Plos ONE: SIRT3 izboljša glikolize in širjenju in-SIRT3 Izražanje želodca raka celic

Povzetek

SIRT3 je ključni NAD ^{+ - odvisno protein deacetilaze v mitohondrijih sesalskih celic, ki deluje za preprečevanje staranja celic in preoblikovanje z regulacijo mitohondrijske presnove homeostaze. Vendar pa je SIRT3 tudi ugotovljeno, da izrazi v nekaterih človeških tumorjev; Treba je pojasniti svojo vlogo v teh-SIRT3 izražanje tumorskih celic. Ta študija je pokazala, da je bila ekspresija SIRT3 povišana v skupini želodčne rakavih celic v primerjavi z normalnimi želodca epitelijskih celic. Čeprav so SIRT3 stopnje izraženosti v želodcu tumorskih tkivih povečala v primerjavi s sosednjimi ne-tumorskih tkivih, so SIRT3 pozitivni rakave celice pogosteje zazna raka želodca črevesne tipa kot želodca raka na razpršeno tipa, kar pomeni, da je SIRT3 povezano s podtipi želodca rak. Čezmerno SIRT3 spodbuja celično proliferacijo in večjo ATP generacije, privzema glukoze, nastajanje glikogena, MnSOD dejavnosti in proizvodnje laktata, ki so zavrla jih SIRT3 rasklapanje, kar kaže, da ima SIRT3 vlogo pri reprogramiranjem bioenergetika v želodcu tumorskih celic. Nadaljnja analiza je pokazala, da SIRT3 interakciji z in deacetilirali v laktat dehidrogenaze A (LDHA), ključni protein pri uravnavanju anaerobne glikolize, krepitev LDHA dejavnost. V konsistenci, je grozd-glikoliza, povezanih genov povečana pri-SIRT3 čezmerno izraženim želodčnih tumorskih celic. Tako je poleg dobro dokumentirano-SIRT3 posredovane mitohondrijske homeostaze v normalnih celicah, lahko SIRT3 izboljšati glikolize in razmnoževanje celic v-SIRT3 izražanju rakavih celic}

Navedba. Cui Y, Qin L, Wu J, Qu X Hou C ned W, et al. (2015) SIRT3 Poveča glikolize in širjenju in-SIRT3 Izražanje želodca rakavih celic. PLoS ONE 10 (6): e0129834. doi: 10,1371 /journal.pone.0129834

Urednik: XiangLin Shi, University of Kentucky, UNITED STATES

Prejeto: 16. april 2015; Sprejeto: 13. maj 2015; Objavljeno: 29. junij 2015

Copyright: © 2015 Cui et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v papir in njene dodatne informacije datotek

Financiranje:. Ta študija je bila delno podprta z National Natural Science Foundation Kitajske, Key Program (30930105), National 05/12 Podpora načrt projekta Ministrstva za znanost in tehnologijo Kitajske (2012BAH30F03), National Natural Science Foundation of China (31070740) je 985 in 211 projekti Xi'an Jiaotong University (JKL), in National Cancer Institute RO1 nepovratna CA152313-01-A1 (JJL).

nasprotujočimi si interesi. avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Sirtuins, družina NAD ^{+ - vzdrževani histonske deacetilaze (HDACs) v sesalcih celice so vpleteni v številnih fizikalnih procesov, vključno preživetja celice, apoptoze, presnove, stresnih odzivov, staranje in dolgoživost [1,2]. Med sedmimi Sirtuin elementov (SIRT1-7), SIRT3 najboljši označen mitohondrijska Sirtuin, delujoč na ureditev mitohondrijev proteine, vpletene v oksidativne fosforilacije, oksidacijo maščobne kisline, sečninskega obroča in antioksidanta odzivu [2-9]. Številne študije so poudarili vlogo SIRT3 pri presnovi in ​​homeostaze v normalnih celicah in razkrila nove cilje in substratov za SIRT3 odvisna od deacetilacije [10]. Kim et al so poročali, da je SIRT3 ključni mitohondriji protein, in pomanjkanje izraza SIRT3 je povezana s povečanim mitohondrijev poškodbe DNA in staranju, kot tudi povečanega tveganja v Ras povzročene transformacije celic in-SIRT3 posredovana aktivacija MnSOD prispeva k mitohondrijev homeostaze [11,12]. V podporo, embrionalne ledvične 293 humanih celic (HEK293) celice kažejo izboljšano SIRT3 izraz pod oksidativni stres, ki vodi do deacetiliranja in aktiviranje MnSOD [13]. SIRT3 je verjel, da deluje kot gen zaviralnih in igra ključno vlogo pri krepitvi celično homeostazo proti staranju in rakotvornost.}

Vendar pa nekateri tumorske celice kažejo izražanje SIRT3 in potencialno vlogo SIRT3 v teh tumorskih celicah , še posebej njegov potencial odnos do agresivnega fenotipa, je sporna [14]. SIRT3 izraz nižji ali nezaznavno na paleto človeških raka, vključno z rakom dojke, glioblastoma, raka debelega črevesa in osteosarkoma, prostati in raka na jajčnikih [11,15,16]. SIRT3 povzroča aretacijo rasti in apoptozo s selektivno utišanje Bcl-2 v HCT116 celic skozi zvezni JNK2 signalne poti [17]. Prav tako je SIRT3 poročajo, da prispeva k povečani občutljivosti človeških levkemije celic kemoterapije po možnosti z indukcijo-mitohondrijev posredovano apoptoze [18]. Po drugi strani pa SIRT3 izraz je tudi ugotovila, je v raka ustne votline, vozlišče-pozitivni rak dojke, rak požiralnika in ščitnice karcinomov povečajo; in povečana SIRT3 je povezana z višjo maligni fenotip in downregulation od SIRT3 poveča občutljivost tumorja na zdravljenje proti raku [19-23]. Ti rezultati opozori drugačno vlogo SIRT3 na posameznih tumorjih, da je treba pojasniti.

Rakave celice so metabolično aktivna in porabijo več celic goriva kot normalne celice. Vendar rakave celice oprto na predvsem na sintezo ATP aerobna glikoliza, funkcijo, znan kot Warburg učinek [24]. Tak aerobna glikoliza je verjel, da zaščitijo rakave celice tvorijo oksidativni stres, saj mitohondrijsko dihanje je glavni vir znotrajcelične ROS [25]. laktat dehidrogenaze A (LDHA) da je encim, ki nadzoruje interkonverzijo med piruvat in L-laktat reverzibilno na zadnji stopnji anaerobne glikolize [26]. Zaviranje LDHA zmanjšuje tumorogeno možnosti z večjo mitohondrijev porabe kisika in zmanjšala mitohondrijsko membrano potencialno [26], in skupna celični ATP proizvodnje in glikoliza [27].

V tej študiji smo raziskovali morebitno vlogo SIRT3 v želodcu rakave celice, ki izražajo SIRT3. Izraz SIRT3 bila povezana z agresivnim rast, ki je bila posredovana preko SIRT3 deacetilirani in aktiviranim LDHA, izboljšanje glikolize in izražanje skupine, glikolize povezana genov. Tako SIRT3-LDHA posredovana presnove glikoliza je lahko potencialno terapevtsko tarčo za zdravljenje rakavih celic, ki izražajo SIRT3.

Materiali in metode

Celične linije in kulture

Human rak želodca celične linije MGC-803, HGC-27, SGC-7901 [28] in AGS [29] in imortalizirana človeška želodca epitelijskih celične linije GES-1 [30] so bile vzdrževane v RPMI-1640 medij (Invitrogen), dopolnjenem z govejim fetalnim 10% serum in 1% penicilin /streptomicina, in kultivirali pri 37 ° C v atmosferi 5% CO2.

imunoprecipitacije in western blot

Subconfluent celice smo lizirali in lizate smo inkubirali s proteinsko A /G agarozni kroglice plus priporočena količina protiteles proti bodisi SIRT3 (Cell signalizacija Technology) ali LDHA (santa Cruze) pri 4 ° C čez noč. Vzorce smo centrifugirali in ločili s SDS poliakrilamidno gelsko elektroforezo in electroblotted na nitrocelulozne membrane. Po blokiranjem s 5% nemastnega mleka v TBST smo membrane inkubirali s primarnim protitelesom pri 4 ° C preko noči čemur sledi inkubacija s sekundarnim protitelesa za 1 uro pri sobni temperaturi. Proteini obresti so bile vidne tudi s ECL odkrivanje komplet (Thermo Fisher).

Imunohistokemija test

Patološke drsi raka želodca s sosednjimi normalnih tkivih so analizirane imunohistokemični testom smo izvedli po navodilih proizvajalca. Komplet Polymer zaznavanja za imunohistokemični analizi je bila kupljena od Zhongshan Golden Bridge biotehnologijo. Na kratko smo parafinski sekcije razvoskani in ponovno hidrirani v etanolu (100%, 90% in 75%). Oddelki inkubiramo s 3% H _{2O 2 pri sobni temperaturi 10 minut in nato blokirali z neimune kozjim serumom pri sobni temperaturi 15 minut. Odseki smo nato inkubirali s primarno protitelo bi SIRT3 (Cell signalnega tehnologiji) za 2 uri pri sobni temperaturi, čemur sledi anti-kunčjega sekundarni inkubacijo s protitelesi za 15 minut pri sobni temperaturi. Odseki smo nato inkubirali z DAB reagentom detekcije za vsako 2 minuti, jih nasprotno s hematoksilinom in dehydraded v etanolu (90% in 100%). Oddelki so bili nameščeni, in je bila analizirana obarvanje pod mikroskopom.}

plazmida visoka in celic transfekciji

SIRT3 celotno cDNA dolžina je sintetiziranih s pomočjo RT-PCR s skupno RNA pridobljen iz celic GES-1 kot Predloga (primerji: 5 'CCGCGGTACCATGGCGTTGTGGGGTTG 3' in 5 'CCGCTCTAGACTATTTGTCTGGTCCATCAAGC 3). CDNA smo nato kloniramo v pcDNA3.1 + ekspresijskem vektorju (Invitrogen). PGPH1 /GFP /Neo-SIRT3-shRNA plazmida ciljanje ljudi SIRT3 (5 'CTTGCTGCATGTGGTTGAT 3) in kontrolno shRNA plazmida so bili pridobljeni iz GenePharma. Če želite ustvariti stabilne transfektanti so AGS in SGC-7901 celice transficirane uporabo Lipofectamine 2000 reagenta (Invitrogen) in stabilne transfektanti jih 400ug /ml G418 (Gibco).

Cell orožja in clonogenicity test
testa proliferacije smo celice prevlečeni v 6 vdolbinami na 2 x 10 sup> 4 celic

merjenje glukoze, laktata in glikogen

fenol rdečega bila prosta sredstvo, uporabljeno za kulture celic v 6-vdolbinicami za 24 ur in ravni privzema glukoze in laktata generacije so bile izmerjene z uporabo Glukoza testu Kit in mlečne kisline Kit (Jiancheng Bioengineering Institute). Relativne vrednosti smo normalizirali na število celic vsako vdolbino. Celični ravni glikogena so odkrili s pomočjo glikogena testu Kit (Biovision). Na kratko, 1 x 10 ^{6 Celice smo homogenizirali v 200μL vode na ledu, in homogenate smo kuhali 5 minut, da inaktiviramo encime in centrifugirali pri 13.000 obratih 5 minut pri 4 ° C, da odstranimo netopno snov. Proizvodnja glikogen je bila izmerjena z vrednostjo OD pri 570 nm.}

Merjenje proizvodnje ATP
so bile izmerjene vrednosti

​​Cellular ATP in ROS kot je opisano zgoraj [32]. Celice kultivirane v 6 vdolbinicami po različnih obdelav, liziramo in celične koncentracije ATP smo izmerili z ATP bioluminiscenčnega preizkusa Kit (Sigma). Za merjenje produkcijo ATP-glikoliza posredovano smo celice obdelali z 2 uM rotenona za 24 ur pred merjenjem.

Merjenje generacije ROS

generacija mobilnega ROS smo testirali s 5- (in 6-) karboksi-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFDA) metoda z uporabo mikroploščnega spektrometer (Thermo Fisher) pri 488 nm /530 nm valovne dolžine.

MnSOD aktivnost

celice kultivirane v 6-dobro ploščo smo lizirali in MnSOD aktivnost je bila določena z WST-8 načinov uporabe MnSOD Preskusno komplet (Beyotime) naslednje navodilih proizvajalca.

tumorogenosti testi v golih miši

SGC7901 celice (7,5 x 10 ^{6) z SIRT3 prekomerno ali rasklapanje suspendiramo v 0,1 ml PBS in vcepimo v vsakem boku 5 tednov starega moškega BALB /c gole miši, in pri 28 th dan po cepljenju, ko je največja količina tumor (~ 1500 mm 3) pa v kontrolni skupini so bili poskusi zaključi in vsi tumorjev iz vsake skupine smo izrezali in stehtali. Eksperimentalni postopek, ki vključuje živali teste je bila izvedena v skladu s smernicami ustanove; Odbor za institucionalne Animal Care in uporaba (IACUC) v Xian Jiao Tong University izrecno odobril ta študija (Protokolx181).}

laktat dehidrogenaze test

laktat je bila določena dehidrogenaze po ustaljeni protokol z merjenjem stopnje zmanjšanja v absorbance pri valovni dolžini 340 nm, ki izhaja iz oksidacije NADH [27]. Na kratko so celice gojili v 10 cm jedi in homogenizirali v PBS na ledu. Homogenate so bili dodani v pufru, ki vsebuje 6,6 mM NADH, 30 mM natrijev piruvat in 0,2 M Tris-HCl, pH 7,3 in mešano. Inkubiramo mešanico za 5 minut, da se doseže temperature ravnotežje in nato vnese stopnjo zmanjšanje absorbance pri 340 nm.

SIRT3 vitro
Deacetilacijo test

Human SIRT3 rekombinantnega encima ( SBT) je bil inkubiran z L-laktat dehidrogenazo iz goveda srca (Sigma) v reakcijskem pufru (50 mM NaCl, 4 mM MgCl _{2, 10 mM NAD ^{+, 50 mM DTT, 50 mM Tris, pH 8,0) z /brez zaviralca SIRT3 nikotinamid (NAM, 10 mM) pri 37 ° C za 1,5 ure, nato pa so bili uporabljeni reakcije za LDHA testom aktivnosti opisano zgoraj.}}

Real-time PCR

Celotno RNA smo izolirali s pomočjo TRIzola Reagent (Invitrogen), ki mu sledi zdravljenje s fenolom /kloroformom in obarjanjem z 2-propanolom. Skupno RNK pelet smo nato sprali s 75% etanolom in ponovno suspendiramo v vodi. RNA je bila izpostavljena obratno transkripcijo z PrimeScript RT-PCR Kit (Takara) in kvantitativni PCR v realnem času analize genov interesov je bila izvedena s pomočjo SYBR PremixExTaq II komplet (Takara) naslednje navodilih proizvajalca. Podatki so bili normalizirajo na raven y-tubulina.

imunofluoroscenca

AGS celice zasejanih na stekelcem v 6 vdolbinicami bile določene v 4% paraformaldehida v 10 minutah in blokirana v 1% BSA 1 uro pri sobni temperaturi. Inkubiramo celice s primarnimi protitelesi proti SIRT3 in LDHA pri 4 ° C čez noč, nato pa inkubacijo s fluorescenčno konjugiranega sekundarnega protitelesa za 1 uro pri sobni temperaturi. Counterstaining je bila izvedena z DAPI uporabo imunofluorescenčni komplet (Beyotime). Celice so bili nameščeni in posnel laserskega skeniranja konfokalnim mikroskopom.

Statistična analiza

Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SE iz vsaj treh neodvisnih poskusih. Statistična analiza je bila opravljena s t testom brez para dvorepe Študentske razen če ni drugače navedeno. P
< 0.05 je zdelo pomembno.

Rezultati

SIRT3 izraz v želodčnih rakavih celic

SIRT3 je dobro opredeljena pri urejanju mitohondrijske homeostaze v anti-aging in anti-transformacijo. V zadnjem času, so poročali različni rezultati glede na inhibicijo celic SIRT3 posredovane in orožja, ki vodi do polemike svojih vlog pri rakih [19,20]. Da bi ugotovili morebitno vlogo SIRT3 na raka želodca, je izraz SIRT3 odkrili v 4 želodčnih linije AGS rakavih celic, SGC-7901, MGC-803, HGC-27 in skupina želodca raka tumorskih tkivih. Ugotovili smo, da so bile ravni SIRT3 beljakovin povišano vseh 4 želodčnih celičnih linijah raka v primerjavi z imortaliziranih želodca epitelijskih GES-1 celic (AGS, 1,9-krat; SGC-7901, 1,5-krat; MGC-803, 2,0-kratno in HGC -27, 1,8-krat v primerjavi z ges-1 celic) (slika 1A). V skladu so bili nivoji mRNA iz SIRT3 v teh celičnih linijah povečala tudi (AGS, 2,6-krat; SGC-7901, 1,7-krat; MGC-803, 2,5-krat; HGC-27, 2,2-krat) v primerjavi s GES- 1 celice (slika 1B).

analiza Imunohistokemija v tumor in sosednjih non-tumorskih normalnih tkiv skupini bolnikov z rakom želodca je pokazala, da so bile SIRT3-pozitivne celice pogosteje zaznati v tumorskih tkivih, kot da je v normalnih tkivih. Rezultati so pokazali, da je 55,1% tumorskih tkiv (7% normalnih tkiv) razstavljeni visoke stopnje (močna pozitivna), 41,4% tumorskih tkiv (28% normalnih tkiv) razstavljene srednje visoko stopnjo (šibka pozitivna), medtem ko je 3,5% tumorja tkiva in 64% normalnih tkivih je bil negativen v SIRT3 izražanja (slika 1C in 1D, S1A Fig). Zanimivo je, da SIRT3 izraz v črevesju vrstah tumorskih tkivih (15 primerov; 93,3% močna pozitivna in 6,6% šibko pozitivno) je bila bistveno višja kot pri difuzni tip tumorskih tkivih (14 primerov; 14,3% močna pozitivna, 78,6% šibko pozitiven in 7.1 % negativno) (slika 1C in 1E, S1B sl). Ti rezultati kažejo, da je SIRT3 izraz v nekaterih tumorjih povečala v primerjavi s sorodnimi normalnih tkiv in SIRT3 izraz lahko razlikujejo v posameznih tumorjih, ki jih je treba dodatno raziskati.

Ravni SIRT3 so povezane s celično proliferacijo

Potem smo ugotovili SIRT3 čezmerno in rasklapanje celične linije z uporabo AGS in SGC-7901 celic. Izraz SIRT3 v stabilnih transfektanti je bil potrjen z Western blot. Čezmernim SIRT3 povečana rast celic, medtem ko SIRT3 rasklapanje rast inhibiral celične obeh želodčnih raka celičnih linij (slika 2A). Poleg tega čezmernim SIRT3 sprožilo več nastanek kolonij od kontrolnih transfekcije celic, ki je bila v nasprotju z le manj kolonij nastale v SIRT3 rasklapanje celic (slika 2B).

Da bi še dodatno opredeliti vlogo SIRT3 pri tumorja sposobnost oblikovanja, smo injicirali SIRT3 čezmerno in rasklapanje SGC-7901 celic v bokih golih miših in rast tumorja je bila dovoljena za 28 dni po celic inokulaciji (S2 slika). Povprečna teža tumorjev, ki izhajajo iz SIRT3 prekomerno ekspresijo celic je 0.7079g, bistveno večja od povprečne teže tumorja nadzora (NC), p
= 0,015 (slika 2C, leva plošča). V nasprotju s tem je bila povprečna teža tumorjev, ki izhajajo iz SIRT3 rasklapanje celic 0.0588g, bistveno manjši kot pri bitki za nadzor shRNA celic (SCR) (0.2033g; p
= 0,009) (slika 2C, prav plošča) . Povprečni obseg tumorjev, ki izhajajo iz SIRT3 prekomerno ekspresijo celic se je povečala kot pri kontrolnih celic (NC) (slika 2C, levo ploščo navzgor desnem kotu). Ravno nasprotno, je bila povprečna količina tumorji rastejo iz SIRT3 rasklapanje celic dramatično majhna v primerjavi s kontrolnih celic (SCR) (slika 2C, desno plošče do desnem kotu).

Okrepljeno glikoliza v SIRT3 izražanju raka želodca celice

smo potem sprašujete, kako celični bioenergetika bi se spremenila v-SIRT3 čezmerno izraženim želodca rakavih celic. SIRT3 overexpression dramatično poveča privzem glukoze (1,4-krat v letnem pregledu rasti in 1,9-krat v SGC-7901), medtem ko SIRT3 rasklapanje (tako v letnem pregledu rasti in SGC-7901 okoli 40%) so se zmanjšale privzema glukoze (slika 3A in 3B). V skladu z vzorcem porabe glukoze, je SIRT3 prekomerno ekspresijo celice povečana raven laktata izločanjem (1,2-krat v letnem pregledu rasti in 1,3-krat v SGC-7901), medtem ko je SIRT3 rasklapanje celice v letnem pregledu rasti in 45 znižane ravni laktata izločanjem (55% % v SGC-7901) (slika 3C in 3D). tudi Ugotovili smo, da je tvorba glikogena znatno povečal, SIRT3 prekomerno (1,5-krat v letnem pregledu rasti in 1,3-krat v SGC-7901), ki je značilnost hitro rast tumorskih celic [33], medtem ko je v letnem pregledu rasti zmanjšala za SIRT3 rasklapanje (40% in 70% v SGC-7901) (Slika 3E in 3F).

SIRT3 je dokazano sodeloval pri deacetiliranja svetovnih presnovnih encimov in vzdrževanje bazalnih ravni ATP v celicah, tako v normalnih pogojih in v bolezni [1 , 2]. Skupaj celični ATP in glikoliza ATP generacija bili odkriti v letnem pregledu rasti in SGC-7901 celic z obeh SIRT3 prekomerno ali SIRT3 rasklapanje. Skupni celični ATP so bile v SIRT3 prekomerno ekspresijo celic večja (približno 1,3-krat v obeh celičnih linijah), vendar se je v SIRT3 rasklapanje celic (okrog 75% v obeh celičnih linijah) v primerjavi z NC ali SCR kontrolnih celic (slika 4A in 4B) . Potem smo zdravijo celice z rotenona, da zavirajo oksidativno fosforilacijo, in preizkušen ATP generacije iz glikolize. Kot je prikazano na sliki 4C in 4D, SIRT3 čezmernim vodilo do povečanja proizvodnje glikoliza ATP (1,4-krat v letnem pregledu rasti in 1,6-krat v SGC-7901), medtem ko SIRT3 rasklapanje privedlo do znatnega zmanjšanja proizvodnje glikoliza ATP (20% v letnem pregledu rasti in 40% v SGC-7901) v primerjavi z NC ali SCR nadzorom.

SIRT3 uravnava homeostazo ROS v želodčnih rakavih celicah

A dokazov podpira, da je povečana raven ROS je kritična značilnost rakavih celic, katerih rakave celice bolj občutljive za dodatno ROS stresa [34]. Tu smo ugotovili, da čezmernim SIRT3 znižala raven ROS 70% in 80% v AGS in SGC-7901 celic, ker zaviranje SIRT3 izražanja povečana raven ROS (1,4-krat v AGS celic in 1,6-krat v SGC-7901 celic) oziroma (slika 5A in 5B). V dogovoru z literaturo, ki prikazuje SIRT3 dezacetiliran in aktivira MnSOD (11, 12), v želodčnih rakavih celic, je MnSOD aktivnost poveča s SIRT3 prekomerno (1,4-krat v AGS celic in 1,2-krat v SGC-7901 celic), vendar zmanjšana za SIRT3 rasklapanje (50% v AGS celic in 65% v SGC-7901 celic) (slika 5C in 5D), kar pomeni, da lahko SIRT3 ščitijo celice pred oksidativnim stresom povzročene škode z vnovično intracelularno ROS s krepitvijo MnSOD dejavnost želodčnih rakavih celic.

SIRT3 dezacetiliran in aktivira LDHA

LDHA igra ključno vlogo pri tumorski začetku, vzdrževanje in napredovanje. Zaviranje LDHA zavira aktivnost tumorjev in napredovanje tumorjev [26,27] in LDHA dejavnosti lahko ureja acetilacija /deacetilacije spremembo [35]. Spraševali smo se, ali je SIRT3 sodeluje pri urejanju LDHA dejavnosti. Ugotovili smo, da je v želodcu rakavih celic, LDHA aktivnost se je znatno SIRT3 povečal prekomerno ekspresijo celic, medtem ko je v primerjavi z NC ali nadzora Scr celic ločeno brez zaznavne spremembe v ravni LDHA beljakovin v stabilnih transfektanti (slika 6A) se je zmanjšalo v SIRT3 rasklapanje celicah. Imunskim barvanjem Rezultati so pokazali, da so bile LDHA in SIRT3 co-lokaliziran v citoplazmi (slika 6B), in co-IP analizo bodisi LDHA ali SIRT3 protitelesa so pokazale, da je SIRT3 sposobna sodelovati z LDHA (slika 6C). Poleg tega je bila stopnja LDHA acetilacije zmanjšal v SIRT3 prekomerno ekspresijo celicah, vendar povečana v SIRT3 rasklapanje celic (slika 6D). Nadalje, in vitro
LDHA test dejavnost izvaja z uporabo komercialno humanega rekombinantnega SIRT3 in goveje srčni L-laktat dehidrogenazo je pokazala, da se je LDHA aktivnost poveča s prisotnostjo SIRT3 v reakciji, ki se je obrnil z dodajanjem zaviralca SIRT3 , nikotinamid (slika 6E). Za identifikacijo potencialno SIRT3 dezacetilacije stran (e) na LDHA, smo iskali bazo podatkov in ugotovila, da so K5, K14, K57, K81, K118, K126, K222 in K318 potencialne acetilacija območja, LDHA in prejšnji študiji so poročali, da je bil K5 acetilacija /Deacetilacijo vpletena v regulacijo LDHA dejavnosti [35]. Potem smo naredili LDHA testa aktivnosti s pomočjo lizin 5 in lizin 318 acetiliranja posnemajo (K5Q /K318Q) ali deacetiliranja posnemajo (K5R /K318R) mutant LDHA, in ugotovila, da ni bilo niti K5 niti K318 ki je potrebna za SIRT3 posredovano aktivacijo LDHA (S3 slika). Nadaljnja opredelitev-SIRT3 posredovana LDHA deacetiliranja je v stiski.

SIRT3 upregulates genov, ki sodelujejo v celičnem metabolizmu

Za označevanje molekularno podpis SIRT3-LDHA posredovanih bioenergetikov v želodčnih rakavih celic, smo meri izražanje genov, povezanih z glukozo prevozom in glikolize. Podatki v Sl 7A in 7B je pokazala, da čezmernim SIRT3 v letnem pregledu rasti ali SGC-7901 inducirane izražanje HK2 (1,47-krat v AGS celicah, 1,3-krat v SGC-7901 celic), MCT4 (2,3-krat v AGS celicah, 1.34 -kratno v SGC-7901 celic) in Glut1 (1,55-krat v AGS celicah, 1,38-krat v SGC-7901 celic) na ravni mRNA testiran s PCR v realnem času. Nasprotno, SIRT3 rasklapanje zmanjšano ekspresijo gena hK2 do 76%, MCT4 do 73% in Glut1 do 62% v AGS celicah, medtem ko hK2 do 80%, MCT4 do 62% in Glut1 do 74% v SGC-7901 celic. Poleg tega, ko je bila prekomerno SIRT3, raven MCT1 mRNA je v AGS celicah, vendar ne v SGC-7901 celic povečala za 1,6-krat, in ko je bil rasklapanje SIRT3 je MCT1 v SGC-7901 celic zmanjšala za 59% v letnem pregledu rasti in 65% oz.

Pogovor

Ta študija zagotavlja dokaze o tem, da SIRT3 izražene v nekaterih rakavih celic, kot so rakave celice želodca, je lahko povezan s povečano agresivnostjo stranskih SIRT3 posredovano bioenergetikov preko deacetiliranja in aktiviranje LADH. Čeprav se kopičijo dokazov kaže, da ima SIRT3 ključno vlogo pri zaščiti normalne celice pred staranjem in maligno transformacijo, njeno funkcijo že transformiranih celic kot tumorskih celicah, ki izražajo potrebe SIRT3 je treba raziskati [19]. Pomanjkanje SIRT3 v MEFs vodi do genomske nestabilnosti in visoko frekvenco transformacije celic, ki jih Ras posredovanega s povečano stopnjo nastanka tumorjev in staranja, ki kaže, da SIRT3 potrebno pri preprečevanju celične staranja in rakotvornost [11,15]. Poleg tega je pomanjkanje ali nižji izraz SIRT3 odkrita v številnih človeških rakih in raven SIRT3 je povezan z občutljivostjo rakavih celic kemo- in radioterapijo [11,15,16]. Vendar SIRT3 je tudi dokazano, izraženi pri človeških rakih in povezane z rezistenco terapijo [19,21,36]. Ti rezultati kažejo, da lahko SIRT3 ciljajo na različne proteine ​​med normalnih in rakavih celic, ter da SIRT3 izraz se lahko spreminja v različne vrste raka, kot so trenutne rezultate, ki nakazujejo, da se črevesna vrsta raka želodca izraža višjo stopnjo SIRT3 kot difuzni vrsta raka želodca.

To je splošno sprejeto, da tumorske celice porabijo več celično energijo za podporo hitro rast in razmnoževanje kot normalne celice, ki uporabljajo glikolize kot glavni vir ATP generacije namesto oksidativna fosforilacija [24] . V sedanjem raziskavi smo pokazali, da se v želodčnih rakavih celicah, SIRT3 komunicira z in dezacetiliran LDHA, ki povzroča povečano LDHA aktivnost; in SIRT3 overexpression vodi v povečano celično proizvodnjo ATP in MnSOD dejavnost vzporedno z zmanjšano celični ravni ROS, kar kaže na povečan oksidativni čistilnega sposobnost SIRT3 možnosti preko-deacetilacije posredovane aktivacije MnSOD encimov. Povečanje dokazi kažejo, da je SIRT3 potrebna za vzdrževanje celičnega in mitohondrijev homeostaze z regulacijo mitohondrije presnovo in sistem bilance celični redoks, ščiti celice pred oksidativnim stresom preko urejanja generacijo ROS, kritično mehanizem staranja, raka in bolezni srca [1,2, 37]. SIRT3 lahko deacetylate skupino ciljev mitohondrije vpletena v regulacijo tako glikolize in celični oksidativnim stresom. V zadnjem času, je SIRT3 ugotovljeno lahko deacetylate in povečati aktivnost piruvat dehidrogenaze v rakave celice, ki se lahko poveča tako mitohondrijev bioenergetikov in glikolize [38]. V dogovoru, trenutna študija kaže, da lahko SIRT3 deacetylate in aktivirati LDHA, ki se lahko uporablja tako za mitohondrijske dihanje in glikolizo. Po drugi strani pa lahko SIRT3 deacetylate in posledično aktiviranje drugih substratov mitohondrije, kot MnSOD [11,12], Foxo3 [39] in IDH2 [9] očistiti ROS proizvaja oksidativne fosforilacije, ščiti celice pred poškodbami oksidativnim [40] . Tudi v skladu s temi ugotovitvami, v tej študiji smo ugotovili, da čezmernim SIRT3 poveča MnSOD dejavnost, ki bi lahko bil eden od razlogov, zmanjšane celični ravni ROS pod okrepljenim celičnega metabolizma stanju.

LDHA, kot družinskega člana laktat dehidrogenaze (LDH), je dalo obstajala v glikoliticna celicah in lokaliziran v mitohondrijih poleg citosolu [41], in v glavnem katalizira medsebojno pretvorbo piruvata in laktata [42]. LDHA je pokazala, da igrajo ključno vlogo pri aerobne glikolize in tumorjev v malignih celic [26,27]. V rakavih celicah, LDHA hitro porabi piruvat, ki ga glikolitski poti, ki vodi k večji aerobne proizvodnje laktata [26]. Zaviranje LDHA povzroča nastajanje ROS, zmanjša celični ravni ATP in zavira glikolize, zato zavira rast celic in sproži celično smrt z rakom [27]. Je sestavljena s temi poročili, smo ugotovili, da lahko SIRT3 interakcijo in aktivirati LDHA. V SIRT3 povečano izražen celice, je LDHA acetiliranje zmanjšala s povečano aktivnost encimov LDHA. Čeprav je treba natančen mehanizem povzroča uredbe LDHA-SIRT3 posredovana treba dodatno raziskati, ti rezultati kažejo, da LDHA nadzorom glikolize pot, ki pospešuje tumorske bioenergetikov lahko vpliva na raven SIRT3 izražanja.

Naša trenutna študija je pokazala tudi, da je izraz skupina genov, kot so MCT1, MCT4, hK2 in Glut1, znan kot ključni regulatorji metabolizma energije v raku so v-SIRT3 čezmerno izraženim želodčnih rakavih celic povečala tudi, kar kaže na potencialno vlogo SIRT3 pri krepitvi glikolize v tumorskih celicah. HK2 katalizira fosforilacijo glukoze v glukoze-6-fosfat v začetni stopnji glikolize [43]. Glukoze transporter (GLUT) nadzira transport glukoze preko plazemske membrane, ki deluje kot prvi korak količinsko omejujočo za presnovo glukoze [44]. MCT1 in MCT4, člani monokarboksilati (kot laktat in piruvat) transporter družine, so vključeni tudi v rasti glikolize odvisna od tumorjev [45]. Skupaj, ti rezultati kažejo na morebitno medsebojno delovanje med SIRT3 in skupino, glikolize, povezanih genov v signalnih tumorja agresivne rasti, ki ga je treba dodatno raziskati.

Na koncu, čeprav SIRT3 dobro označena s mitohondrijski homeostaze proti celici staranje in transformacija se izraz SIRT3 v tumorskih celicah povezana s povečano proliferacijo in agresivnim rast želodca rakavih celic. SIRT3 združljiva in aktivira LDHA, kar vodi k večji glikoliza in ATP proizvodnje, ki je skupaj s povečano mitohondrijsko antioksidativno MnSOD dejavnosti in zmanjšala znotrajcelično raven ROS (a hipotetičnih model je predlagana na sliki 7C). Tako je funkcija-rast spodbujanje za SIRT3 kaže potencialno tarčo za zdravljenje tumorjev z SIRT3 izražanja.

Podpora Informacije
S1 Sl. Reprezentativni patološke tobogani za določitev izraza SIRT3 v človeške želodčne vzorcih raka.
A, rak človek želodca-parafin vgrajeni in v parih, ki mejijo patološko normalne vzorce tkiva so bili izpostavljeni imunohistokemični barvanjem z SIRT3 protiteles (rjave barve), ki mu sledi jedra za nasprotno z hematoksilinom ( blue vsak tumor je bil prikazan s sosednjimi normalnih tkivih v eni vrsti z 20 × in 40 ×). B, reprezentativne podobe SIRT3 izražanja v črevesnih in razpršenih vrst raka želodca. Lestvica bar, 50 um
doi:. 10,1371 /journal.pone.0129834.s001
(IOD)
S2 Sl. Čezmernim SIRT3 spodbuja tumorjev in vivo.
SGC-7901 celice SIRT3 prekomerno (A) ali rasklapanje (B) smo podkožno injicirali v desni bok golih miši z relativnimi kontrolnih celicah (NC ali SCR) v levo bok. Ksenotransplantskih tumorji so izrezali in stehtali na 28. dan po celic cepljenju. Slike desni strani zaslona je pokazala ksenotransplantskih tumorje in vivo na koncu poskusa. Slike so pokazale, rast tumorjev pri miših
doi:. 10,1371 /journal.pone.0129834.s002
(IOD)
S3 Sl.

• Plos ONE: limfnih vozlov metastaze, Unique Independent prognostični dejavnik pri Early želodca Cancer
• Plos ONE: Identifikacija in karakterizacija CXCR4-Pozitivni Rak želodca Stem Cells