Povzetek
V času usmerjeno zdravljenje, mutacija profiliranje raka je ključnega pomena za izdelavo terapevtske odločitve . Za karakterizacijo raka na molekularnem nivoju, je uporaba-formalinom fiksni parafinskega vgrajeni tkiva je pomembno. Testirali smo Panel v2 Ion AmpliSeq Rak Hotspot in nCounter Kopiraj številko Notranja razsvetljava testu na 89-formalin fiksni parafinskih vgrajeni želodca vzorcev z rakom, da ugotovi, ali so uporabni v arhivskih kliničnih vzorcev za osebno usmerjenih terapij. potrjena smo rezultate z Sanger sekvenciranje, v realnem času kvantitativno PCR, fluorescence in situ hibridizacija in imunohistokemijo. Pogosto odkrijejo somatske mutacije vključen TP53 Navedba. Kim S, Lee J, Hong ME, Ali IG, Kang SY, Ha SY et al. (2014) High-Prepustnost zaporedja in kopiranje Število Sprememba Detection Uporaba formalin fiksno vgrajenih tkiv v metastatskega Rak želodca. PLoS ONE 9 (11): e111693. doi: 10,1371 /journal.pone.0111693 Urednik: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japonska Prejeto: April 28, 2014; Sprejeto: 29. sep 2014; Objavljeno: 5. november 2014 Copyright: © 2014 Kim et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo Data Zaloga:. avtorji potrjujejo, da so v celoti na voljo brez omejitev vse podatke, na katerih temeljijo ugotovitve. Vsi pomembni podatki so v papirju in njene dodatne informacije datotek Financiranje:. Ta študija je bila podprta z nepovratnimi sredstvi iz Koreje Healthcare Technology R & D projekta, Ministrstvo za zdravje & Welfare zadeve, Republika Koreja (A101130) in donacijo Samsung Biomedical Research Institute (# SBRI-SP1B20112). Ta študija je bila podprta tudi s Samsung Medical Center occasional nepovratnih sredstev, 20 x 20 Project (# GFO1140111). Soavtorji Seokhwi Kim, Jeeyun Lee, Min EUI Hong, In-Gu storiti, zato Young Kang, Sang Yun Ha, Seung Tae Kim, Se Hoon Park, Won Ki Kang, Min-GEW Choi, Jun Ho Lee, Tae Sung Sohn so Jae Moon Bae, Sung Kim in Kyoung-Mee Kim zaposlen Samsung Medical Center. Soavtor Duk-Hwan Kim je zaposlen Samsung Biomedical Research Institute. Samsung Biomedical Research Institute in Samsung Medical Center nudil podporo v obliki plač avtorjem Seokhwi Kima, JL, Meh, IGD, Syk, SYH, STK, SHP, WKK, MGC, JHL, TSS, JMB, Sung Kim, KMK in DHK , vendar ni imel nobene dodatne vloge pri oblikovanju študije, zbiranje podatkov in analizo, odločitev za objavo, ali pripravo rokopisa. Posebne vloge teh avtorjev zglobni v razdelku "Avtor prispevkov" nasprotujočimi si interesi. Avtorji so naslednje interese: Ta študija je bila delno financira Samsung biomedicinskih Research Institute in Samsung Medical Center. Soavtorji Seokhwi Kim, Jeeyun Lee, Min EUI Hong, In-Gu storiti, zato Young Kang, Sang Yun Ha, Seung Tae Kim, Se Hoon Park, Won Ki Kang, Min-GEW Choi, Jun Ho Lee, Tae Sung Sohn so Jae Moon Bae, Sung Kim in Kyoung-Mee Kim zaposlen Samsung Medical Center. Soavtor Duk-Hwan Kim je zaposlen Samsung Biomedical Research Institute. Ni patenti, izdelki v razvoju ali tržijo proizvode, naj ugotovi. To ne spremeni pripadnost avtorjev vseh PLoS ONE politike o izmenjavi podatkov in materialov. Čeprav rak želodca je četrti najpogostejši rak na svetu, je druga vodilni vzrok smrti. [1] Njena pojavnost je bistveno višja v azijskih državah, vključno s Korejo, kjer je drugi najpogostejši rak. [2] V zadnjem času so odkrili več ciljno terapevtiki za raka želodca, ki zagotavljajo dodatne možnosti za zdravnike in bolnike [3] - [5] V obdobju usmerjeno terapijo, mutacije profiliranje raka povzročitelja s. je ključnega pomena za terapevtske odločitve. Poskusi, da bi profil mutacije so bile narejene z uporabo tradicionalnih Sanger zaporedja; Vendar pa to ni optimalen način v kliničnem okolju zaradi stroškov, čas in delo zahteva. Poleg tega Sanger zaporedja zahteva velike količine DNK; ocenjevanje majhne količine osebka za več genov hkrati ni možna. Uvedba nove generacije sekvenciranja (NGS) metod je rešil ta problem z multipleks, visoko pretočno zaporedja številnih vzorcev za več genov hkrati. [6] [7] Ena izmed platform NGS je Ion Torrent AmpliSeq Cancer Panel, temelji na ne-optično odkrivanje vodikovih ionov v napravi polprevodnikov, [8] in je zmožen odkriti 2,855 onkogeni mutacije v 50 pogosto mutirani geni (tabela S1). To je boljša od drugih množičnih temelji na spektroskopskih metod zaporedja, ki zagotavlja zaporedja rezultati hitreje in z nižjimi stroški. [8] To velja v-formalin fiksni parafinskih vgrajeni (FFPE) tkivnih vzorcih z majhnimi količinami DNA. Saj zagotavlja visoko občutljivost pri presejalnih znano onkogenih mutacij, [9], [10] Ion Torrent AmpliSeq Rak Panel je izbira 5 velikih onkoloških centrih v ZDA za molekularno diagnostiko v ciljno terapijo [11]. Pomnoževanje onkogenov je glavni mehanizem za genski prekomerno in prispeva k razvoju tumorjev. [12] Primeri vključujejo ojačanje HER2 Bolje prilagojeno zdravljenje raka lahko izboljša izid bolnikov. Bolnikov vzorci tumor bodo potrebni za karakterizacijo raka na molekularnem nivoju in opredelili podskupine bolezni, ki naj bi prejeli različne terapije. Uporaba FFPE tkiva je pomembna za omogočanje te študije. [16] Tu smo testirali AmpliSeq in nCounter meri CNV plošče v FFPE vzorcih raka želodca, da ugotovi, če se uporabljajo v arhivskih kliničnih vzorcev za osebno usmerjenih terapij. Vzorci tumor cell delež več kot 75%, je bilo seciramo pod mikroskopom od 4 mm neobarvano odseke v primerjavi s H & E obarvajo drsnik in genomsko DNA smo ekstrahirali z uporabo Qiagen DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Nemčija) v skladu z navodili proizvajalca iz 96 bolnikih z napredovalim rakom želodca. Po ekstrakciji, smo izmerili koncentracijo kot tudi 260/280 in 260/230 razmerje nm s spektrofotometrom (ND1000, Nanodrop Technologies, ThermoFisher Znanstveni, MA, ZDA). Vsak vzorec smo nato kvantitativno s Qubit fluorometru (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornija). Genomsko DNA z > 10 ng merjena s Qubit fluorometru smo podvrgli knjižnice pripravo in sedem vzorcev igrišča za gradnjo knjižnice in so bili izključeni iz te študije. Na koncu je bilo 89 primerov na koncu analizirani in vključeni 31 ženski in 58 moških bolnikov. Tabela 1 našteva klinične in patološke značilnosti bolnikov v tej študiji. Ponavljanje ali metastaze razvil pri 11 bolnikih z mediano spremljevalnega obdobje 76 mesecev (razpon 5,5-149,3). Študija je odobril Institutional Review Board (IRB) na Samsung Medical Center. Vse klinične preiskave je bila izvedena v skladu z načeli, izraženimi v Helsinški deklaraciji. Privoljenjem bila napisana odvzame IRB zaradi retrospektivne analize in anonimnih podatkov. Vzorci so bili zbrani v okviru rutinskega medicinskega postopka in zberemo avtorji za te študije. Vzorci umrlih bolnikov ali živih bolnikov, so bili vsi de-prepoznavanje, vključno z odstranitvijo koli in vse demografske podatke, je treba pred analizo in obvestila obliki soglasja je odvzame IRB. smo uporabili Ion AmpliSeq Cancer Panel v2 (Ion Torrent) za odkrivanje pogosto somatskih mutacij, ki so bile izbrane na podlagi pregleda literature. Preučuje 2855 mutacij v 50 pogosto mutiranih onkogenov in zaviralnih genov (tabela S1). Prvič, 10 ng DNA iz vsake od 89 FFPE tumorskih vzorcev doživel eno-cev, multipleks PCR pomnoževanje z uporabo Ion AmpliSeqCancer Primer bazen in reagente Ion AmpliSeqKit (Life Technologies). Zdravljenje dobljenih pomnožkov z FUPA Reagent delno prebavi primerje in fosforilira v amplikonov. Fosforilirano amplikoni so povezana na Ion adapterji in očiščen. Za barcoded pripravo knjižnice, smo nadomestil barcoded adapterjev iz ionske Xpress Barcode adapterji 1-96 Kit za nepremoženjsko barcoded adapter mešanico dobavljena v kompletu Ion AmpliSeq knjižnice. Ligirani DNA doživel nick-prevajanje in ojačanja za dokončanje povezave med adaptacijo pomnožkov in ustvariti dovolj materiala za pripravo nadaljnjega predloge. Dva kroga Agencourt AMPure XP Reagent vezavo na 0,6 in 1,2 volumskih razmerjih noge-do-vzorca odstrani vhodni DNK in neregistrirane začetnih oligonukleotidov iz pomnožkov. Končni knjižnice molekule so 125~300 bp velikosti. Nato smo prenesli knjižnice do Ion OneTouch sistem za avtomatizirano pripravo predlogo. Zaporedja je bila izvedena na Ion PGM sekvencer v skladu z navodili proizvajalca. Uporabili smo IonTorrent Programska oprema za avtomatizirano analizo podatkov. Za merjenje občutljivost in specifičnost raka plošče Ion AmpliSeq, so bili uporabljeni cele rezultati exome zaporedja od 4 želodca vzorcih raka z znanim statusom mutacije [17]. nCounter Kopiraj Število Sprememba CodeSets Za odkrivanje CNV, nCounter Kopiraj Število Gibljivo CodeSets so bili uporabljeni pri 300 ng očiščenega genomske DNA, povzete iz 2-3 oddelkov 4-mikrometrov debelih FFPE predstavnik tumorskih blokov z uporabo QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Nemčija). DNA je razdrobljeno po AluI prebavo in denaturira pri 95 ° C. Razdrobljeni DNA smo hibridizirali z codeset 86 genov v nCounter raka KN Vsebnost Kit (Nanostring Technologies) za 18 ur pri 65 ° C in obdelana v skladu z navodili proizvajalca. NCounter Digital Analyzer prešteti in tabeli signale sporočilne sonde in povprečno število Štetje > 3 so bili imenovani in potrjeni z imunohistokemijo, FISH in PCR v realnem času IHC za HER2, EGFR (HER1) in CCNE1. za potrditev rezultatov CNV, pridobljenih iz nCounter, smo izvedli IHC za HER2 v vseh primerih, in EGFR in CCNE1 v izbranih primerih. Po deparaffinization in rehidracijo, so imunoreaktivnosti 4 mm poglavja o-silana obložene tobogani za HER2. HercepTest (Dako, Glostrup, Danska) je bila uporabljena v skladu z navodili proizvajalca, kot je opisano zgoraj. [18] Za EGFR smo uporabili anti-NCL-L-EGFR-384 miške monoklonsko primarno protitelo (1:100 redčenje Novocastra /Vision Biosystems, Newcastle, UK) in CCNE1 smo uporabili anti-CCNE1 /ciklin E1 protitelo (klon HE12; 1:200 redčenje, Thermo Fisher Scientific, MA). Sistem avtomatsko zložljivo obdelavo Ventana Benchmark XT je bila uporabljena v skladu s protokolom proizvajalca. Strokovnjak patolog (KMK) ocenili rezultate FISH za HER2 FISH je bila narejena z dvojno barve sonde DNA-specifična od PathVision ™ (Abbott /Vysis:. LSI HER2 SpectrumOrange ™ in CEP 17 SpectrumGreen ™), kot je predhodno opisano v primerih z nezanesljivo čezmernega izražanja HER2. [19] smo prešteti hibridizacije signale v 20 jeder na vzorec pod fluorescenčnim mikroskopom (Zeiss Axioskop) z uporabo filtrov sklopov, ki jih Vysis (DAPI /Spectrum Orange dvojno pasovni, DAPI /Spectrum Green dvojno pasovni) priporoča. Vse jedra prekrivajoči so bile izključene, pa so ocenili le jedra z izrazito jedrski meje. HER2 smo uporabili DNA, pridobljene iz FFPE želodčnega karcinoma tumorskih tkivih. Reakcijska mešanica je vsebovala 2 ul genomske DNA predlogo, 10 ul TaqMan univerzalna PCR glavni mešanice (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA) in 0,2 um vsakega primer. Za natančno odkrivanje sprememb KN, smo analizirali tri različne regije v Kras smo izmerili število kopij dobiček uporabi naslednji profil: 2 min pri 50 ° C, denaturacijo pri 95 ° C za 10 min, čemur sledi 40 ciklov 95 ° C za 15 sekund in 60 ° C 1 min. Ugotovili smo relativno kvantifikacijo z 7900 HT hitro v realnem času PCR sistem v štirih izvodih. RNaseP Test komplet (Applied Biosystems) smo uporabili kot kontrolo. Po pomnoževanju smo uvozili rezultate preizkusa, ki vsebujejo vrednosti praga cikla za številu kopij in referenčno testom v CopyCaller programske opreme (Applied Biosystems) za post-PCR analizo podatkov, kot je opisano zgoraj. [22] smo dodeli status dobiček KN in število Kras izključena smo vse sinonim spremembe po tem, ko je bil avtomatski algoritem-mutacija kliče uporablja za odkrivanje domnevnih mutacije. Ponavljajoče se klice v več kot 10 od 89 vzorcev so bili šteti za lažno pozitivne in so bili izključeni. Uporabili smo časovnem prelomu vrednosti več kot 6% varianta frekvenco in več kot X100 kritja za odkrivanje prave mutacij spremembe v skladu s prejšnjimi študijami in lastnih izkušenj. [9], [10] smo izločil single-nukleotidnih polimorfizmov po ročni pregled vsakega polimorfizma v katalogu somatskih mutacij v raka (COSMIC, http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic~~HEAD=pobj) ( slika 1). Za znanih genov mutiral v želodčnih karcinomov ( TP53 Rezultati Rezultati Ion AmpliSeq rak plošče koncentracije DNK, njihova koncentracija krat, povprečna pokritost vzorcev, skupno število baz, > Q20 baze, se glasi, pomeni prebral dolžino, preslikan glasi, hitrost na cilju (%), povprečna globina in enotnosti rezultatov so opisane v tabeli S2. V celoti smo pridobili 8178 variantne klice od 89 vzorcev, med njimi so bili 3554 klicev, ki niso sinonim spremembe. Po filtriranju ponavljajoče se klice, < 6% varianta-alel frekvenco, < 100X zajetja in tiste v intron regiji, je bilo izbranih 65 variantne klice. Poleg tega smo pregledali samodejnih klicev v znanih mutacij, kot so BRAF V štirih želodca vzorcih raka z znanimi mutacij frekvenc celotno exome sekvenciranja določi in ki jih potrdijo Sanger sekvenciranje smo identificirali somatskih mutacij v TP53 Amplification s nCounter in potrjevanje po IHC, FISH in PCR v realnem času ojačitve HER2 V PCR v realnem času za KRAS Met Pogovor z uporabo Ion AmpliSeq v2 smo ugotovili, da je 39 od 89 naprednih želodca vzorci adenokarcinomom vsebuje somatskih mutacij, ki dokazuje, da je ta platforma lahko uporablja v arhivskih vzorcev FFPE tkiva. TP53 mutacij frekvenc v COSMIC podatkovni zbirki razkrivajo velike podobnosti do podatkov, ki jih pridobljenih iz te študije:. TP53 , ki temelji na Semiconductor zaporedja ima temeljne razlike v zaznavanju in signalov v primerjavi z masno spektrometrijo ki temeljijo na zaporedja. Namesto z uporabo optičnih metod za odkrivanje sprememb nukleotidov, ki temelji na polprevodniški tehnika zazna spremembe pH po izpustitvi protonov (H +), ko nukleotidov vključiti v vse večje verige DNA. [8] Zato je pomembno zmanjšanje stroškov in časa, potrebnega za obdelavo podatkov, v primerjavi z drugimi platformami NGS. Zagotavljanje hitre in točne informacije o mutacijah po nizki ceni, je ključnega pomena za bolnike z zelo agresivne oblike raka, vključno z rakom želodca. V tej študiji smo ročno pregledali samodejnih klicev v znanih mutacij po uporabi časovnem prelomu vrednosti frekvence in pokritost, nato dodal dva klica s pokritostjo nizko varianto. Čeprav so njihove vrednosti pokritost ni dosegel naših začetnih meril, njihovo pogostost presegla naša prva nastavitev (6%) in kakovost podatkov je bilo dobro. To poudarja pomen ročnega pregledovanja po avtomatizirano pregleda. Nedavno objavljeni rezultati z uporabo AmpliSeq kot platforma za analiziranje poudariti tudi sredstva za pregledovanje podatkov z ročnim pregledom [9], [10]. Prilagojeno usmerjena terapija za napredne raka predvsem temelji na konceptu "onkogena zasvojenosti," v ki več genetske nepravilnosti so odvisni od enega ali nekaj genov za vzdrževanje tumorskih celic in preživetje. [28] Odprta, mednarodna, faza 3, randomizirana kontrolirana toga (trastuzumab za želodca raka) poskus je pokazala, da je trastuzumab v kombinaciji s kemoterapijo nov standard možnost za bolnike s HER2-pozitivnega napredno želodca ali gastroezofagealne raka križišča. [29] predklinične raziskave so pokazali, da je podskupina želodca raka z EGFR Če povzamemo, smo uspešno izvedli, ki temelji na polprevodniški zaporedja in nCounter CNV analiz vzorcev FFPE tkivo od 89 želodca adenokarcinomov. Visoko prepustnost zaporedja in izstopanje pregled v arhivskih kliničnih vzorcih omogoča hitrejše, bolj natančno in stroškovno učinkovito odkrivanje srborit mutacij in CNV v genih. V dobi osebno genomske medicine, načrtujemo za uporabo teh orodij za presejanje bolnikov želodca z rakom, ki so upravičeni do ciljno usmerjenih terapij.
(28,17%), APC
(10,1%), PIK3CA
(5,6%), KRAS
(4,5 %), SMO
(3,4%), STK11
(3,4%), CDKN2A
(3,4%) in SMAD4
(3.4%) . Ojačitve HER2
, CCNE1
, MYC
, KRAS
in so EGFR
geni v 8 (8,9%) opazili , 4 (4,5%), 2 (2,2%), 1 (1,1%) in 1 (1,1%) primerih, v tem zaporedju. V primerih z ojačanja, fluorescenčna in situ hibridizacija za HER2
preverila pomnožitev gena in imunohistokemija za HER2, EGFR in CCNE1 preverila čezmerno proteinov v tumorskih celicah. Na koncu smo uspešno opravili, ki temelji na polprevodniško zaporedje in spreminjanje nCounter kopija število analiz, formalin fiksni parafinskih vgrajeni vzorcih raka želodca. Visoko prepustnost pregled v arhivskih kliničnih vzorcih omogoča hitrejše, bolj natančno in stroškovno učinkovito odkrivanje srborit mutacij ali pomnoževanje genov
Uvod
, MET
, FGFR2
in Kras
geni v želodcu raka. [13] [14] odkrivanje sprememb števila kopij (CNVs) v kliničnih vzorcih, fluorescenčna in situ hibridizacija (FISH) in /ali imunohistokemija (IHK) se pogosto uporablja. Vendar pa visoki stroški in majhne velikosti vzorcev za biopsijo materialov omejiti uporabo teh metod, in še vedno obstaja potreba po nadaljnjem visoko pretočne tehnologije z enostavno dostopnostjo, visoko občutljivostjo in z nizkimi stroški. nCounter CNV CodeSets (Nanostring tehnologije, znanosti, Seattle, WA) zagotavlja vrhunsko natančnost in ponovljivost za študij vseh velikosti in daje boljše, hitrejše rezultate z bistveno manj napora kot v realnem času kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) ali CNV nizi [ ,,,0],15].
Materiali in metode
Ion AmpliSeq rak plošča v2
gen šteje pomnožili ko je razmerje FISH signal je HER2 /CEP17
večja ali enaka 2,0 [20].
Real-time PCR za KRAS in MET ojačanje
gena: regijo znotraj intron 1 (TaqMan število kopij Vsebnost Hs06943812_cn), regijo znotraj intronu 2 (Hs002534878_cn) in regijo v eksonu 6 (Hs02739788_cn). . Za Met
gen, smo uporabili primerje kot je opisano prej [21]
kopij, ki temelji na soglasju rezultatov v najmanj dveh od treh sond.
Analizne metode
, APC
, PIK3CA
, STK11
, CDKN2A
, KRAS
, HRAS
, BRAF
in CTNNB1
), je bil opravljen priročnik pregled avtomatičnih klicnih rezultatov ujeti škodljive mutacije z nekoliko nižjim varianta frekvenco.
, KRAS
in PIK3CA
in bi lahko prihranili dva varianta klice, ki so bili izločeni med filtriranje procesi. Trideset devet od 89 vzorcev (43,8%) gojila vsaj eno mutacijo (slika 1). Dva primera sta pokazala, 22 in 5 mutacije oz. V zadnjem primeru gojila MLH1
somatsko mutacijo [missense mutacij v eksonu 20: c.1147A > G (p.M383 V)] in MLH1
promotor hypermethylation z MLH1 izgube beljakovin z imunohistokemijo, z uporabo prej opisane metode, [23] kaže hypermutated tumor. Kljub temu, da najdemo v prvem primeru opravili varianta pogostosti in pokritost mutacije cut off, te mutacije niso potrdile Sanger sekvenciranja, kar kaže na lažno pozitivno v tem primeru zaradi slabe kakovosti DNK. Torej je v tem primeru izključena iz končne analize rezultatov. Pogosto odkrijejo somatske mutacije vključen TP53
(24 primerov, 27,0%), APC
(9 primerov, 10,1%), PIK3CA
(5 primerov, 5,6%), %), Kras
(3 primeri, 3,4%), SMO
(4 primeri, 4,5%), STK11
(3 primeri, 3,4%), CDKN2A
(3 primeri, 3,4%), in SMAD4
(3 primeri, 3,4%), kot je prikazano v tabeli 2. Tabela 2 povzame tudi spremembe aminokislin v pogosto mutirani geni. Identificirali smo 19 bolnikov (21,3%) z dvema ali več edinstvene in sočasno somatskih mutacij.
, erbB4
in CTNNB1
brez lažnih pozitivnih klicev v drugih genov (tabela S3).
, CCNE1
, myc
, KRAS
in EGFR
geni so v 8 (8,9%), 4 (4,5%), 2 (2,2%), 1 (1,1%) in 1 (1,1%) primerih, v tem zaporedju (tabela 3) opazili. Nismo upoštevali ojačanje MET
, FGFR2
, CDK4
in CDK6 v katerega koli od primerov. V primerih z ojačanjem, IHK za HER2, EGFR in CCNE1 pokazala prekomerno izražanje proteinov v tumorskih celic (slika 2A, B in C). V enem primeru s HER2 2+ ga HercepTest, FISH pokazala heterogeno ojačanje HER2
genov (slika 2D).
, v enem primeru z pokazala ojačanje povečano število kopij (36, 37 in 49); v primerih, ki so bili negativni na Kras
ojačanje, ni bilo povečanje števila kopij (0.9 do 2.4, pomeni 1.4).
gen, smo ugotovili, ne pozitiven primer zaradi svoje redkosti [21]. Zato smo uporabili dodatnih deset (pet vsak dopolnjena in ne dopolnjena) vzorcev z rakom želodca in MET PODJETJA
pomnožili želodčni rak celičnih linij (MKN45 in SNU5) z znanimi števila kopij in mRNA zneskov. CNVs s nCounter zazna povezana tudi s številom kopij s PCR v realnem času (tabela S4) in mRNA ravni Met
genov odkritih (test korelacije Pearson; r = 0,874, p = 0,001). (Slika S2)
je najbolj pogosto najdemo mutacije, ki mu sledi APC
, PIK3CA
in KRAS
. Poleg tega je naš običaj CNV plošča uspešno zaznali povečanje KN HER2
, CCNE1
, myc
, EGFR
in KRAS
geni, ki smo jih potrdili z imunohistokemijo in PCR v realnem času
(32%), PIK3CA
(10%), KRAS
(6%), APC
(6%), CTNNB1
(5%), CDKN2A
(5%), FBXW7
(5%), SMO
(4%), erbB2
(2%) in STK11
(2%). Nedavne študije cel exome zaporedja na adenokarcinomom želodca so pokazale nekoliko višje frekvence TP53
(36% in 73%) in PIK3CA
(14% in 20%), mutacije v primerjavi z našimi rezultati. [24] [25] Čeprav so bili naši mutacijo frekvence nižje v primerjavi z exome rezultate za razporejanje, se je znatno povečala, če temelji spektrometrijo-OncoMap v4 primerjavi z našimi prejšnjimi podatki o množični. [26] Tako AmpliSeq in OncoMap odkrivanje mutacij v srborit regijah, ki kažejo ugotovitve manj pogoste mutacije v nekaterih onkogenov in zaviralnih genov. Slika S1 primerja AmpliSeq v2 in OncoMap v4 v zaznavnih mutacijskih profilov. Prejšnji testi OncoMap v 237 želodčnega adenokarcinoma pokazala, da je PIK3CA
mutacije so bili pogosti v naprednih fazah bolezni (5,1% v fazi IV; 6,4% v fazi II /III; 2,4% v fazi IB). [26] V tej študiji smo opazili tri PIK3CA
mutacije pri bolnikih s stadijem III in dva v bolezni faza II, ki podpirajo njihovo biološko vlogo pri napredovanju tumorja. Opazili smo tudi, HER2
( erbB2
) c.2524G > A (V842I) mutacija v primeru raka želodca. V predkliničnih študijah so celične linije zatočišča na V842I mutacijo odporna trastuzumab, a so bili občutljivi za nepopravljive HER2 inhibitor, neratinib [27].
ali MET receptorja tirozin terapijo Met
ojačitev in prekomerno odzivata na Cetuksimaba ali zaviralec kinaze. [30] Poleg tega, ojačitve posrednika celičnega cikla CCNE1
kažejo potencial za terapevtsko inhibicijo ciklin-odvisne kinaze v želodcu raka. [31] Pregled ojačane gene za usmerjeno terapijo z visoko pretočno tehnologijo je zelo pomembno. Tradicionalne metode kot so ribe in diod primerjalne genomske hibridizacije trpijo zaradi nizke ločljivosti genomskih regij, visokih stroškov in so labor- in zamudno. [32] V tej prvi študiji nCounter CNV analize smo ugotovili, da je ta tehnologija uporablja v kliničnih vzorcih FFPE in mi potrdil rezultate z imunohistokemijo, FISH in PCR v realnem času. Čeprav ni potrdil vseh genov, ki se uporabljajo v primerji po meri, so bili rezultati validacije v več izbranih genov izjemen.
Podpora Informacije
Slika S1.
Primerjava pokritosti Ion AmpliSeq v2 raka plošči primerjavi Oncomap v4
doi:. 10,1371 /journal.pone.0111693.s001
(IOD)
Slika S2.
Parcela korelacije med Met
CNVs po ravneh nCounter in mRNA Met
gen, ki v realnem času PCR
doi zazna. 10,1371 /journal.pone.0111693.s002
(TIF)
Tabela S1.
Gene Seznam za Ion Torrent AmpliSeq Cancer Panel
doi:. 10,1371 /journal.pone.0111693.s003
(XLS)
tabeli S2.
Koncentracije DNA, njihovo koncentracijo krat, povprečna pokritost vzorcev, skupno število baz, > Q20 baz, se glasi, pomeni prebral dolžino, preslikan bere, na cilju stopnja (%), povprečna globina in enotnosti.
doi: 10,1371 /journal.pone.0111693.s004
(XLS)
Tabela S3.
somatskih mutacij v TP53
, erbB4
in CTNNB1
doi:. 10,1371 /journal.pone.0111693.s005
(XLS)
Tabela S4.
CNVs s nCounter zazna povezana tudi s številom kopij s PCR v realnem času odkritih
doi:. 10,1371 /journal.pone.0111693.s006
(XLSX)
Vrsta bakterij zgornjih dihalnih poti lahko vpliva na resnost astme
Odpornost proti antibiotikom se podvoji v samo dveh desetletjih
Mikrobiom bi lahko pomagal pri prepoznavanju tveganja pred rakom pri ženskah s HPV
DeNovix razglasi zmagovalca Platinum DS11 FX+ spektrofotometra / fluorometra
Raziskovalci uporabljajo fazno terapijo za uspešno zdravljenje alkoholne bolezni jeter
Bakteriofagi lahko zdravijo E. coli, ne da bi poškodovali črevesje,
Strategija pripravljenosti otroškega zdravstva na drugi val pandemije COVID-19
Čeprav je imela pandemija COVID-19 doslej relativno majhen vpliv na pediatrično populacijo, boji se, da bo drugi val, ki že poteka v mnogih delih sveta, lahko v zimskem času darovati mladim in starim.
Raziskave kažejo, da okužbe s črevesnimi paraziti zmanjšujejo resnost COVID-19
Vsak dan se učimo več o bolezni COVID-19. Odrasli katere koli starosti z določenimi osnovnimi zdravstvenimi stanji imajo večje tveganje za hudo bolezen zaradi virusa, ki povzroča COVID-19. COVID-19,
Otroci so imunsko pripravljeni na SARS-CoV-2
V zadnjih 20 letih se je pojavilo najmanj 30 novih bolezni, ki zdaj skupaj ogrožajo zdravje več sto milijonov ljudi. Za mnoge od teh bolezni ni zdravljenja, zdravilo, ali cepivo. Medtem ko je večina t