Stomach Health > elodec Zdravje >  > Gastric Cancer > želodčni rak

Plos ONE: Glyoxalase-I je nova Prognoza faktorjev, povezanih z Rak želodca napredovanje

Povzetek

Glyoxalase I (GLO1), ki metilglioksal razstrupljanje encim, ki je vpletena v napredovanje človeških malignih bolezni. Vloga GLO1 razvoj želodčnega raka ali napredovanje še ni povsem znan. Izraz GLO1 je bila določena v primarnih želodčnih vzorcih raka uporabljajo kvantitativne verižne reakcije s polimerazo, imunohistokemija (IHK), in analizira western blot. GLO1 izraz je bila višja v želodčnih tkivih z rakom, v primerjavi s tem v sosednjih noncancerous tkivih. Zvišane izraz GLO1 je bistveno povezana s želodčne stene invazijo, bezgavk metastaz in patološko fazi, kar kaže na novo vlogo GLO1 v razvoju želodca in napredovanja raka. Stopnja preživetja 5-letno nižjih GLO1 izraz skupine je bila bistveno večja kot pri višjih izražanja skupin (log rank, P
= 0.0373) v IHC poskusih. Over-izraz GLO1 v želodcu raka celičnih linijah povečuje celično proliferacijo, migracijo in invazivnosti. Nasprotno pa navzdol ureditev GLO1 z shRNA privedla do znatnega zmanjšanja migracije in invazijo sposobnosti. Naši podatki močno kažejo, da visoka izraz GLO1 raka želodca poveča metastaz sposobnost tumorskih celic in vitro
in in vivo
, in podpira njegovo učinkovitost kot potencialni marker za odkrivanje in prognozo raka želodca

Navedba. Cheng WL, Tsai MM, Tsai CY, Huang YH, Chen CY, Chi HC, et al. (2012) Glyoxalase-I je nova Prognoza faktorjev, povezanih z želodca raka napredovanje. PLoS ONE 7 (3): e34352. doi: 10,1371 /journal.pone.0034352

Urednik: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Združene države Amerike

Prejeto: 8. december 2011; Sprejeto: 27. februar 2012; Objavljeno: 29. marec 2012

Copyright: © 2012 Cheng et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprta s sredstvi iz Chang-Gung univerze, Taoyuan, Tajvan (NMRPD 150311, NMRPD170441-42, CMRPG 640042-43, CMRPG 670291-93) in National Science sveta Republike Kitajske (NSC 95-2314-B-182 -027, 97-2314-B-182-009-MY2, 99-2314-B-182-022). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je četrta najpogostejša oblika raka in drugi najpogostejši vzrok umrljivosti, povezane z rakom po celem svetu [1]. Maligne bolezni je šesti najpogostejši vzrok smrti zaradi raka v Tajvanu [2]. Pravilno presejanje lahko olajšajo odkrivanje raka želodca pred razvojem simptomov pri utrjevalne faze [3]. Določanje izražanja profilov ključnih molekul v različnih poti, ki sodelujejo v želodčni napredovanje raka, lahko pomagajo pri diagnozi, prognozi in napoved napredovanja tumorja.

Tumor invazija in metastaze so ključni koraki pri določanju agresivni fenotip človeških raka in predstavljajo glavne vzroke smrti, povezanih z rakom [4]. Visoka izraz dejavnikov, povezanih z migracijami, kot so ciklooksigenaze 2 (COX-2) [5], žilnih endotelijskih rastnih faktorjev (VEGF) [6], CXC kemokin ligand (CXCL) -8 [7], kemokin (CXC motiv) receptorjev (CXCR) -2, in CXCL-1 [8], so povezane z želodčno napredovanje raka. Več možnih onkogenih poti (širjenje /izvornih celic, NF-κB, in NT /β-catenin) so deregulacije v večini želodčnega raka [9]. Tako bi dodatno pojasnitev natančnih molekularnih dogodkov, ki vodijo do želodca napredovanje raka in identifikacijo dragocenih diagnostičnih in prognostičnih označevalcev in novih terapevtskih strategij znatno klinično vrednost.

Glyoxalase I (imenovana tudi GLO1) je bistvena sestavina na poti, ki vodijo do razstrupljanje metilglioksal (MG), ki je eden od stranskih produktov glikolize [10], [11], [12]. GLO1 izraz je v številnih človeških raka kolona, ​​dojke, prostate in melanoma [13] poveča [14], [15], [16], [17]. Nedavne študije so poročali, da je prekomerno izražanje GLO1 povezana z napredovanjem raka in odpornosti na zdravila [17]. Iz naše prejšnje podatkov je GLO1 Povecanje opazili pri želodčnih vzorcih raka uporabo cDNA mikromrež [18]. Vendar pa je posebna vloga GLO1 v želodcu tumorigeneze in klinični pomen je treba še določiti.

Naši poskusi jasno kažejo, da je GLO1 pogosto preveč izražen v rakom želodca in povezana z rakom metastaz. Predvsem izraz GLO1 je bistveno višja v poznejših fazah raka želodca. Poleg tega spremembe izraz GLO1 v želodcu raka celičnih linijah vpliva migracije celic in invazijo sposobnosti.

Materiali in metode

Etika Izjava

Protokol študije je odobril Medical etika in Human Trial odbor Klinični Chang Gung Memorial Hospital (IRB NO. 95-0472B). Pisna privolitev je bila pridobljena iz vseh bolnikov

Predmeti

114 bolnikov (64 moških in 50 ženskih, povprečna starost, 66 let, razpon 28-86 let). Diagnosticiranih z rakom želodca Na Chang Gung Memorial Hospital od leta 2000 do 2005 so bili vključeni v to študijo. Vsi bolniki so prejeli operacijo zaradi primarnega raka želodca brez predhodne kemoterapije ali radioterapije. Vsak bolnik je bil izpostavljen želodčne resekcijo (35 bolnikov je doživel celotnega želodca in 79 po delni odstranitvi želodca).

Clinicopathological študije

odstranjenimi vzorci so bili pregledani patološko uporabljajo merila za japonski splošnih pravilih za Rak želodca študija [19] in Skupni odbor ameriške raka (AJCC) sistem (pTNM) razvrstitev [20]. Clinicopathological vključiti parametre, starosti bolnika in spol, lokacijo in velikost tumorja, bruto (BORRMANN je) vrsto tumorja, stenske invazijo, resekcija marže, histološki tip, bezgavko metastaze, žilno invazijo, limfni invazijo in perinevralni invazijo. Po odpustu imeli vsi bolniki redne nadaljnje obiske na oddelku za ambulantno Chang Gung Memorial Hospital do smrti ali začetku priprave tega članka.

Real-time kvantitativno reverzno transkripcijo verižne reakcije s polimerazo (QRT-PCR )

QRT-PCR smo izvedli, kot je opisano v prejšnjem poročilu [21]. Uporabljene so bile naslednje primerji: človek GLO1
QRT-PCR (naprej primer, 5'-TGAGGATAAAAATGACATCCCTA- AAGA-3 ", in obratno primer, 5'-TGTGTCAGCTCAAGTGTAGCTTTC-3 '), človekove 18S rRNA QRT-PCR (naprej primer, 5'-CGAGCCGCCTGGATACC-3 ", in obratno primer, 5'-CCTCAGTT CCGAAAACCAACAA-3 ').

Izdelava anti-GLO1 protitelesa

cDNA, ki kodira celovečerni GLO1
smo klonirali v pGEX-4T1. Lizati iz E. coli
BL21 sev smo očistili z glutationa-agaroza kroglice (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Topne proteine ​​smo očistili s pomočjo kromatografije z glutation-agarozne kroglice, v skladu z navodili proizvajalca, emulgiranih s adjuvans, uporabljen za imunizacijo zajcev. Poliklonalna protitelesa so bili proizvedeni in afiniteta, očistimo, kot prej [22] opisano. Specifičnost in-house GLO1 bila potrjena z uporabo zahodni analizo blot (Slika S1).

Imunoblot analiza

Cela celični lizati, jedrske ekstrakti, in pogojnih mediji so bili pripravljeni iz človeških tkiv ali stabilno GLO1 rasklapanje celične linije. Western blot smo izvedli z uporabo monoklonskih protiteles proti človeški HIF-1 a (Abcam, San Francisco, CA), p65 (Epitomic, BURLINGAME, CA), ali P50 (Millipore, Billerici, MA) ali poliklonskih protiteles proti človeški GLO1 (in-house, redčenje, 1:500), CXCL1 (PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ), CXCL8 (R &.. D Systems Inc., Minneapolis, MN), VEGF (santa Cruz Biotechnology, santa Cruz, CA)

Imunohistokemija (IHC)

formalin-fiksno in parafinske vgrajeni tkiva so bili pregledani z IHC pomočjo poliklonsko protitelo proti človeški GLO1 lastne produkcije (redčenje, 1:3000) kot avidin-biotin kompleks (ABC ) Postopek, kot je bilo prej [23] opisan [24]. Primerjave so bile izvedene med intenziteto obarvanja celic karcinoma in benigne površinskega epitela, ki so bili dani na isti diapozitiv. Za semi-kvantitativno analizo GLO-1 radioinkorporacijo, je bila uporabljena Histoscore (H) -scoring sistem [25]. Na kratko, negativni skupina sestavljena iz rakavih celic z zaznati (-) ali samo v sledovih obarvanja za GLO-1 (+1). Pozitivna skupina sestavljena iz rakavih celic z zmernimi (2) ali visoki ravni (+3) GLO-1 radioinkorporacijo. H-sedaj je bila izračunana in v povprečju z dvema neodvisnima patologi, zaslepljeni z začetno oceno za vsakega pacienta. Rezultate smo dosegel pomnoži odstotek pozitivnih celic (p) intenzitete (I), po formuli: H = P x I. Na primer, odsek, v katerem je imelo 10% tkiva za obarvanje oceno +1, 60% točk +2 in 30% na rezultat +3, H = (10 x 1) + (60 x 2) + (30 x 3) = 220.

Vzpostavitev GLO1 prekomerno ekspresijo v celični liniji SC-M1

smo uporabili celično linijo SC-M1 izražajo nižjo stopnjo GLO1. Transfekciji GLO1
cDNA smo izvedli z Lipofectamine Reagent (Life Technologies, Grand Island, NY). Po inkubaciji 24 ur, smo celice prenesejo v mediju, ki vsebuje G418 za izbor, in so bili nato uporabljeni pri orožja, migracije, in invazijo testih.

Vzpostavitev GLO1 rasklapanje v TSGH in AGS celičnih linij

Dve človekovih želodca rakave celične linije, AGS, in TSGH, so bili zaposleni. Na kratko Ostra RNA (shRNA) sekvence ciljanje GLO1
(TRCN0000118630 ​​in TRCN0000118631) so bili kupljeni od National RNA Interference Core Facility (Inštitut za molekularno biologijo, Academia Sinica, Tajvan). Poseben zatiranje GLO1 je bila potrjena z uporabo Western blot analizo.

Cell širjenje test

Cells (1 × 10 4) gojimo na 6 cm ploščo pri 37 ° C pod 5 % CO 2. V vsaki časovni točki, je bila stopnja rasti celic določi štetje celic. Rezultati so podani kot kratno glede na vsakega kontrolnega vrednosti spremembe.

In vitro
vsebnosti migracije in invazivne dejavnosti

Učinek izčrpanja GLO1 ali prekomerno ekspresijo na migracije in invazivne aktivnost želodca raka celičnih linij je bila ocenjena s pomočjo hitrega in vitro
test (Transwell tehnika), kot je opisano zgoraj [26].

priprava RNA in analize mikromrež

-GLO1 utišan klon TSGH (KG2) in nadzor celica klon (C1) smo na kratko splaknili z ledeno mrzlo PBS in lizirali v TRIzola reagenta (Invitrogen) za ekstrakcijo RNA. Gene izraz profili med KG2 in C1 celic smo analizirali s človeško U133A GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA), v skladu s protokolom proizvajalca [27].

Statistična analiza

The GLO1 izrazov vsaka podskupina clinicopatholgoical parametrov v tabeli 1 so izražene kot povprečne ± standardni odklon (SD) z rezultatom IHC bolnikov v tej podskupini. Test Kolmogorov-Smirnov je neparametrični preizkus za primerjavo vzorcev z distribucijo referenčni verjetnosti. Kadar je to primerno, je bil uporabljen Mann-Whitney U ali Fisherjev natančni test za primerjavo med obema skupinama, Kruskal-Wallis ali Pearsonov test hi-kvadrat, medtem ko je bila uporabljena za primerjavo več kot dve skupini. Razmerje med podatki, pridobljenimi iz dveh različnih preiskav smo analizirali s testom korelacija Spearman je. Bolnike so spremljali do časa rokopisu priprave ali smrti. Izid preživetje raka specifične smo določili po metodi Kaplan-Meier za vse bolnike, razen tistih, ki so umrli od kirurških zapletov. Preskus log-rank je bila uporabljena za primerjavo napovedni pomen posameznih spremenljivk na preživetje. Cox sorazmernih tveganj model je bil zaposlen v multivariatne analize opredeliti neodvisne predvidevanja za preživetje. P
vrednosti <. 0.05, so bile obravnavane pomembne

Rezultati

GLO1 mRNA in beljakovin ravni so povečana pri bolnikih želodca z rakom

Z cDNA mikromrež smo so ugotovili več molekul gene iz želodca tkiv, v primerjavi s sosednjimi nontumorous tkiva [18]. Med temi geni, smo se osredotočili na GLO1
kot molekularne tarče za rakom želodca. Izraz GLO1 bila izmerjena v rakavih tkiv in primerjali s tem v ujemajočo nontumorous želodčne sluznice s pomočjo QRT-PCR (n = 89) (tabela 2) ali IHK (n = 114) (tabela 1). Podatki iz QRT-PCR eksperimentov je pokazala GLO1 čezmerno (≥1.5-kratno) v 51 (57,3%), želodčnih tkiv rakom, v primerjavi s noncancerous tkiva. Povprečni GLO1 izraz v tumorskih tkivih je 2,87-krat, da se v noncancerous tkivih. Naši rezultati so potrdili precejšnje povečanje GLO1 izražanja v tumorskih tkivih ( P
= 0,005, ena vzorec Kolmogorov-Smirnov test).

Izražanje GLO1 beljakovin v parnih vzorcih je bila dodatno analizirali z western pivnik. Slika 1A predstavlja GLO1 izraz v osmih reprezentativnih bolnikih. Enake količine celokupnih proteinov obarvanih s Coomassie modrim po SDS-PAGE smo uporabili kot kontrolo obremenitve. Vse rak tkiva iz vzorcev želodca raka (G1, da G8) prikaže molekul GLO1 izraz, v primerjavi z ujemajočo noncancerous sosednjo sluznice (sl. 1A).

imunskim barvanjem dokazuje GLO1 protein prekomerno ekspresijo v želodcu rakavih tkivih

Da bi še ugotoviti, ali je GLO1 Povecanje v korelaciji s klinično napredovanje raka želodca, je IHC izvedena na parafinskih določen želodčnega tkiva raka in se ujema noncancerous sluznico 114 bolnikih. Štirje pari reprezentativnih primerov (a /b, c /d, e /f in g /h) so prikazani na sliki 1B. Podatki IHC za noncancerous sluznici kolegi (a, c, e, g) in rakavih tkiv (b, d, f, in h) smo primerjali v parih. Temno rjava imunskim barvanjem je predvsem razširjena v rakavih celicah pa so bile stopnje barvanjem nižje v stromalnih celic ali fibroblasti v želodcu tkiv raka. Močno obarvanje za GLO1 so pogosto opazili v naprednih želodčnih tumorskih celicah, v nasprotju s šibko ali brez obarvanja v normalnih želodčnih epitelnih celic (sl. 1B, zgornji plošči). Obarvanje je bilo bolj intenzivno v poznejših fazah želodčnega raka [fazi III v sliki. 1B (f, h)], v primerjavi s stopnjami I [sl. 1B (b)] in II [sl. 1B (d)]. Med 114 bolniki analiziranih, povprečna ocena IHC v tumorskih tkivih je bila 139,8 ± 62,8, kar je bistveno večja od (36,7 ± 40,4), v ujemanja sosednji sluznice (n = 87) ( P
< 0,001 , Wilcoxonov podpisan-rank test). Poleg tega so v paru primerjavo radioinkorporacijo za GLO1 (n = 87) je pokazala, da so bili IHC mnogo rakavih tkiv višje od cen nontumorous kolegi v 77 (88,5%) bolnikov, enako pri treh bolnikih (3,4%) in nižja v sedmih bolnikov (8,0%).

GLO1 izražanja in klinične korelacije

GLO1 izraz v tumorskem tkivu ni bistveno povezana s starostjo, lokacije tumorja ali histološki tip (tabeli 1 in 2). Višje stopnje GLO1 so bile vidne v T3 /T4 skupin, kjer je bil serozne površino želodčne stene napadel rak, v primerjavi da je v T1 /T2 skupinah, kjer je bila vidna nobena invazija ( P
= 0,015 za QRT - PCR in P
= 0,001 za IHC; Slika 2A, tabeli 1 in 2).. Izražanje GLO1 se je znatno povečala, z metastazami v bezgavkah ( P
= 0,001 za QRT-PCR in P
< 0,001 za IHC;. Sliki 2B; tabeli 1 in 2) . Višje izraz je očitno pri bolnikih z limfno invazije ( P
= 0,001 in P
= 0,016 za QRT-PCR in IHC zaporedju; tabelah 1 in 2) in perinevralni invazije ( P
= 0,024 za QRT-PCR, tabela 2). Povečano izražanje GLO1 ni bila povezana z vaskularna invazija ali oddaljenih metastaz, vključno s peritonealno setve ali metastaz jeter, v obeh QRT-PCR in IHC eksperimentov. Izražanje GLO1 je bila bistveno višja pri bolnikih z bolj naprednimi patoloških stopnjah (III /IV), raka želodca, v primerjavi s tistimi v prejšnjih patoloških fazah (I /II) ( P
= 0,001 in P
< 0,001 za QRT-PCR in IHC oz) (slika 2C;. tabeli 1 in 2)

Survival izide

pomeni trajanje obdobju spremljanja za. 52 preživelih je 70.4 mesecev (razpon, 28-119 mesecev). Štirje bolniki umrli postoperativnih zapletov in šest drugih vzrokov. Dvainpetdeset bolniki umrli zaradi želodca napredovanje raka. Skupen splošni Petletno preživetje 114 bolnikov po želodca je bila 49,3%. Za določitev vpliva GLO1 izražanja na rezultatih preživetja, je bil pacient razdelimo v dve skupini, višjih in nižjih izrazov, glede na mejno vrednostjo, ki bi dokazali signifikantne razlike (log rang P
< 0,05) stopnje preživetja med 2 skupinama. Mediana (= 140), zgornji kvartil (= 180 ali 75 percentil) in spodnji kvartil (= 90 ali 25 percentil) za IHC rezultati našega bolnika so bili prvotno testirana za določanje vrednosti časovnem prelomu. Med njimi je bilo samo spodnji kvartil kažejo pomembne razlike v rezultatih preživetja. Fig. 2D prikazuje kumulativne krivulje preživetja bolnikov v nižjih in višjih GLO1 skupin izražanja, ki je razdeljen glede na mejno oceno IHC od 90. Stopnja preživetja 5-letno izražanja skupin nižji GLO1 je bistveno večja od višjih izražanja skupin ( 69,6% proti 43,3%; log čin P
= 0.0373) v IHC poskusih. Univariatna analiza razkrila številne pomembne prognostičnih dejavnikov, vključno s statusom bezgavkah metastaze, oddaljenih metastaz, peritonealne setve, vaskularne invazije, limfnega invazijo, globina invazije, patološkega fazi metastaz jeter in perinevralni invazije, poleg GLO1 izraz. Drugi pomembni parametri so histološki tip, velikost tumorja, in bruto vrsto (tabela 1). Poleg tega je v multivariatno analizo, neodvisni napovedni dejavniki, ki vplivajo na preživetje bolnikov, vključenih bezgavko metastaze (relativno tveganje = 5,954; 95% CI = 1,183-29,977, P
= 0,031) in oddaljenih metastaz (relativno tveganje = 2,464, 95% CI = 1,030-5,896, P
= 0,043).

Prekomerno izražanje GLO1 v SC-M1 povečuje širjenja celic, migracije in invazijo dejavnosti.

določiti učinke pretiranega izražanja GLO1
v SC-M1 celic, celično proliferacijo, migracijo in invazijo aktivnosti smo testirali. Po dveh tednih transfekciji je bila določena stabilna izraz GLO1 proteina. Slika 3A prikazuje 2,36-krat in 2,29-krat večje, GLO1 izraz oz. Celično proliferacijo določimo s celično štetje in označena kot gube nadzora za največ pet dni. GLO1
-overexpressing celic precej razstavljal ( P
< 0,01) višje stopnje orožja (1.86- ali 2,06-krat) od tistih transfekciji s kontrolno vektor na dan 5 (slika 3B.). Poleg tega, GLO1
-overexpressing celice bistveno prikazane ( P
< 0,01) višje stopnje migracije (5.53- ali 4,57-krat) in invazivne sposobnosti (3.7- ali 3,47-krat) od njihove kontrolni kolegi (sl. 3C in D). Slike gostote celic so bili prikazani za dva nadzora in dveh prekomerno izražanje celičnih linij (levo plošče na sl. 3C in D).

Dol-izražanje GLO1 v TSGH ali AGS celic zmanjšuje migracijo celic in invazijo dejavnosti

Naši rezultati so potrdili visoko izražanje GLO1 pri napredovalem raku želodca, v primerjavi z noncancerous želodčne sluznice. Da bi ugotovili, ali je GLO1 izraz povezan z invazivnosti želodca raka celičnih linij, so bili ocenjeni učinki tanjšanja GLO1 uporabljajo kratek Ostra (sh) RNA plazmidov na invazije tumorskih celic dejavnosti TSGH ali AGS celic. ShRNA ekspresijski vektorji, ki kodirajo zaporedja antisens GLO1 smo transfektirali v TSGH in AGS celičnih linij, ki izražajo visoke nivoje endogenega GLO1. GLO1 izraz je precej potlačeno v TSGH-kg1, -KG2 (0.32- in 0,14-krat) in AGS-KS1, -KS2 (0.26- in 0,21-krat) sublines, oziroma, v primerjavi s tistim v celicah transfekciji z vektorji nadzora ( C1, C2;. sliki 4A in B). Kg1 in KG2 GLO1-izčrpanih celic bistveno razstavljene ( P
< 0,05) znižane stopnje migracije (0.16- ali 0.044-krat) in invazijo sposobnosti (0.43- ali 0,29-krat) kot kontrolni vektor -transfected celice (sl. 4C in D). Podobne rezultate smo dobili s AGS-KS celic (KS1 in KS2) (sl. 4E in F). Naši rezultati skupaj kažejo, da GLO1 pozitivno ureja migracije in invazijo sposobnosti želodca rakavih celic.

Dol-izražanje rezultatov GLO1 v zmanjšano izražanje genov, ki sodelujejo pri-metastazami povezano poti

Če želite ugotoviti, ali GLO1 protein vpliva, povezanih z metastazami geni, smo primerjali genoma vsej izraz KG2 in C1. je bilo izbranih več genov molekul (≥1.5-krat) v C1, v primerjavi z KG2. MetaCore ™ analiza [28] je pokazala, da so vrhunske molekularne poti spremenijo v KG klonov adhesion_cytokines in lepljenja poti. Proteini [kot MMP (MMP), CXCL8 in CXCL1], vključenih v teh poti so navzdol urejeno na GLO1 utišanja. Med poti, povezane s citokini so visoka ekspresija VEGF, CXCL8, CXCR2 in CXCL1 povezan z metastazami in napredovanja raka [8], [29]. Prej, Daniel J. sod.
[30], poročali, da bi prekomerno ekspresijo GLO1 okrepitev stromalni celic izpeljane faktor-1 (SDF-1), CXCR4 in VEGF ekspresijo v hipoksične endotelijskih progenitornih celic kulture visoko glukozo. Zato smo analizirali tudi ekspresijo VEGF v KG stabilnih linij.

nadalje potrdil ekspresijskih vzorcev proteinov v VEGF ali poti, povezane s citokini preko Western blot analizo. Ravni ciljnih genov, vključno CXCL1, CXCL8, CXCR2 in VEGF, so bistveno zaviral TSGH-KG stabilen celičnih linijah (kg1 in KG2), v primerjavi s prenašalci transfekcije nadzora (sl. 5A). Poleg tega raven NF-κB in HIF1-a, znanih transkripcijskih faktorjev pro-angiogenskih rastnih faktorjev (kot CXCL8, CXCL1 in VEGF) [31], so bile v jedrih TSGH-KG stabilne celične linije zmanjša v primerjavi s kontrolnimi celicami (sl. 5A). MMP2 in MMP9, ključni encimi za ponižujočega kolagena tipa IV, so verjeli, da imajo ključno vlogo pri tumorske invazije in metastaz [32]. Predvsem, izčrpavanje GLO1 privedlo do izrazitega zatiranju MMP2 in MMP9 dejavnosti (sl. 5b). Naši podatki kažejo, da GLO1 regulira aktivacijo-metastazami, povezane signalnih poti v želodcu rakavih celic. Na podlagi teh ugotovitev predlagamo, da GLO1 posreduje migracije želodčni rak celic in vdor vsaj delno posredovano z aktivacijo CXCL1, CXCL8 in VEGF.

IHC kaže soizražanjem GLO1 z CXCL1 in CXCR2 proteinov in njegova pretirana izraz v želodčnih rakavih tkivih

Prejšnje študije so poročali, da so interakcije citokinov receptor in VEGF signalne poti, povezane s malignosti funkcij pri bolnikih z rakom želodca [8], [33]. Prej, naša skupina je pokazala pomembno združenje CXCR2 in CXCL1 prekomerno ekspresijo (n = 116) z želodčno napredovanje raka [8]. Dosledno, pri analizi IHC, je bila pozitivna korelacijo nahajajo izključno med sto GLO1 in CXCL1 ali CXCR2 v tumorskih tkivih (Spearman je koeficient korelacije = 0,238 in 0,293; P
= 0.013 in P
= 0,003). Poleg tega imunskim barvanjem zaporednih odsekov pokazalo, izraz GLO1, CXCL1 in CXCR2 proteinov v epitelnih celic tumorjev [Sl. 5C (b), (d) in (f)], v nasprotju z nobenimi ali nizkega izražanja v noncancerous tkivih [sl. 5C (a), (c) in (e)].

Diskusija

Kot drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka, raka želodca ostaja izziv bolezen. Podatki iz te študije so pokazale, da je Povecanje od GLO1 v želodčnih tkivih raka značilno povezana z napredovanja tumorja in poznejših fazah bolezni. Konkordantno so bolniki z nižjimi stopnjami GLO1 boljšo prognozo bolezni. Poleg tega QRT-PCR in IHC poskusi razkriti korelacijo povečanega izražanja GLO1 z lokalnimi napredovanja tumorja in bezgavk invazijo. Opazili smo izrazito zmanjšanje v metastazami in invazijo sposobnosti GLO1 pomanjkanjem celic, sočasno z zmanjšanimi ravnmi več-metastazami, povezanih dejavnikov, vključno VEGF, CXCL1, CXCL8, MMP, in CXCR2. V študiji IHC opazili pozitivno korelacijo med GLO1 in CXCL1 vzorcev izražanja v odstranjenimi primerkov raka želodca. Poleg tega je povišana GLO1 in sočasna CXCL1 prekomerno ekspresijo pri bolnikih z rakom želodca so bistveno povezana s preživetjem. Naši rezultati zagotavljajo neposredne dokaze, ki podpirajo udeležbo GLO1 v želodca napredovanje raka in moči preko menjavanja njenih migracijskih in invazijo poti spodnjem toku.

Visoka izraz GLO1 je bila povezana z več raka [16] [17] . Nedavne študije so pokazale, ključno vlogo GLO1 na več vrst raka pri odstranitvi metilglioksal (MG), ki velja za carcinostatic, zaradi česar je razvoj inhibitorjev GLO1 kot antitumorska sredstva [34], [35]. Tako je visoka ekspresija GLO1 vpleten v odpornosti rakavih celic apoptozo s antitumorska sredstva [36] inducirane. Sakamoto et al.
[36] predlagala, da se GLO1 ni samo tumor, temveč tudi odpornost na zdravilo marker. Dosledno bili GLO1 razgradljiv-klone občutljiv za več kemoterapevtiki kot kamptotecina, etopozid (podatki niso prikazani). Klinično, naši rezultati kažejo, da je GLO1 zelo izražena v raka želodca in značilno povezana z napredovanja tumorja in poznejših fazah bolezni.

glikoliticna sprememb v rakavih celicah predstavljajo presnovno prilagajanje hipoksičnih tumorjev preko delovanja hypoxia- povzroča transkripcijski faktor (HIF-1) [37], [38]. Poleg tega so transkripcijski faktorji, HIF1-a in NF-κB, igrajo ključne vloge v različnih procesih, kot so vnetja, mikrobiološkega ubijanjem in napredovanje raka [39]. Zdi tumor hipoksija se močno povezana z razmnoževanjem tumorja, malignega napredovanja in odpornosti na terapijo. HIF-1α steze jasno vključen v karcinogenosti raka želodca [39]. Poleg tega je imunohistokemični izražanje HIF-1α ciljnih genov (Glut1, VEGF, CA9, iNOS) povezana z želodčno napredovanja tumorja [40]. Med onkogenih poti, se NF-κB signalizacijo povišano pomemben delež želodčnega raka [9]. Poleg tega je več linij dokaz podpore presluha med NF-κB in signalnih poti HIF-1 a [41]. V naših poskusih, so bile ravni obeh HIF-1 a in NF-κB v jedrih na GLO1 utišanje zmanjša v želodcu raka celičnih linijah, skupaj z nadaljnjim ciljnih genov (VEGF, CXCL1, CXCL8, MMP).

V našem študija, nenormalno povišana GLO1 izraz je bilo povezano s progresivno fenotipov, kot so želodčne stene invazije, bezgavk metastaze, patološko fazi, in limfno invazijo. Prej smo poročali, da je povišana CXCL1 in CXCR2 raka želodca povezana z napredovanja tumorja, in da je lahko raven CXCL1 plazmi koristno kroži biomarker za želodčni diagnozo raka [8]. Tukaj smo pridobili neposredno kliničnih znakov močne korelacije med izražanja vzorcev GLO1 in CXCL1 ali CXCR2. GLO1 izraz je lahko povezano z aktivacijo citokinov receptorja povezano in VEGF signalnih poti, ki predstavljajo potencialno mehanizma za okrepljeno gibljivost in invazivne sposobnosti. Naši rezultati potrjujejo prekomerno izražanje GLO1 karcinoma želodca in njene močne povezave z napredovalih stopnjah in slabo prognozo. Prejšnje študije, ki jih naše skupine so pokazali, da SPARC [18], CLIC1 [42], SLPI [43], CXCL1, CXCL8 in CXCR2 so zelo izražena in je povezano s poznejših fazah in slabo prognozo raka želodca [8]. Te nove potencialne biomarkerjev se zato lahko uporabijo za izboljšanje specifičnost in občutljivost želodca diagnozo raka. Nadaljnji razvoj in potrditev koristnosti teh označevalcev v večjih skupin bolnikov, se bodo lahko privede do kliničnih aplikacij.

Podpora Informacije
Slika S1.
specifičnost v hiši GLO1 je potrdil zahodni blot analizo. smo uporabili zajec poliklonski anti-GLO1 protitelo (desna slika) in negativni kontrolni vnaprej imunske serume (leva slika). Stopnja GLO1 beljakovin je bila določena v TSGH-C1 in -KG2 želodca celičnih linij z GLO1 protitelesa v hiši. β-aktina je bila uporabljena kot notranji nadzor pri vseh lizatov celic
doi:. 10,1371 /journal.pone.0034352.s001
(TIF)

Other Languages