicín) spôsobí, G2 /M fázy zástavu rovnako. Ak chcete zistiť, či R1498 je mikrotubulami cielené činidlo, in vitro
tubulín polymerizácie skúška bola vykonaná. Dáta ukázali, že R1498 ani stabilizovaný, ani k destabilizácii polymerizácii mikrotubulov aj pri vysokej koncentrácii R1498 (40 um) in vitro
(obrázok 2D), čo naznačuje, že bunkového cyklu G2 /M zástava nebola spôsobená mikrotubulami cytoskeletu rušenia. Vzaté dohromady, tieto údaje naznačujú, že R1498 inhiboval Aurora kináz A a B v bunkách a produkoval fenotypové zmeny v bunkách.

3. R1498 antagonizuje angiogenézy pokrok v oblasti ľudských endotelových buniek

angiogenézy sa inicializuje sekréciou angiogénny rastový faktor z nádorových buniek, a potom sa endotelové bunky množia, migrujú a rúrky forma plavidiel v odpovediach na stimuláciu VEGF. Aby sa vyriešil problém špecifickosť R1498 antagonizované endotelových rast buniek stimulovanej VEGF, ľudskej pupočnej žily (HUVEC endoteliálne bunky) boli vystavené dva rôzne podnety, VEGF a FBS v rámci liečby R1498 po dobu 72 hodín. V podmienkach kultúry, ktoré obsahujú VEGF alebo FBS, HUVEC ukázal inú odpoveď na R1498. Že IC50 boli 89 a 2064 nM pre VEGF a FBS, v danom poradí; Tieto návrhy, ktoré R1498 antagonizuje rast HUVEC poháňaný VEGF silnejší ako FBS (obrázok 3A). V teste tvorby trubice HUVEC, po 8 hodín vystavení R1498, HUVEC tvorený menej neporušené trubice ok než liečených DMSO skupiny (Obrázok 3B). R1498 neovplyvňuje proliferáciu HUVEC za týchto podmienok ošetrenie (dáta nie sú uvedené).

4. R1498 potláča rast ľudských nádorových xenoimplantátů

farmakokinetické vlastnosti s jedinou dávkou R1498 v rozmanité druhy boli určené. Doba polčas (T1 /2) a perorálna biologická dostupnosť (Oral BA%) uprednostňuje ďalej účinnosť štúdii u holých myší (tabuľka S1) s dvakrát denne orálne sondou rozvrhu. Panel xenoimplantátům vrátane ázijskej rakovinu žalúdka, karcinómu pečene a rakovina nosohltanu bol použitý pre porovnanie R1498 a iným sorafenib inhibítora multikinázový (obrázok 4, tabuľka S2). Sorafenib je schválený ako prvá línia liečby karcinómu pečene [2], a je v klinickej štúdii na kombinačné liečbu pokročilého karcinómu žalúdka [23]. Paralelné porovnanie sa skladala z inhibíciu rastu nádoru, regresiu a telesnej hmotnosti zmeny zvieraťa s dávkovaním 25 mg /kg dvakrát denne per orálne. Vo všetkých testovaných xenoimplantátov, R1498 ukázal lepší inhibičný rýchlosť rastu nádoru (TGI%) oproti sorafenibu. V prípade karcinómu pečene, TGI% z R1498 je 10 až 19% viac ako TGI% sorafenibu, rakoviny žalúdka, 2-12% viac ako TGI% sorafenibu. Regresná Miera nádoru bol tiež začlenený ako ďalšieho terapeutického koncového bodu. V karcinómu pečene paneli, regresia nádoru bola pozorovaná v BEL-7402 modelu, 8/10 (80%) zvierat malo regresii v skupine R1498, pričom desatina (10%) zvierat malo regresii sorafenib skupine (obrázok 4, BEL-7402), , Pre žalúdka panelu rakoviny, MGC-803 a SGC-7901 xenografe mali rovnakú mieru regresné v reakcii na skúšobných predmetov: 5/10 (50%) pre R1498 a 2/10 (20%) pre sorafenib (obr.4, SGC -7901, a tabuľka S2). konečných výsledkov účinnosti zo všetkých 7 testovaných modelov založených R1498 má lepšiu účinnosť ako sorafenib podľa rovnakej schémy liečby. Okrem toho, R1498 vykazovali dobrú účinnosť na jednej nazofaryngálne karcinóm xenoimplantátu, TGI% z R1498 (90%, 25 mg /kg, dvakrát denne, na žalúdočné sondy) bola vyššia ako úroveň opatrne cyklofosfamidu (60%, každých 10 dní, intraperitoneálna injekcia) (Obrázok 4, CNE-2). Zmeny telesnej hmotnosti, ktoré boli zaznamenané u všetkých modelov pre porovnanie toxicity ukázali, že nahé myši ukázal znesiteľnejšie k R1498 po celú dobu liečby v Bel-7402, SGC-7901 a CNE-2 modelov, aj keď prírastok telesnej hmotnosti 10 dní potom, čo sa mierne znížila ošetrenie (obrázok 4, tabuľka S2). Avšak, sorafenib spôsobil kontinuálne pokles o telesnej hmotnosti zvieraťa. Pre sorafenibu ošetrených myši v BEL-7402 a SGC-7901 modelov, percento telesného chudnutie presiahol 15% v deň ukončenia. Ako je uvedené v tabuľke S2, R1498 ukázali menší vplyv na telesnej hmotnosti myší ako sorafenib robil, ktoré naznačujú, že R1498 držal lepší bezpečnostný profil.

5. R1498 down regulácii fosforylácie Aurora A a cievne hustoty v nádorových

Fosforylované Aurora A (T288) a CD31 u nádorov zo štúdie účinnosti boli použité pre určenie vplyvu na-cieľ R1498. Nádor hmotnosť zozbierané z BEL-7402 xenoimplantátu štúdii bol pripravený do parafínu vložené snímok a podrobí sa immunohistochemisty pre vizualizáciu angiogenézy tvorca ľudského CD31 a Aurora kinázy A aktivita markeru fosfo-Aurora A (T288). Bel-7402 nádorov CD31 farbenie R1498 liečebných skupín sa znížila v spôsobom závislým od dávky, ktoré navrhol v vaskularizácia nádorov bol inhibovaný (Obrázok 5A). Aktivita kinázy Aurora A bol tiež znížený na liečbu R1498, čo sa prejavilo slabšie farbenie fosfo-Aurora A (T288) v R1498 liečených nádorov (obrázok 5B).

Ľudský primárny nádor žalúdka odvodené modelu xenoimplantátu bola použitá na predpoveď účinnosti pre klinické preklade. Rakovinové tkanivá troch jednotlivých pacientov s karcinómom žalúdka bolo zaštepiť u myší, a xenoimplantáty vymedzené rôzne rastové krivky in vivo
. V xenoimplantáty ukázal rôzny vplyv na telesnej hmotnosti zmeny hostiteľov. Myši boli ošetrené R1498 (25 mg /kg) pre uvedené obdobie konečná% TGI dosiahla 73,6 ~ 91,6%, s regresia ceny 10 ~ 30%. Obmedzené zmeny telesnej hmotnosti navrhol, že nádor nesúce myši boli dobre znášanlivý k R1498 (obrázok 6).

6. R1498 má dobrý farmakokinetický profil (PK) a terapeutickým oknom

SDPK uvedené, že prijateľná biologická dostupnosť a polčas vlastnosti R1498 medzi nahých myší, potkanov a psov (tabuľka S1). Zmesné pečeňové mikrozómy boli použité na predikciu hlavných metabolitov v rôznych druhov. Rat a bígl psa s podobnými mikrozomálnych metabolitov človeka boli použité pri maximálnom tolerantné dávka (MTD) štúdie na určenie terapeutickej okno medzi účinnými a toxickými expozíciách (Tabuľka S4). Samice a samce ukázal inú odpoveď na vyvrcholil dávok R1498.

• Ploche ONE: pyruvátkinázy M2 hrá dvojakú úlohu v nariadení o EGF /EGFR signalizácie cez E-cadherin spôsobom závislým na rakovina žalúdka Cells
• Ploche ONE: prospektívna štúdia o výskyte pooperačnej VTE u kórejských rakovina žalúdka pacienti: prešetrenie uplatňovanie západných smerov ázijského Cancer Patients