Vyšetrenie koní žalúdočných žliaz lézií pre baktérie, vrátane Helicobacter spp fluorescenčnej in situ hybridizácia

Vyšetrenie koní žalúdočných žliaz lézií pre baktérie, vrátane Helicobacter spp
podľa fluorescenčnej in situ hybridizácia
abstraktné
pozadia
koní žalúdočných žliaz je obyčajne ovplyvnená eróziou a vredov. Cieľom tejto štúdie bolo zistiť, či baktérie, vrátane Helicobacter, by mohli byť zapojené do etiológie žalúdočných žliaz lézií pozorovaných u koní.
Výsledky
lézií žalúdka, rovnako ako bežné vyzerajúce sliznicou boli získané z koní porazených pre ľudskú spotrebu. Všetky vzorky boli testované na aktivitu ureázy za použitia Pyloritek ® testu, zatiaľ čo slizničnej Obsah baktérií bola hodnotená pomocou fluorescenčnej in situ hybridizácia
. Vo vybraných čiastkových vzoriek, baktérie charakterizácia bol ďalej sledovaný klonovania a sekvenovania. Slizničné lézie boli nájdené v 36/63 žalúdky a zahŕňal hyperplastickú Rugao, polypovitými štruktúry a ohniskovej erózie. Žiadny zo vzoriek boli testované pozitívne na aktivity ureázy alebo na zásobách použitím Helicobacter rod špecifickú sondu. Vo vzorkách lézií, rovnako ako normálnych vzoriek, klony s 99% podobnosť s Lactobacillus salivarius stroje a Sarcina boli nájdené ventriculi
. Escherichia
ako baktérie klonov a Enterococcus klonov boli preukázané v jednom ohniskovej erózie. na fylogenetického stromu na báze tieto klony mali 100% podobnosť s Escherichia fergusonii a Enterococcus faecium
. Enterococcus boli nájdené kolonizovať povrch sliznice, zatiaľ čo E. fergusonii
organizmy boli tiež preukázané, intraepiteliálnej.
Záver
žalúdočnej baktérie Helicobacter spp. nebolo možné overiť, ako sú zapojené do lézií žliaz žalúdka koňa. Vzhľadom k tomu, E. fergusonii
bol opísaný ako rozvíjajúce sa patogén v oboch ľudí a zvierat, sa zistení tejto baktérie v žalúdku erózii odôvodňuje ďalšie objasnenie, či je dôležitý pre kone žalúdočné infekcie s týmto typom baktérie.
Pozadie
U koní, lézie nesekretorické časti brucha, sú veľmi rozšírené a zdá sa, že je spôsobený nadmerným vystavením kyseliny [1], ale malý bol opísaný, pokiaľ ide lézií v glandulární časti. Lézie nachádza v žľazovej oblasti bola preukázaná u 58% z 162 hospitalizovaných koní [2], a 47% z 345 pretekárskych koní [3], a pričom príčinou týchto nedostali veľa pozornosti, expozícia kyseliny sa nezdá, že je hlavným faktorom , ako sa zistilo, žiadna korelácia medzi léziami oboch oblastí žalúdka [3].
žalúdočnej baktérie ako príčinu žalúdočných žliaz lézií boli navrhnuté pre mnoho druhov zvierat a u človeka tieto predstavujú hlavný rizikový faktor overená. Z žalúdočných organizmov zistených, Helicobacter pylori
bola popísaná najviac kvôli jeho patogénne potenciál indukovať chronickej gastritídy, vredov, adenokarcinómy a sliznice lymfóm asociovaný s lymfoidné tkanív (MALT lymfóm) u ľudí [4-6]. Baktérie tohto rodu sa našli aj vo vzorkách žalúdočných tkanivo zvierat, vrátane psov, ošípaných, oviec a hovädzieho dobytka [7-10]. Br &kone, protichodné dôkazy ukončí o tom, či sa vyskytujú baktérie, ktoré sa špecificky môžu spôsobiť žalúdočné lézie. Niekoľko štúdií ukázali, že žalúdka Helicobacter spp
. sú prítomné v normálnom vyzerajúcej sliznicou pomocou PCR a imunochemie [11, 12], zatiaľ čo iní našli žiadny dôkaz o spojení medzi prítomnosťou lézií a baktérií [13]. Ako žalúdočné bakteriálne druhy, ktoré boli potvrdené alebo navrhnuté ako súčasť patogenéze niektorých typov žalúdočné patológií u ľudí a iných druhov zvierat, je cieľom tejto štúdie bolo zhodnotiť, či baktérie môžu byť zapojené do patologických pozorované v koní žalúdočných žliaz. Hlavnou témou konferencie bolo poskytnúť viac dôkazov, pokiaľ ide o prítomnosť a lokalizáciu baktérií všeobecne na úrovni sliznicu koní žliaz žalúdka. Osobitný dôraz bol kladený na získanie informácie o prítomnosti a zapojenie akéhokoľvek druhu Helicobacter
v slizničných lézií. Fluorescenčná in situ hybridizácia (FISH
) technika bola použitá pre tento účel, ktorá umožňuje použitie rRNA cielených sond pre oba celkovej bakteriálnej populácie a definované rodu /druhov. Tento prístup umožňuje stanovenie bakteriálnej morfológie, hojnosti, umiestnenie v tkanivách, a dokonca aj údaje o tempe rastu a fyziologických aktivít [14].
Výsledky
Hrubé žľazovej lézie boli pozorované u 36 z celkového počtu 63 preverovaných žalúdka (57,1 %). Väčšina lézie boli pozorované v oblasti antra (91,7%). V šiestich žalúdkov, lézie boli prídavne alebo výlučne vidieť v kardio alebo corpus oblasti. Žiadne lézie boli nájdené v duodene
Lézie boli rozdelené do troch skupín :. Polypous (2 žalúdky sa polypovitými hmotnosťou sa nachádzajú ako v kardio a antra s veľkosťou medzi 1 a 5 cm v priemere), ii: hyperplastická Rugao lézie (13) žalúdky alebo III :. hyperemické, erozívna alebo ulcerózna lézií, ktoré boli pozorované v 21 žalúdkoch
hyperplastickú Rugao boli všetci videli v dutine a pohybovala sa od mať intenzívnej hyperémia s výpotku, aby Rugao sa bežne objavujú slizničnej povrch. Hrubá zhrubnutie antra Rugao bol spôsobený predovšetkým hyperplázia žalúdočnej foveolae porovnaní so zodpovedajúcimi normálnymi vzorkami. Zostávajúce lézie boli všetky uznané ako malé solitérne lézie nie viac ako približne 1 x 2 cm vo veľkosti. Fokálna oblasti erozívna gastritída bol najčastejší zistení týchto typ lézií a charakterizovaný ako opadávaním z povrchových buniek luminální epitel so súčasným fibrinopurulent exsudátu, luminální bunkovej drviny a prevažne mononukleárny bunkovú infiltrátu lamina propria. Hlbšie erózie nájdené v žalúdku 9 narušili ako oblasť žalúdočných jám a častí žliaz, ktorý bol pozorovaný s gastritídou iba na okamžité tkanív. Bolo zistené, jedného pravého vred rozširuje celú hrúbku lamina propria, vystavovať lamina muscularis do lumen. Maximálne dve lézie boli nájdené v každom z týchto žalúdkov.
Helicobacter a Ureáza testu for S špecifické sondy rodu Helicobacter žiadne pozitívne signály boli zistené niektoré z vzoriek tkanív 79 (36 párových vzoriek a kontrol 7) , V súlade s týmito výsledkami FISH, žiadny z testovaných vzoriek pozitívnych na ureasovou aktivitu jeden. Vnútornej kontroly všetkých ureázových testov bolo pozitívnych ako indikácia funkčného testovacieho kitu.
Baktérie v všeobecnom
Všeobecne platí, že sa pozorovali iba niekoľko baktérií súvisiace na povrch sliznice v oboch zranených, rovnako ako u zdravej žalúdka vzorky. Celkovo možno povedať, štyri morfologické rôzne typy bakteriálnych buniek sa deteguje s eubacteria sondou: 1) malé, krátke (0,2 až 0,5 um) kokovitý tyče, 2) odlišné tyče (1 x 3 um), 3) s dlhými reťazcami tyčou (až do 60 um), alebo 4) veľký (2-3 um), priemer kokovitý baktérie jasné rozdelenie v pároch. Zvyčajne ak sú prítomné baktérie boli pozorované v skupinách spojených s časticami krmív alebo sa nachádza v blízkosti sliznice
preukázaná bakteriálny zápal žalúdka bola nájdená v jednom žalúdočné lézie hrubo charakterizovať ako solitérne erózie, 1 x 2 cm vo veľkosti, centrum bytia hyperemické a je obklopený proliferatívneho epiteliálne ráfika (obr. 1). Mikroskopicky, fokálna erózie sliznice s vytekaniu erytrocytov a leukocytov, najmä neutrofilov pôvodu, bol videný. Aby príslušné exsudáty, boli dodatočne vidieť v žalúdočných boxoch. Bunková zápalová reakcia s mononukleárními bunkami bolo pozorované predĺženie tak hlboko, ako do lamina muscularis. Povrch zapálené sliznice a žalúdočných boxoch bolo zistené, silne kolonizované kokovitý na krátke tyče použitie sondy pre všeobecné baktérií (obr. 2). Krátke tyče boli najmä pozorované infiltrovať erózii. Boli tiež pozorované intracelulárnej v epiteliálnych bunkách, rovnako ako v neutrofilných granulocytov. Bakteriálna kolonizácie žalúdka bola obmedzená na lézie žiadne baktérie boli pozorované zodpovedajúce zdravej sliznice vzorky. Obrázok 1 Focal erozívnou lézie (biela šípka) preukázal, bakteriálny zápal žalúdka na histologické vyhodnotenie. Lézie bola približne 2 x 2 cm a nachádza sa v dutine v blízkosti vrátnika vchodu.
Obrázok 2 žalúdočnej sliznice s erozívnou gastritída spojené s baktériami. Povrch sliznice a priľahlých bunkový debris sa silne kolonizované baktériami (červená). Niekoľko baktérie sú vidieť intracelulárnej v neporušenom epitelu (šípky), ako aj v rámci degenerovaných a nekrotických epiteliálnych buniek (šípka). Okrem toho, baktérie sa nachádzajú v granulocytoch. Fluorescenčná in situ hybridizácia so sondou cielenie Baktérie, sada filtrov 43, bar = 25 um.
Klonovanie a sekvencovania
na morfológiu a intenzite baktérií preukázaná použitím FISH základe boli vybrané čiastkové vzorky zo vzoriek C /c klonovanie a sekvenovanie predstavujú vzorky, vrátane jedného s bakteriálny zápal žalúdka.
z vybraných laboratórnych vzoriek z žalúdkov demonštrujú rôzne baktérie morfológie, dva rôzne typy klonov boli nájdené v normálnych uvedených vzorkách sliznice (vzoriek c), jeden klon 99% podobnosť k Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AB370881) a iný typ klonov malo 99% podobnosť s Sarcina ventriculi
DSM 316 (X76650). predaj z lézií (vzorky C), klony sa našli aj u 99 % podobnosť s Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AF182725). Z sliznicu s bakteriálny zápal žalúdka, štyri z desiatich klonov uzavreté 100% Enterococcus faecium
, zatiaľ čo zvyšných šesť klony (získané sekvencie uložené v GenBank s prístupovým číslom. GQ423062) patril k Escherichia ako
baktérie. Fylogenetický strom bol konštruovaný s šiestimi Escherichia
ako klony z lézie a všetci mali 100% podobnosť s typom kmeňmi E. oboch fergusonii stroje a Shigella flexneri
(obr.3). Použitím gama Proteobacteria špecifické sondy krátke tyče infiltrujúcej epitelu, rovnako ako nájdený vnútri intracelulárnej neutrofilných granulocytov, boli overené ako Escherichia
ako baktérie Enterococcus faecium, zatiaľ čo
organizmy boli identifikované kolonizovať epiteliálny povrch podľa špecifickú sondu Enterococcus (obrázok 4 a 5). Obrázok 3 A fylogenetický strom 16S rRNA génu sekvenčné podobnosti, s vyznačením polohy šiestich klonov, ktoré patria do Gammaproteobacteria nájsť v kone 50L a najviac úzko súvisí typových kmeňov, ktoré patria do rodu Escherichia. Šesť klony (acc.no. GQ423062) mal 100% podobnosť s Shigella flexneri stroje a E. fergusonii
. Enterobacter sakazakii (AB004746) bol použitý ako outgroup. Čísla sekvencie prístupová sú prezentované.
Obrázok 4 žalúdočnej sliznice z konského 50L s erozívnou gastritídu spojené s baktériami. Aplikovanie fluorescenčné značené sondy pre Gammaproteobacteria a Cy3 značené sondy pre Enterococcus, E. coli
ako organizmus (zelená) (šípkou) bol nájdený intracelulárnej vnútri buniek epitelu a na povrchovom epitelu, zatiaľ čo E. faecium (červená) ( " biela hviezda "(len kolonizoval epiteliálny povrch. Sada filtrov 43/38, bar = 10 um.
Obrázok 5 žalúdočnej sliznice z konského 50L s erozívnou gastritídu spojené s baktériami. Veľké zväčšenie demonštrovať E. coli
ako tyče ( zelené) v extrudovaných epitelových buniek. Fluorescenčné in situ hybridizácia so sondou cielenie Gammaproteobacteria, sada filtrov 38, bar = 10 um.
Diskusia
Predchádzajúce štúdie zahŕňajúce konský žalúdok sa napr použité PCR zameranie 16S rRNA gén, najmä Helicobacter
spp. [12]. k nevýhodám pomocou PCR je, že množstvo a umiestnenie baktérií nie je známy a nie je isté, či sa baktérie sú nažive, alebo aj v prípade, že DNA je nahý. Z tohto dôvodu bolo rozhodnuté, že pomocou FISH technikou by poskytoval lepšie a viac baktérií sa nachádzajú v žalúdočných žliaz koňa, kedy sa tieto problémy sú prekonané s touto technikou. Táto technika bola predtým používaný na opis priestorového rozloženia Helicobacter
spp. v zažívacom trakte psov a v žalúdku zdravých koní, preukázať mikroflóry normálneho uvedeného skvamóznych a glandulární sliznice [15, 16]. Podľa našich najlepších vedomostí je toto prvá štúdia využívajúce ryby, ktoré majú skúmať lézie žalúdočných žliaz.
V tejto štúdii jedného prípadu žalúdka spojené s bakteriálnou kolonizácie bola odhalená. Najmä rozdelenie baktérií navrhol spojenie s patológiu pozorované. Množstvo baktérií sa výrazne zvýšil po léziu a boli pevne prilepené na epitelové bunky, s baktériami zasahujúcich do krýpt a nachádza sa intracelulárnych. Klonovanie ukázal, že to bol dvojitý infekcie Enterococcus faecium stroje a Escherichia
ako baktérie, ale to bolo následne overená pomocou in situ hybridizácia
s gama Proteobacteria sondovať, že to bolo len Escherichia
ako baktérie, ktorá prenikla do povrchových vredov a boli zistené intracelulárne v epitelové bunky a v neutrofilných granulocytov. Enterobakteriálny infekcie v čreve, je bežným javom, ale to je zriedkavé nájsť týchto infekcií v žalúdku, a to predtým nikdy nebol hlásený v dospelých koní. Tento výsledok je veľmi zaujímavé, ale ďalšie štúdie treba objasniť, ako bežný je tento jav u koní. Tiež, či tento typ infekcie je primárneho alebo sekundárneho pôvodu by treba vysvetľovať. Escherichia
ako klony všetci mali 100% génu 16S rRNA podobnosť s oboma E. fergusonii stroje a Shigella flexneri
. Tak, v tejto štúdii, nemôže byť upresnená experimentálne, ktorý z týchto dvoch organizmov, ktoré boli prítomné v tomto žľazovej lézie. Avšak, ľudia boli hlásené byť jediným prirodzeným hostiteľom pre Shigella
[17], vzhľadom na to, E. fergusonii
bolo spojené s celým radom črevné a extra-črevných infekcií u človeka aj zvierat vrátane koní [18 , 19]. Je teda veľmi pravdepodobné, že Escherichia
ako baktérie nájdené v tejto štúdii patrí E. fergusonii
. Štúdie uvádzajú E. fergusonii
ako rozvíjajúce sa patogén a spojené s obzvlášť bakteriémia a infekcia rany, ale jeho presná úloha v infekcií u človeka aj zvierat, je potrebné ju stále objasnený [20].
Microbiology vo vzorkách
prostredie v žalúdočných žliaz je všeobecne veľmi nepriateľské voči mikróbom [21]. Je dobre známe, že na rozdiel od ľudí a psov, ktoré sú jedál kŕmidlá, kone sú výrobcovia kontinuálne kyseliny, pravdepodobne v dôsledku kontinuálnej kŕmení vzoru [22, 23]. Hodnota pH vo ventrálnej časti žalúdka koní je stabilný pri pH približne 1-3 po dobu 24 hodín [24], v dôsledku toho je relatívna nízka diverzita baktérií pozorované v slizničných vzoriek v tejto štúdii bolo neočakávané.
Charakteristiky morfologické fenotyp veľkých koky rastúce v pravidelných tetrads vznikla byť klon s 99% podobnosť s Sarcina ventriculi
. Tento organizmus je známe, že je schopný rásť v obsahu žalúdka a má charakteristickú štruktúru Tetráda pri pestovaní od pH 1- pH 3 [25]. V tejto štúdii, nebolo možné určiť zistení týchto organizmov za časť akejkoľvek špecifickej patológie, ako boli nájdené v nízkych číslach v párovaných vzoriek (tj. Lézií a normálne), rovnako ako v kontrolných vzorkách. Sarcina podobné baktérie boli nájdené v rôznych druhov, kde boli považované za príčinu abomasal nadúvanie, krvácanie a vredy jahniat a kôz deti [26, 27] a možný odkaz na žalúdočné dilatácie v oboch psov a koní má tiež bolo navrhnuté [28]. Žiadny dôkaz plynu akumuláciou bol pozorovaný makroskopicky v žiadnej z týchto koní, a preto sa nezdá, že prítomnosť Sarcina ventriculi
prispieva k patológii pozorovanej u týchto koní.
Nebolo prekvapivé, že Lactobacillus (Lactobacillus salivarius
) bola nájdená vo študovaných tkanív a už skôr bolo opísané, že niekoľkých Lactobacillus
spp., vrátane L. salivarius
, sú prítomné u zdravých koní [16, 29]. Proximálnej koní žalúdka funguje ako úložisko pre krmivá, rovnako ako priestor pre žalúdočné fermentácie. Ekosystém v tejto oblasti pozostáva z oboch anaeróbnych a laktátu, za použitia baktérií vo veľkých množstvách, ktoré sú zodpovedné za zvýšenie prchavých mastných kyselín, po fermentácii sacharidov [30]. Najmä Lactobacilli bolo zistené, ktoré priľne na epitelu v proximálnej časti žalúdka koní [31] a tieto baktérie sa pravdepodobne prechádza na žalúdočných žliaz ako súčasť normálneho obratom. Skúmali sme len čiastkových vzoriek a ďalšie bakteriálne taxóny budú nájdené v zdravej časti žalúdočných žliaz, ak obsiahlejší štúdie mikroflóry komunita bola vykonaná.
Platnosť zistenie Helicobacter
Žiadny zo vzoriek tkaniva z antra región preukázali pozitívne signály z Helicobacter spp
. sondy v tejto štúdii a žiadne špirálové tvare baktérie boli zistené pomocou techniky FISH jeden. V nedávnej štúdii z Venezuely, špirálové tvare baktérie boli hlásené v biopsiách srdcovej oblasti konského žalúdka zafarbené Warthin-Starry farbením [12]. Helicobacter spp
. známe, že sú schopné kolonizovať žalúdok produkovať veľké množstvo cytoplazmatickej ureázy [32] rýchle ureasové testu použitého v tomto prešetrovaní, Pyloritek ®, detekuje Ureáza vzorky tkaniva produkciou amoniaku, ak je prítomný močovina. Že je vo veľkej miere používa v humánnej praxi pre detekciu gastritídy spôsobenej Helicobacter spp
. Pozitívne a negatívne prediktívne hodnoty sa pohybovali medzi 98.1-100% a 95.8-100%, v tomto poradí v štúdii testovanie ľudských pacientov pred a po eradikáciu baktérií [33]. V tejto štúdii sa nezistili žiadne pozitívne skúšky, čo ukazuje, že biopsia v tejto štúdii obsahovala žiadne baktérie sa schopnosťou produkovať Ureáza.
Závery
žalúdka Helicobacter
spp. nebol nájdený a nemohol byť spojený s žalúdka lézií 36 koní analyzovaných v tejto štúdii. Nájdený v tejto štúdii patológie súčasťou polypovitými štruktúry, hyperplastickú Rugao a malé erózie, ale bakteriálne zapojenie bol nájdený iba v jednom prípade erózie. V tejto lézie, Escherichia, ako je klon s najväčšou pravdepodobnosťou E. fergusonii
bolo zistené, že intracelulárne. Či už sa jednalo o primárny alebo sekundárny infekcie nemohla byť uzavretá. Veľmi obmedzené množstvo baktérií všeobecne boli nájdené v konskom žľazovej oblasti, ako sa očakávalo. Tak, detekcia stredné až vysoké množstvo baktériami na glandulární úrovni sliznice, rovnako ako v kryptách by mala byť dôvodom na obavy, pretože to sa nezdá byť normálny nález u koní žalúdočných žliaz. Ďalšie štúdie zahŕňajúce baktérie a vzťah k žalúdočných lézií koní s potvrdenými klinickými príznakmi sú oprávnené, pretože tieto kone neboli zahrnutí do tejto štúdie.
Metódy
Kone a dizajn štúdie
Štúdia bola vykonaná ako prierezová štúdia žalúdkov z populácie 63 jatočných koní v Dánsku. Kone boli schválené veterinárneho útvaru ako zdravý na porážku. Kone boli ohromení jatočná pištoľ, a nechajú vykrvácať. Žalúdka, vrátane 5 - 10 cm od distálneho pažeráka a 10 cm od proximálneho duodena, sa odstráni bezprostredne po vypitvaní a otvorený pozdĺž veľkého zakrivenia. Ingest boli odstránené, a ak je to potrebné, sliznica bola opatrne prepláchnuť s minimom vody z vodovodu pred kontrole. boli zahrnuté iba žalúdky makroskopických lézií v glandulární sliznice, rovnako ako sedem ovládacích žalúdky bez hrubého dôkazy žalúdočných lézií.
žľazovej lézie boli definované ako na sliznicu, ktorý má abnormálny makroskopický vzhľad tj hyperemické, zvýšenie hrúbky, erózie alebo vredy , Anatomické polohy lézií boli zaznamenané ako: kardio, corpus alebo antra oblasti (obr. 6). Obrázok 6 anatomických oblastí žalúdka otvorený pozdĺž veľkého zakrivenia. Nesekretorické región má biely objavujúceho epitel, zatiaľ čo žliaz región odtiene červenej. Sú od seba oddelené Margo plicatus
. Tri vzorky oblasti zahŕňajú: Cardia ako malé prúžky oblasti tesne pod a pozdĺž margo plicatus
oblasti corpus obsahujúce kyselinu, pepsinogénu a hlienu vylučujúcich žliaz (tmavočervený) a regiónu dutine obsahujúci primárne hlienu a gastrínu vylučovať žľazy.
postup odberu vzoriek
z každej žalúdka žľazových léziami, tri vzorky tkaniva, kde získané z najväčších lézie (a, b, C), ako aj tri párové vzorky normálneho tkaniva objaviť (a, b, c) z rovnakej anatomické oblasti, najmenej však aspoň 5 cm ďaleko. A /a: malý, veľkosť biopsia (0,5 x 0,5 cm), vzorka sliznice bol získaný pre okamžité testovanie ureázy sa Pyloritek ® testu podľa inštrukcií výrobcu. Testy boli odpočítané po štandardnom čase 60 minút a výsledky známy ako pozitívne alebo negatívne. Vzorky B /b: 3 x 3 cm plná hrúbka vzorky tkaniva, vrátane slizníc a submucosa boli získané pre ryby a fixované v 10% pufrovanom formalínu. . Po 24 hodinách fixácie boli vzorky prenesené do 70% etanolu, zaliatych v parafínu, narezané na 3 um a upevnené na SuperFrost /Plus kĺzačky (Menzel-Glaser, Braunschweig Nemecko)
Vzorky C /c: tretina dvojica tkaniva vzorky pre klonovanie a sekvenovanie boli získané a rýchlo zmrazený za použitia suchého ľadu (ak je veľkosť lézie povolené).
zo siedmich kontrolných žalúdka bez makroskopických žalúdočných lézií, vzorky a, b a C boli odobraté z normálnej uvedeného sliznice Antrum. Tri z týchto koní boli dodatočne ochutnať v kardia, korpus a dvanástnika rovnako.
Postupy odberu vzoriek sa konal od augusta do októbra nebolo možné získať 2007. Historické údaje týkajúce sa predchádzajúceho zdravia koní.
Fluorescenčné in situ hybridizácia pre baktérie
mikrobiálne detekciu, tkanivové rezy boli hybridizovány súčasne s dvoma 16S rRNA sondami značenými s rôznymi fluorofor. Oligonukleotidové sonda S-D-BACT-0338-a-A-18 zamerané na baktérie (5'GCTGCCTCCCGTAGGAGT3 ") [34] bol 5 'označená fluorescein isothiokyanátem a isothiokyanátu derivátom Cy3. HEL717 oligonukleotidové sonda zacielenia rodu Helicobacter (5'AGGTCGCCTTCGCAATGAGTA3 '), [35] bol 5' označené isothiokyanátu derivátom Cy3. Ak chcete overiť výsledky klonovania tretieho a štvrtého sondu, LC-gProt-1027-AA-17 (5'GCCTTCCCACATCGTTT3 "), ktoré cielia 23S rRNA z Gammaproteobacteria bol 5 'označená fluorescein izotiokyanát a sonda SG-Enteroco-184 (5'CAAATCAAAACCATGCGG3 "), bol označený Cy3 zameranie 16S rRNA Enterococcus spp
[36]. Všetky sondy boli syntetizované v DNA technológie, dánskom Aarhuse. Sklíčka bola zbavené parafínu v xyléne a prenesené do 100% alkoholu po dobu 30 minút pred hybridizáciou. Hybridizácia bola vykonávaná pri 45 ° C s 40 ml hybridizačného pufra (100 mM Tris [pH 7,2], 0,9 M NaCl, 0,1% dodecylsulfát sodný), a 200 ng každej sondy po dobu 16 hodín v prezentácii Rack Sequenza (Thermo Shandon, Cheshire, Veľká Británia). Vzorky potom boli premyté trikrát v predhriatej (45 ° C) hybridizačného pufra po dobu 15 minút a následne trikrát v roztoku predhriateho (45 ° C) pranie (100 mM Tris [pH 7,2], 0,9 M NaCl). Vzorky sa premyjú vodou, sušia sa na vzduchu a montujú v Vectashield (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) pre epifluorescenční mikroskopie. Axioimager M1 vhodným pre epifluorescenčné mikroskopom vybavený pre epifluorescencí s 100-W HBO lampy a filtra sady 43 a 38 boli použité pre vizualizáciu Cy3 a fluoresceín, resp. Snímky boli získané pomocou AxioCam MRM verzia 3 FireWiremonocrome fotoaparátu a softvéru AxioVision verzii 4.5 (Carl Zeiss, Oberkochen, Nemecko).
Vyhodnotenie vhodným pre epifluorescenčné mikroskopom bola vykonaná podľa popisu subjektívne čiastky, morfologického vzhľadu a umiestnenia fluoreskujúce bunky zrejmé, v každej vzorke tkaniva. Okrem toho, všetky sekcie tkaniva boli zafarbené pomocou H &E a vyhodnocované histopatologicky
16S rDNA amplifikácie a klonovania
Po detekcii baktérií pomocou FISH, boli vybrané čiastkové vzorky z koní, ktoré preukazujú baktérií rôznych morfológiou pre 16S rRNA. klonovanie. DNA bola izolovaná zo 4 vzoriek tkanív pomocou Easy-DNA súpravy pre (Invitrogen, Tåstrup, Dánsko) podľa inštrukcií výrobcu. Gen 16S rRNA bola amplifikovaná s použitím primerov SD-Bacto-0008-AS-20 (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 '), [37] a S - * - Univ-1492-AA-19 (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') [38]. PCR cyklovania pozostával z počiatočnej denaturácie pri 94 ° C po dobu 6 min; nasledovaná 30 cyklami denaturácie pri teplote 94 ° C počas 30 s, Annealing pri 55 ° C počas 45 s a predĺženie pri 72 ° C počas 2 min; a záverečná extenzie pri 72 ° C počas 3 min. Amplifikovanej DNA bola overená elektroforézou na agarosovém gélu. PCR produkty boli purifikované s použitím QIAquick PCR Purification Kit kolón (Qiagen GmbH, Hilden, Nemecko). Pre vytvorenie DNA s tupými konci sa vkladá sa zmieša v 0,5 ml mikrocentrifugačných skúmavky, 4 ul 5x pufra T4 DNA polymerázy, 14,7 ul čisteného produktu PCR 0,8 ul dNTP (2,5 mmol l -1 každého) a 0,5 ul (1,2 u) T4 DNA polymerázy (Invitrogen) a inkubovaná pri teplote 12 ° C počas 15 min. T4 DNA polymerázy bol tepelne inaktivovaného a tupé konce DNA sa čistí za použitia stĺpcov purifikačný súpravy QIAquick PCR (Qiagen GmbH) a vymýva v konečnom objeme 10 ul dvakrát destilovanej vody. Nasledujúci popis výrobca sa klonovanie vykonáva za použitia tupým TOPO klonovacia súpravy Zero (Invitrogen). Desať kolónie z každého klonovania boli odobraté a sekvenované na automatickom analyzátora sekvencie (ABI PRISM 373 DNA Sequencer, PE Biosystems, Foster City, CA, USA) za použitia dvoch štandardných vektorových primérov (T3 a T7), súčasťou súpravy. Sekvencia bol zostavený v Bionumerics verzii 4.0 (Applied Math, Sint-Martens-Latem, Belgicko) a skontrolovať chimér ako odstreľovanie jednotlivé sekvencie v GenBank http: .... //Www NCBI NLM NIH gov a softvérovú Pintail verzie 1.1 http: ... //www Cardiff ac uk /BIOS /výskum /Biosoft /. Fylogeneticky analýza klonov, ktoré patria do rodu Escherichia
bolo vykonané stiahnutím 16S rRNA génovej sekvencie dlhšie ako 1200 bp z databázy RDP V.9 Escherichia
typu namáha http: //. RDP CME . MsÚ. edu. Sekvencie boli upravené na rovnakú dĺžku 1327 bp a zarovnané párové (UPGMA) nasledovaný globálne porovnania sekvencií. Finálny fylogenetický strom bol postavený pomocou algoritmu okrsok, kde Enterobacter sakazakii
(AB004746) bol použitý ako outgroup.
Vyhlásenie
Poďakovanie
Autori ďakujú Hanne H. Moller, Katja Kristensen a Johanna Z Amenuvor na technickú pomoc v laboratóriách. Aj vďaka Stina Vesterholm pre pomoc zbieranie tkanív. Táto práca bola podporená Kongeriget Danmark Horseinsurance g /s a ​​Intervet Dánsku. Sponzori nemal účasť v praktickej časti alebo záverov štúdie.
Autorov pôvodné predloženej súbory obrazov
Nižšie sú uvedené odkazy na autorov pôvodnej predložených súborov pre obrázky. "Pôvodný súbor na obr.1 12866_2009_1040_MOESM2_ESM.tiff autorov 12866_2009_1040_MOESM1_ESM.tiff autorov pôvodný súbor" pôvodného súboru pre Obrázok 3 12866_2009_1040_MOESM4_ESM.tiff autorského Obrázok 2 12866_2009_1040_MOESM3_ESM.pdf autorského pôvodného súboru na Obrázok 4 pôvodného súboru 12866_2009_1040_MOESM5_ESM.tiff autorského na obrázku 5 pôvodný súbor 12866_2009_1040_MOESM6_ESM.jpeg autorov na obrázku 6

• Vznik a identifikácia králičím modelu peritoneálnej karcinosou od žalúdka cancer
• NO-indukovanej motility efekty v žalúdku a pyloru fundusu z sGCβ1his105phe mutant mice