Plos ONE: Izboljšanje učinke sevanja, ki ga ursolna kisline v BGC-823 Human Adenokarcinom želodca Cancer Cell Line

Povzetek

Nedavna raziskava je predlagal, da nekatere pridobiva iz rastlin polifenole, tj ursolna kislina (UA), ki so poročali, da imajo protitumorne aktivnosti, se lahko uporablja za osveščanje tumorskih celic za zdravljenje z obsevanjem z zaviranjem poti vodi do odpornosti na zdravljenje sevanja. Ta poskus je bil zasnovan za raziskavo učinkov in možnega mehanizma radiosenzitizacijo z UA v celični liniji BGC-823 iz človeških adenokarcinomom raka želodca in vitro
. UA povzroča citotoksičnost na način, ki je odvisen od odmerka, in smo uporabili koncentracijo sub-citotoksičnosti UA preizkusiti radioenhancement učinkovitosti s UA raka želodca. Radiosensitivity je bila določena z klonogene testom preživetje. Preživeli del kombinirane skupine s obsevanje in sub-citotoksičnosti UA bistveno zmanjšala v primerjavi s skupino obsevanje. izboljšana Učinkovitost radiosenzitizacijo bila povezana s povečano G2 /M aretacijo, povečana reaktivne kisikove spojine (ROS), navzdol regulirano raven Ki-67 in izboljšano apoptoze. Skratka, kot UA je pokazala močan antiproliferation učinek in sinergijski učinek, da se lahko uporabijo kot potencialni preobčutljivost drog za uporabo radioterapije

Navedba. Yang Y, Jiang M, Hu J, Lv X, Yu L Qian X, et al. (2015) povečanje učinke sevanja, ki ga ursolna kisline v BGC-823 Human Adenokarcinom želodca Cancer Cell Line. PLoS ONE 10 (7): e0133169. doi: 10,1371 /journal.pone.0133169

Urednik: Jian-Hua Mao, Lawrence Berkeley National Laboratory, University of California, Berkeley, ZDA

Prejeto: 26. januar 2015; Sprejeto: 24. junij 2015; Objavljeno: 15. julij 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v prispevku

Financiranje:. s subvencijami iz državnega Natural Science Foundation Kitajske (Grant No. 81172094), Top Six talentov Projekt province Jiangsu (Grant št 2011ws005) in medicinsko znanost in tehnologijo podprte razvojni projekti Nanjing (Grant No. ZKX10011). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Kljub znižanju pojavnosti, ki je želodčni rak še vedno velja za enega izmed glavnih vzrokov smrti, povezanih z rakom po celem svetu. Operacija je še vedno osnova vsake kurativnega zdravljenja; Vendar, približno dve tretjini bolnikov, diagnosticiranih z rakom želodca imajo neizrezljiv lokalno napredovalega in /ali metastatsko bolezen. Stopnja preživetja 5-letno bolnikov, ki so bili diagnosticirani z napredovalim rakom želodca lokalnoregionalno in so bili kurativno resekcijo ostaja nizka zaradi velikega tveganja lokalnih ponovitev ali oddaljenih zasevkov, tudi če je bila resekcija, ki naj bi bila zdravilna. [1] perspektiva randomizirana medskupine (INT) -0116 preskušanje (556 bolnikov) in naknadnim korejski izkušnje (990 bolnikov) so pokazali zmanjšanje lokalni tarifi recidiva s pooperativno regionalni sevanjem, skupaj s kemoterapijo in višjo stopnjo preživetja v adjuvantno roko. [2] radioterapija je glavni lokalnoregionalno nadzor modalnost za neresektabilno raka želodca [3] National Comprehensive Cancer omrežja (NCCN) smernice priporočajo radioterapijo kot standardno zdravljenje za bolnike želodca z rakom z visokim tveganjem za ponovitev.; [4] Vendar obstajata dve veliki omejitve, povezane z zdravljenje raka želodca s sevanjem: (1) intrinzična ali pridobljene odpornosti na obsevanjem; (2) nespecifične strupenost do želodčne sluznice in okolici normalno tkivo. [2,5]

Za odpravo teh omejitev, ki so bile znanstvene poskusov za iskanje učinkovitega radiosensitizer iz zelišč z nižjo toksičnosti in večjo učinkovitost. 6,7 Nedavna raziskava je pokazala, da lahko veliko pridobiva iz rastlin polifenolov, vključno kurkumin, Flavopiridol, emodin, ursolna kisline in itd, se uporablja za senzibilizacijo tumorske celice na kemoterapevtiki in radioterapijo z zaviranjem na poti, ki vodijo k odpornosti zdravljenja. [, 8] Ta sredstva so prav tako ugotovili, da je zaščitni od-zdravljenje povezano toksičnosti. [5] ursolna kislina (UA), ki pentaciklično triterpen kislino, ki velja za eno izmed najbolj obetavno kemopreventivno sredstvom za rakom, se je pokazalo, da zahteva antitumorsko dejavnosti, vključno z zaviranjem tumorja začetku in promocije. [9,10] prav tako povzroča diferenciacijo tumorskih celic, ki jih regulacije izražanja diferenciacije specifičnih genov v miš F9 teratokarcinom celic. [11] Poleg tega je prišlo do dokazov, ki dokazujejo, da UA proizvaja anti-angiogenskega učinek v piščančjih chorioalantoic membrane in anti-invazivno dejavnosti HT1080 človek fibrosarkomskih celic. [12,13]

Vendar pred raziskave še dokazati, ali lahko UA okrepi učinke sevanja v maligne neoplazme . Poskus je bil zasnovan za raziskovanje učinkov ter možnega mehanizma vitro radiosenzitizacijo z UA v skladu BGC-823 celic iz človeških adenokarcinomom rakom želodca zagotoviti teoretično podporo za klinično uporabo.

Materiali in metode

celični kulturi

BGC-823 celice smo pridobili iz Shanghai Institute of Cell Biology (Shanghai, Kitajska) in shranjeni v RPMI 1640 medija z 10% tele goveji serum pri 37 ° C v vodo nasičeno atmosfero s 5% CO _2.

Cell citotoksičnosti test

citotoksičnost je bila določena z MTT testom opravili že objavljeni. [14] Za ponazoritev, celice zasadimo na 8 x 10 ^{3 celic na dobro v 96-vdolbinami in pustimo pritrditev preko noči. Nato smo celice obdelali z različnimi koncentracijami UA (0, 5, 6,25, 10, 12,5, 20, 40, 50ug /ml) za 48h v najmanj treh ponovitev vrtin. Vsako jamico smo potem dodali 20ul MTT, z mešanjem 5 mg MTT z 1 ml fiziološke raztopine pripravimo in inkubirali dodatnih 4h. Medij v vsako jamico smo zamenjali z 150ul DMSO. Absorbance je bila določena z bralnikom mikroploščnem (BIP-RAD) pri 490nm. prazne kontrolne jamice so bili uporabljeni za ničelne nastavitve absorpcijo. Stopnja inhibicije (IR%) smo izračunali s pomočjo-ozadja popravljena absorpcijo z naslednjo enačbo:.}

IC _{50 je definirana kot koncentracija je potrebna za 50% inhibicijo rasti celic}

združevanje celic in vitro ionizirajočim sevanjem

Celice smo naključno razdelili v 4 skupine: kontrolni skupini (A), UA skupino (B), terapija z obsevanjem (RT) skupino (C), in kombinirani skupina (D ). Celice BGC-823 so bili kultivirani v 6 vdolbinami, nato pa skupina B in D so bili zdravljeni z UA, medtem ko je skupina C in D obsevamo z uporabo 6-MeV linearnega pospeševalnika elektronskim snopom (ELEKTA, Švedska).

klonogene preživetje test

Radiosensitivity je bila določena z klonogene testom preživetje. Celice (500-2000 na vdolbino) smo nanesli na 6 vdolbinami in pustimo, da se veže preko noči. Nato smo celice obdelali z UA (0, 6,25 in 10ug /ml) 24 h in nato izpostavljeni večje odmerke RT (0, 2, 4, 6 in 8Gy). Po 10-14 dneh inkubacije, kolonije sestavljena iz več kot 50 celic niso opazili. Kolonije so skrbno operejo, obarvane z etanolom /kristalno vijolično barvo, in nato prešteti. Galvanski učinkovitost (PE) je bila izračunana kot (pomeni kolonijami števila /nasajenih celic) in preživeli del (SF) je bila izračunana kot [pomeni števila kolonij /(nasajenih celic × PE)], v kateri je bila PE opredeljena kot (pomeni kolonije šteje za un-obsevanih kontrole /celice semeni). D _{0 vrednosti so izračunani z multi-ciljni single-hit model [S = 1 - (1-e ^{-D /D0) N], kar predstavlja povprečno odmerek smrtonosno izpostavljenosti. povečanje preobčutljivosti razmerje (SER) je bila izračunana kot D 0 razmerje med kombinirano zdravljenje in samo RT.}}

Cell ciklusu

Vpliv celičnega cikla je bil analiziran s pomočjo propidijevega jodid /RNase buffer (BD Pharmingen, San Jose, CA, ZDA) obarvanje v skladu z navodili proizvajalca. 2,5 x 10 ^{5 celice zasadimo v 6 vdolbinami in pustimo, da se veže preko noči. Nato smo celice obdelali z UA (0 in 10ug /ml) 24 h in nato izpostavljena RT (0 in 2Gy) za 48 h. Celice smo zbrali s trypsinization, določen v 70% etanolu pri -20 ° C, sprali v PBS, resuspendirali v 1 ml PBS, ki vsebuje 1 mg /ml RNaze in 50 ug /ml propidijevim jodidom, inkubiramo v temi za 30 minut pri 37 ° C, in analizira citometrije pretoka (FACScan, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, ZDA).}

Merjenje apoptoze

Cells količinsko apoptoze celic smo ocenili z uporabo aneksin-V-FITC Apoptoza Detection Kit (BD Pharmingen, San Jose, CA, ZDA) po navodilih proizvajalca. 2,5 x 10 ^{5 celice zasadimo v 6 vdolbinami in pustimo, da se veže preko noči. Nato smo celice obdelali z UA (0 in 10ug /ml) 24 h in nato izpostavljena RT (0 in 2Gy) za 48 h. Celice smo zbrali s trypsinization in ponovno suspendirali v 500ul vezavnega pufra in 5ul za aneksin-V-fluorescein izotiocianatom (FITC), nato pa dodamo 5ul od propidijevim jodidom (PI). Analize so bile izvedene s pretočno citometrijo.}

Dokaz kisikove zvrsti (ROS) generacija

bile ugotovljene koncentracije intracelularnega ROS uporabo membranskih prepustne fluorescentnih sond 2 ', 7'-dichlorofluorescin diacetat (DCFH-dA) (Beyotime, Haimen, Jiangsu, Kitajska), v skladu z navodili proizvajalca. 1 x 10 ^{6 celice zasadimo v 6 vdolbinami in pustimo, da se veže preko noči. Nato smo celice obdelali z UA (0 in 10ug /ml) 24 h in nato izpostavljena RT (0 in 2Gy) za 48 h. Celice smo zbrali s trypsinization, resuspendirali DCFH-DA za 30 minut, izperemo z RPMI brez seruma, 1640, nato zazna s pretočno citometrijo. Povprečni fluorescenčna intenziteta (MFI) zastopa znotrajcelično raven ROS.}

Imunohistokemijsko za ocenjevanje Ki-67 izraz

Ki-67 protein izraz je ocenil avidinom-biotin kompleksnega imunohistokemijske (ZSGB-BIO Peking, Kitajska), v skladu z navodili proizvajalca. 2 x 10 ^{4 celice zasadimo v 6 vdolbinami s krovnim zdrs za vsako vdolbino, in pustimo, da se veže preko noči. Nato smo celice obdelali z UA (0 in 10ug /ml) 24 h in nato izpostavljena RT (0 in 2Gy) 24 h. Nato so pokrivni zdrsne določen v 4% paraformaldehida, inkubiramo z 0,5% Triton X-100 za 20 minut, sprani v PBS in inkubiramo s 3% H _{2O 2 za 15min. Po spiranju s PBS za trikrat, smo celice, ki so bili pritrjeni na krovnih listih inkubirali s Ki-67 monoklonskih protiteles za 60min pri 37 ° C, nato pa sprali v PBS znova. Biotin konjugiranih sekundarnih protiteles za 20min pri 20-37 ° C, speremo s PBS štirikrat, nato obarvajo z DAB barvanje Kit, speremo z vodo, nato pa jih nasprotno s hematoksilinom.}}

Statistična analiza

podatki so bili prijavljeni kot povprečje ± SD, in pomeni primerjave smo izvedli enosmerno ANOVA. P < 0.05 je bil sprejet kot statistično značilne. Statistična analiza je bila opravljena s pomočjo SPSS, v. 17.0.

Rezultati

citotoksičnih učinkov UA na 823 BGC celic

citotoksični učinek UA na 823 BGC celicah je ocenili na osnovi MTT testu. Ugotovili smo, da UA odvisnosti od odmerka povečal citotoksičnost v želodčni rak celične linije BGC-823 (slika 1). Pol maksimalnega inhibitorna koncentracija (IC _{50) vrednosti za BGC-823 je 17.5ug /ml. Rahlo citotoksičnost (< 15%) UA za BGC-823, 10ug /ml, smo uporabili za nadaljnje načrtovane poskuse, nadzor za radioenhancement zaradi neposrednega citotoksični učinek}

Učinki radiosenzitizacijo za UA v. vitro

preživetja celic krivulje izmerjene s klonogene testom preživetje je bilo prikazano na sliki 2. v primerjavi z RT le, SF _{2 RT kombinaciji z UA bistveno zmanjšal v BGC 823-celice, SER vrednosti vseh skupin je bilo 1.180-krat in 1.315-krat. Ti rezultati so pokazali, da UA okrepljen učinek sevanja BGC-823 v skladu z odmerkom odvisnosti v rahlih koncentracijah citotoksičnosti.}

distribucija Celični ciklus in indukcija apoptoze.

Da bi raziskali, ali je RT in /ali zdravljenje UA lahko povzroča motnjo celičnega cikla, analiza celic BGC-823, zdravljenih z 2Gy obsevanjem in /ali 10ug /ml UA je bila izvedena. Glede na kontrolno skupino, 10ug /ml UA sama dala skoraj nobenega vpliva na celičnega cikla. Vendar pa je združena skupina UA in obsevanja povzročil ustavitev celičnega cikla v G _{1. fazo (51,87% VS 60,28%, p = 0,13) in G 2 /M faza (3,14% VS 13,67%, p <0.01) v primerjavi s skupino obsevanja 2Gy (slika 3A in 3C). Te ugotovitve kažejo, da je zdravljenje kombinacija lahko povzroči G 1 fazo in G 2 /M faza aretacijo, ki je bil bolj dovzetni za škodljive učinke sevanja. Podobne ugotovitve iz podatkov celičnega cikla je bilo dokazano s prejšnje študije. [15]}

Kombinacija UA in obsevanjem lahko pride tudi do bolj apoptotske celične smrti, kot kaže slika 3B. Delež apoptotskih celic znatno poveča z uporabo tako UA in obsevanje v BGC 823 celic v primerjavi s samim UA ali IR zdravljenja. (78,2% VS 9,6% in 12,5%, p < 0,01, slika 3d)

UA povečala RT povzročajo ROS nastanek

na splošno velja, da je uničevanje celic po izpostavljenosti ionizirajočemu je sevanje delno posreduje ROS. [16] ROS analiza s pomočjo DCF-dA proizvaja povprečno fluorescenčno intenziteto (MFI), ki zastopnika intracelularno raven ROS vsake skupine (slika 4A in 4B). MFI UA samega skupine, RT samega skupine in skupine UA + RT povečala za 1,15-kratno, 1,53-kratno in 2,09-kratno v primerjavi s kontrolno skupino. Stopnja ROS kombiniranega skupine znatno povečal v primerjavi s samo skupino RT, ki razkrivajo, da dodajanje UA RT povzroča več nastanek ROS kot samo RT.

Imunohistokemijsko od Ki-67

Ki -67 bil znan kot jedrska antigen, ki se pogosto korelira s proliferacijo celic. Naš poskus odkriti pozitivno stopnjo Ki-67 proteina po imunohistokemično barvanjem, in rezultati so bili prikazani na sliki 5. Odstotek Ki-67 pozitivnih celic kombinirane skupine bistveno zmanjšala v primerjavi s kontrolno skupino, kakor tudi skupini za radioterapijo .

Pogovor

v raziskavi smo ugotavljali učinke in morebitno mehanizem UA kot radiosensitizer. MTT test in klonogene Test preživetja je pokazala, da je IR kombinaciji z UA boljše citotoksičnosti kot sama IR. Ta učinek so opazili pri obeh skupinah z različnimi koncentracijami sub-citotoksičnosti UA, 6.25ug /ml in 10ug /ml. Pri tem odmerku je bilo UA majhno citotoksičnost do adenokarcinom želodca raka celične linije človeških BGC823 in ni imel pomembnega citotoksičnost do normalnega želodca celične linije. [17] Ta je pokazala, da je bil UA obetaven radiosenzitizacijo in vitro
.

Osrednji raka radioterapiji čim terapevtsko učinkovitost na tumorsko tkivo ob hkratnem zmanjšanju škode normalnih tkivih. Medtem ko se lahko izoblikovan načrtovanje in nedavni fizične tehnike varno povečati dozo sevanja s tumorsko tkivo ob hkratnem zmanjšanju odmerka okolici normalno tkivo, [18] Sedanje tehnike za radioterapijo še vedno ne more izogniti poškodbi bližini normalnih tkiv. Dodatne Radioterapevtski koristi lahko najdemo s preučevanjem biološki odziv mikrookolje tumorja odkriti, kako povečati občutljivost tumor za sevanje ali zavirajo stranskih učinkov sevanja. [19]

Običajni tkiva v okolici raka želodca, kot črevesju in želodca, so občutljivi na ionizirajoče sevanje. Posledično mora ionizirajoče sevanje doza proti tumorsko tkivo omejiti. Poleg tega bodo prekrivali stranski učinki ionizirajočega sevanja povečanje radioterapijo stranske učinke, in celo prekiniti zdravljenje. Koncentracija sub-Citotoksičnost UA v kombinaciji z ionizirajočim sevanjem, vendar pa se lahko poveča citotoksičnost z ionizirajočim sevanjem, medtem ko je nizka koncentracija UA skoraj neškodljiv normalnih tkivih. Ta strategija lahko poveča terapevtski indeks v tumorskem tkivu, brez povečanja doze in radioterapije stranski učinek.

Za identifikacijo mehanizem radiosenzitizacijo za UA, smo izvedli analizo v več korakih. Najprej smo analizirali porazdelitev celičnega ciklusa. Koncentracija Sub-citotoksičnosti UA ni prinesla nobenega pomembnega učinka na celičnega cikla, medtem ko jih primerjate z ionizirajočim sevanjem samo, kombinirano zdravljenje okrepljeno G _{2 /M zastoj. Radiosensitivity celic je povezana z celično cikla in korelacija večja v skupini G 2 /M fazi in nižja v S fazi. To je lahko najpomembnejši Razlog za izboljšano radiosenzitizacijo opaženo v tej študiji. Drugič, smo analizirali znotrajcelične koncentracije ROS. Raven ROS kombiniranega skupini v primerjavi s kontrolno skupino, ki je prejemala samo skupino UA ali celo skupini ionizirajočega sevanja znatno povečala. Dodatek UA ionizirajočega sevanja povzroča več nastanek ROS. Ionizirajoče sevanje povzroča radiolize vode, ki je ustvarjen ROS, kot hidroksilnimi radikali in superoksid. Te ROS molekule igral pomembno vlogo pri ionizirajočega sevanja povzročajo celične poškodbe, kot so poškodbe oksidativni DNK, kar lahko privede do tako klonogene smrti in apoptoze. Tretjič, v tej študiji smo ugotovili, da je delež Ki-67 pozitivnih celic kombinacije skupine bistveno zmanjšala v primerjavi s kontrolno skupino ali skupino zdravljenje sevanja. Ki-67 je znan kot celičnega cikla povezanega antigena in uporaben marker proliferacije a. Ki-67 raven beljakovin je povezano z višjo jedrskega orožja in metastaze sposobnosti. [20,21]}

Skratka, ta študija je prvi poskus, da dokaže, da lahko UA sinergiji z ionizirajočim sevanjem, proti človekovim želodčnega raka celičnih linijah . Osnovni mehanizem za izboljšano učinkovitost radiosenzitizacijo lahko okrepljeno G2 /M prijetje, povečana ROS in navzdol regulirano raven Ki-67. Skupaj, kot je prikazano UA močan antiproliferation učinek in sinergistični učinek, je mogoče uporabiti kot potencialni preobčutljivost drog za uporabo radioterapije. Vendar pa je brez dvoma, da so potrebne nadaljnje raziskave, da oceni izvedljivost in prednosti uporabe tradicionalne kitajske medicine, kot radiosensitizers pred dejanskim klinično prakso. Več eksperimenti in replike, so potrebne druge vrste tumorjev in poskusov na živalih za potrditev učinkovitosti predlagane strategije.

• Plos ONE: MicroRNA-206: Učinkovito zavira Rak želodca napredovanje skozi c-Met Pathway
• Plos ONE: Klinični Pomen MLH1 metilacije in CpG Island Methylator Fenotip kot prognostičnih označevalcev pri bolnikih z želodčnim Cancer