Stomach Health > elodec Zdravje >  > Gastric Cancer > želodčni rak

Plos ONE: MicroRNA 135a zavira limfnih vozlov Metastasis z Downovim-uredbo ROCK1 v zgodnjih želodca Cancer

Povzetek

MicroRNAs (miRNAs) igrajo ključno vlogo pri želodca napredovanje raka in metastaz. Ta študija je raziskovala vlogo miRNA-135a v začetku raka želodca (EGC), vključno bezgavkah (LN) metastaz. Proučili smo korelacijo med miRNA-135a izražanja in klinične izide pri 59 bolnikih, ki so bili operirani za EGC. S pomočjo želodčne rak celičnih linij, smo izvedli funkcionalno in analize ciljni gen. miRNA-135a izraz je navzdol urejena v 33,9% bolnikov. Ti bolniki so pokazale bistveno bolj napredno stopnjo (TNM stage≥IB, 35,0% proti 12,8%, p = 0,045) in višjo stopnjo LN metastaz (30,0% v primerjavi s 5,1%, p = 0,014), kot tisti z up-regulacijo miRNA-135a izraz. V multivariatne analize, se je znižal regulacijo miRNA-135a neodvisen dejavnik tveganja za LN metastaz (prilagojeno razmerje obetov, 8,04; 95% interval zaupanja, 1,08-59,81; p = 0,042). Funkcionalne analize z uporabo želodčne celičnih linij raka je pokazala, da miRNA-135a zatreti preživetje celic, epitelne-mezenhimskih prehod, celično invazijo, in migracije. ROCK1 bil tarča miRNA-135a in njen izraz je obratno povezana s položajem miRNA-135a. ROCK1 izraz je bila pri bolnikih, EGC bistveno povečala z LN metastaz, kot pri tistih brez LN metastaz. Naši rezultati potrjujejo tumor-omejevalno vlogo miRNA-135a, in dokazati svojo vlogo v LN metastaz v EGC. miRNA-135a in njen ciljni gen ROCK1
lahko nove terapevtske in prognostične cilji za EGC

Navedba. Shin JY, Kim YI, Cho SJ, Lee MK, Kook MC, Lee JH, et al. (2014) MicroRNA 135a zavira limfnih vozlov Metastasis z Downovim-uredbo ROCK1 v zgodnjem Rak želodca. PLoS ONE 9 (1): e85205. doi: 10,1371 /journal.pone.0085205

Urednik: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japonska

Prejeto: 28. oktober 2013; Sprejeto: 23. november 2013; Objavljeno: 21. januar 2014

Copyright: © 2014 Shin et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta študija je financirala donacijo 1110532-3 iz National Cancer Center, Koreja. Blagajnami imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

Konkurenca interesov. HA je PLoS ONE uredništvo član in to ne spremeni pripadnost avtorjev za vse Plos ONE politike o izmenjavi podatkov in materialov.

Uvod

rak želodca še vedno drugi najpogostejši vzrok smrtnosti zaradi raka na svetu, kljub temu upada pojavnosti in umrljivosti v razvitih državah [1 ].

na območjih, vključno Koreji in na Japonskem, kjer je presejanje za raka želodca pogosto opravlja, zgodnje odkrivanje, je pogosto mogoče. Ker lahko povečano stopnjo zgodnje odkrivanje raka želodca vodili k boljšemu prognozo, so deleži v izboljšanje kakovosti življenja bolnikov in uporabo minimalno invazivne terapije povečala. Pri bolnikih z rakom želodca, bezgavka (LN) metastaze je eden od najpomembnejših prognostičnih dejavnikov, in celotna pojavnost LN metastaz v začetku raka želodca (EGC) znaša od 5 do 20% [2] - [4].

želodca z LN seciranje se šteje kot standardno zdravljenje za rakom želodca; Vendar pa 80 do 95% bolnikov z EGC ne zahtevajo LN bezgavk, če je rak želodca popolnoma izrezali manj invazivnih zdravljenja kot endoskopski resekciji [5] - [7] ali minimalno invazivne kirurgije ( npr
, enostavno klin resekcijo ali sentinel LN navigacija kirurgija) [8] - [10]. Čeprav so bile izvedene študije bioloških prognostičnih in predvidevanjem označevalcev za LN metastaze v EGC, ne obstajajo napovedovanje orodje za vozlišča metastazami EGC pravzaprav.

Številne študije so poročali, da je globina invazije, velikost tumorja, in limfatičnega invazija so povezana z LN metastaz v EGC [4], [11]. Vendar je večina teh dejavnikov so bili določeni po končni patološkem pregledu odstranjenimi tkiv, ki ni uporabna pri določanju strategije zdravljenja.

MicroRNAs (miRNAs) so majhne non-proteinski kodiranje RNA. Študije so pokazale, da spremembe v izražanju miRNAs prispeva k patogenezi raka, vključno s tistimi iz gastrointestinalnega izvora [12] - [15].

miRNAs so tudi dokazano, da so koristne pri razlikovanju rakavih in normalnih tkiv [ ,,,0],16], [17]. Poleg tega so miRNAs izražene različno v vsaki fazi želodca karcinogeneze raka [18]. miRNA-27 [19] in-ZEB1 urejeno miRNA-200 družina [20], so pokazale, da so povezani s stopnjo epitela-mezenhimskih prehoda (EMT) v raka želodca. Zato se lahko miRNAs povezan s procesom LN metastaze v EGC. Med miRNAs, je miRNA-135a izkazalo, da je tumor supresivno miRNA in njen izraz je navzdol urejeno v več vrst raka, vključno z rakom ledvičnih celic [21] in limfomi [22]. Po drugi strani, prekomerno ekspresijo ali obnovo miRNA-135a spodbuja apoptozo in zavira proliferacijo tumorskih celic prek svojih ciljnih genov c-myc [22] [21] in JAK2 oz. V vitro
študiji miRNA-135a zatreti migracijskih in posegajo v delovanje želodca rakavih celic [23]. Vendar pa je tumor omejevalno vlogo miRNA-135a pri raku želodca ni jasno.

Cilj te raziskave je bil ugotoviti povezavo med miRNA-135a izražanja in klinične izide pri bolnikih EGC vključno LN metastaz.

materiali in metode

vzorcev človeškega tkiva in kliničnih podatkov

Petdeset devet odraslih bolnikov z diagnozo EGC na National Cancer Center, v Koreji, od januarja 2011 do aprila 2013 je bilo za naprej vključeni v ta študija. Ti bolniki so bili zdravljeni z odprto ali laparoskopija pomaga želodca z D1 + ali več LN seciranje. Obseg LN seciranje sledila priporočila japonski Rak želodca združenja [24]. Oder po operaciji je bila ocenjena v skladu s 7 th izdaji skupnega odbora Ameriškega za raka TNM sistem počivališču [25]. Človeška tkiva vključno s tako raka na želodcu in pokrite normalno tkiva iz vsakega bolnika so takoj zamrznili v tekočem dušiku in shranili pri -80 ° C. Iz pregleda medicinske kart, clinicopathologic značilnostih, vključno starost, spol, Helicobacter pylori
stanje, značilnosti tumorja, stopnja in status LN metastaz so bili pridobljeni in analizirani. Obveščeni pisno soglasje je bilo pridobljeno iz vseh bolnikih in študija je odobril Institutional Review Board je Državnega Cancer Center, Koreja (NCCNCS-11-445).

celične kulture in transfekciji

humani normalni želodca celični liniji epitelnih HFE145 [26], [27] je bilo darilo od dr Hassan Ashktorab in Duane T. Smoot (Howard University, Washington, ZDA) in komercialno dostopnih želodca rakave celične linije AGS, YCC2, MKN28, KATOIII, SNU1 so SNU5, SNU16, SNU216, SNU601, SNU638, SNU668 in SNU719 pridobljen iz Koreje Cell Line banke (KCLB, Seoul, Koreja). Vse celične linije smo vzdrževali v RPMI 1640 medij, ki vsebuje 10% fetalnega govejega seruma (FBS) in 1% antibiotiki (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA). Med želodčnega raka celičnih linijah, so bili izbrani MKN28 in SNU668 celične linije, saj le redko izrazijo MIRNA-135A in YCC in KATOIII celične linije smo izbrali zato, ker imajo bistveno izhodiščno izražanja miRNA-135a (slika 1A). Transfekcije z miRNA-135A posnema (mirVana ™ miRNA posnema, Ambion, Austin, TX, ZDA), z miRNA-135a inhibitor (zaviralec mirVana ™ miRNA, Ambion, Austin, TX, ZDA), in ROCK1 siRNA (5'-UGAUGCAAAGAUUGUACUC- 3 '; UGBioneer, Seoul, Korea) v SNU668, YCC2, MKN28 in celične linije KATOIII smo izvedli s pomočjo Lipofectamine RNAiMAX in Lipofectamine 2000 reagentov (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. MKN28, SNU668, YCC2 in KATOIII celične linije smo zbrali dva dni po transfekciji in so bile izvedene različne analize.

ekstrakcijo RNA in miRNAs količinsko

Total RNA smo izolirali iz 13 celičnih linij in 59 bolnikov z želodčnim rakom tkiva, oziroma, z uporabo TRIzola (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) v skladu s protokolom proizvajalca. Uporabili smo TaqMan univerzalna PCR master mix reagenti kit (Applied Biosystems, Tokio, Japonska). Pomnoževanje in detekcijo smo izvedli z uporabo sistema za 7900HT Sequence Detection (Applied Biosystems, Tokio, Japonska) z 40 cikli denaturacijo pri 95 ° C (15 sekund) in žarilne /podaljšanju pri 60 ° C (60 sekund). To je sledil z reverzno transkripcijo pri 50 ° C za 30 minut in denaturacija pri 95 ° C za 10 minut. Da kvantitativno zrele miRNAs, so bili uporabljeni TaqMan MicroRNA testih kompleti (Applied Biosystems, Tokio, Japonska) za odkrivanje miRNA-135a in nadzor miRNA (RNU6B).

Western blot analiza

Protein je pridobljeni iz 13 celičnih linij in 59 vzorcev tkiv bolnikov EGC "s pomočjo Ripa pufra (Biosesang, Seoul, Korea), ki vključuje koktejl zaviralcem proteaze (Sigma, St. Louis, MO, ZDA) po protokolu proizvajalca. Nato je bil Western blot izvedemo z uporabo anti-ROCK1 in anti-β-aktina (Santa Cruz, biotehnologija, Santa Cruz, Kalifornija, ZDA) protiteles. Signali so bile ugotovljene s predsednikom komplet ECL (GE zdravstveno varstvo, Piscataway, NJ, ZDA) po navodilih proizvajalca.

teste proliferacije celic

proliferacijo celic smo merili z uporabo MTT testom. Celice smo nanesli v kulturi ploščah s 96 vdolbinami (3 x 10 3 celic na jamico) in transfektirali z miRNK-135a posnema po dveh dneh inkubacije. Nato 200 xl MTT (0,5 mg /ml, Sigma, St. Louis, MO, ZDA) smo dodali v vsako vdolbino. Po štirih urah dodatnega inkubaciji smo zavrgli MTT rešitve, 200 ul DMSO (Amresco, Solonu, OH, ZDA) smo dodali v vsako vdolbino in plošča je rahlo stresamo. Absorbanco smo izmerili na ELISA čitalniku (Moecular Devices, Sunnyvale CA, ZDA) na testni valovni dolžini 570 nm.

Cell ciklusu

Celice smo nanesli v 60π kulture plošče in transfekciji s miRNA -135a posnema ali A miRNA posnema negativno kontrolo (posnema-NC). Te celice požanjemo s trypsinization in fiksna v 70% etanolu najmanj dve uri pri -20 ° C. Celične pelete izperemo s hladno fosfatnim pufrom in inkubiramo 30 minut pri sobni temperaturi v PI /RNazo pufra za barvanje (BD Biosciences, San Diego, CA, ZDA). Po barvanju so vzorci analizirani z FACScan pretočnim citometrom (BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA) in 10.000 dogodki so bili zbrani na vzorcu. Podatki iz citometrije toka smo analizirali s pomočjo Cell Quest programske opreme (Becton Dickinson, San Jose, CA, ZDA).

migracije Trans-filter in invazijo testi

Celice so transfekciji s miRNA-135a posnema zaviralci miRNA-135a, ROCK1 siRNA in ROCK1 siRNA negativna kontrola (scRNA) za en dan in nato prenesli v zgornjo komoro transwell plošče, prevlečene z 0,5 mg /ml tipa kolagenom I (BD Bioscience, Bedford, MA, USA) in 1:15 razredčitev Matrigel (BD Bioscience, Bedford, MA, ZDA). RPMI 1640 z 10% FBS, 1% antibiotikov (Gibco BRL, Grand Island, NY, ZDA) dodamo k spodnji komori in ploščo bila inkubacija 20 ur. Preseljevanje in preplavljajo celice količinsko, z uporabo Hematoxylin in eozinom madeže.

plazmidov konstrukcije luciferazni reporter

3 'UTR od ROCK1 vsebuje vezavna mesta za miRNA-135a smo pomnožili z uporabo gDNA iz SNU668 divji tip celice kot predlogo. V korelirani mutant konstrukti so ustvarili mutira seme regije Mirne-135 vezavnih mest. Tako divjega tipa in mutant 3 'UTR smo klonirali v smeri toka gena luciferaze v kontrolni pGL3 vektorja. Konstrukti so bili preverjeni sekvenciranje.

luciferazni test

luciferazne teste smo izvedli v SNU668 in YCC2 celic. SNU668 in YCC2 celice smo transfektirali z vsako izmed plazmidov (prazni vektor [MOCK] ROCK1 3 'UTR divjega tipa [WT] in ROCK1 3' UTR mutant [MUT], kot miRNK-135a vezivnega mesta) skupaj s miRNA- 135a posnema, zaviralci miRNA-135a, in negativna kontrola RNA v 24 vdolbinami. Dva dni po transfekciji smo celice poberemo in lizirali. Luciferazne teste smo izvedli na lizatov z luciferazo analiznega kompleta (Promega, Madison, WI, ZDA). Luciferazno aktivnost je bila normalizirana na beta-galaktosidase.

Imunohistokemijsko

Imunohistokemijsko (IHC) obarvanje je bila izvedena za reprezentativne 20 primerih od ROCK1 nizko in visoko izražanja skupin. Antigen iskanje je bilo storjeno s toplotno obdelavo za 30 minut pri pH 8,0 Tris-EDTA (CC1, Ventana Medical sistema, Tucson, AZ, ZDA) pri 95 ° C. Tkiva drsi inkubiramo pri 42 ° C za 30 minut z anti-ROCK1 mAb (ab134181, klon EPR638Y, zajec monoklonskih, 1:5,000; Abcam, Cambridge, MA, USA). Negativne kontrole so enako uporabljati nonimmunized zajec IgG. Rezultate smo interpretirali z izkušeno patolog (MC kook).

Statistična analiza

Lestvica podatki so podani kot povprečne ± standardni odklon (SD). Chi-square ali Fisherjev testi in test Mann-Whitney U so bili uporabljeni za primerjavo kategorični spremenljivk in zvezne spremenljivke oz. Korelacijski koeficient Pearson je bil uporabljen za primerjavo izražanje genov vzorec med miRNA-135a in ROCK1. Multivariatno logistično regresijo model je bil uporabljen za določitev neodvisne dejavnike, povezane z LN metastaz. Spremenljivki, ki so pomembne z uporabo hi-kvadrat ali Fisherjev testi ( P
< 0,05) so bili vpisani v model logistične regresije. Vsi podatki so bili analizirani s pomočjo stata 12,1 (stata Corp, College Station, TX, ZDA). A P
vrednost manj kot 0,05 smo upoštevali kot statistično značilne.

Rezultati

ravni miRNA-135a izraz povezana z napredovanjem in LN metastaz v EGC

prejšnja študija je pokazala, da je miRNA-135a izraz navzdol urejeno v želodcu raka celičnih linijah [23]. Z uporabo QRT-PCR, smo tudi ugotovili, da je miRNA-135a izraz navzdol urejena v različnih želodčnih raka celičnih linijah v primerjavi s tisto v normalni želodca epitelijskega črto (slika 1A).

Vendar pa je korelacija med miRNA-135a izraz in klinične rezultate pri raku želodca ni bila raziskana. Zato smo merili raven izražanja miRNA-135a v primarnim rakom želodca in njihove ustrezne vrednosti v normalnih tkivih od 59 bolnikov z EGC. Navzdol in navzgor-regulacijo genov v tumorskih tkivih, s spoštovanjem do zdravega tkiva so opredeljena kot razmerje med tumorja na normalne ravni genov tkivo izražanjem < 1.0 in >. 1,0 oz

V nasprotju z rezultatom za in vitro
eksperiment, le 20 (33,9%) od 59 bolnikov z EGC razstavljene navzdol ureditev miRNA-135a izražanja. Vendar pa ti bolniki bistveno pokazala bolj napredno stopnjo (TNM stage≥IB, 35,0% proti 12,8%, p = 0,045; čudno razmerje surove [IN], 2.11; 95% interval zaupanja [IZ], 1.08-4.10) in A višja stopnja LN metastaz (30,0% v primerjavi s 5,1%, p = 0,014; surovo ali, 2,73; 95% iZ, 1,50-4,98) kot tisti z up-regulacijo miRNA-135a izražanja (tabela S1). Občutljivost in specifičnost statusa miRNA-135a izraz za napovedovanje LN metastaz bilo 75,0% in 72,5%, v tem zaporedju. Poleg tega so bolniki z večjo fazi (slika 1B) ali LN metastaz (slika 1C), so pokazale bistveno nižje razmerje tumorja na normalno raven miRNA-135a izražanja od tistih, s stopnjo IA ali brez LN metastaz. Multivariatno logistično regresijo Analiza je tudi pokazala, da miRNA-135a navzdol uredba je bila neodvisno povezano z LN metastaz (prilagojena OR, 8,04; 95% CI, 1,08-59,81; p = 0,042; tabela 1). Kolektivno, te ugotovitve kažejo, da se navzdol ureditev miRNA-135a izražanja lahko povezana z želodčno napredovanje raka, vključno z LN metastaz.

miRNA-135a zavira preživetja želodčni rak celic, EMT, migracije in invazije

Da bi še dodatno raziskati povezavo med miRNA-135a in kliničnih rezultatih, smo izvedli funkcionalne teste za celično preživetje, celični cikel, EMT, migracije in invazije v želodcu raka celičnih linijah. Čezmerno miRNA-135a, ki ga miRNA-135A posnema bistveno zatreti preživetje celic (Slika 2A) in povečala subdiploidna del od SNU668 celic, celično linijo, ki redko izraža Mirna-135A (slika 2B), kar kaže na povečano apoptozo želodčnih rakavih celic. Vendar zatiranje miRNA-135a zaviralcev miRNA-135A povzroča niti povečanje preživetja celic niti subdiploidne zmanjšanje delež v YCC2 celic, celično linijo, ki izraža znatno Mirna-135A (Slika 2A in 2B). Prav tako smo raziskovali povezavo med miRNA-135a izražanja in EMT v želodčnih rakavih celic, ker miRNA-135a navzdol uredbe naj bi bil neodvisen dejavnik tveganja za LN metastaz pri bolnikih EGC (tabela 1). Povečano izražanje miRNA-135a je bila povezana z zatiranja EMT in pokazala povečanje izražanju E-kadherina in zatiranje obeh N-kadherina in Slug v SNU688 celicah. V nasprotju s tem, zaviranje miRNK-135a izražanja povzročilo aktivacijo EMT vključno zatiranje E-kadherina izražanja in navzgor regulaciji tako N-kadherina in Slug izražanja v YCC2 celic (slika 2C). Pri ocenjevanju funkcionalnih posledic, čezmernim miRNA-135a, ki ga miRNA-135A posnema bistveno zatreti migracije in invazijo sposobnosti SNU668 želodčnih rakavih celic (slika 2D). Nasprotno, blokada miRNA-135a zaviralcev miRNA-135A znatno povečale migracije in vdor YCC2 želodčnih rakavih celic (slika 2e). Naši rezultati kažejo, da je miRNA-135a regulator tumor omejevalno za želodčne širjenje raka in metastaz.

ROCK1 je cilj gen miRNA-135a v želodčnem raku

Za pojasnitev mehanizmov podlaga učinki miRNA-135a na klinični rezultati, smo iskali domnevna cilje s pomočjo baze podatkov TargetScan 6.2. Od 718 ohranjenih cilje, smo izbrali cilje z največjim številom točk, katere navzdol ureditev lahko povzroči povečano proliferacijo rakavih celic, migracije in invazije. Ugotovili smo, da lahko ROCK1 ciljni gen miRNA-135a, ker je zaviranje ali zatiranje ROCK1 poročali, da spodbuja apoptozo in zatreti migracijo, invazijo in širjenje rakavih celic, vključno s tistimi za rakom želodca [28] - [30]. TargetScan analiza je pokazala, da ima 3'UTR zaporedje ROCK1 en možen vezavno mesto za miRNA-135a (slika 3A). Potrditi, ali je ROCK1 tarča miRNA-135a je bila luciferazo test izvedli. Luciferazni 3'UTR konstrukti, opisane v oddelku metode so co-transfektirali v SNU688 celice z miRNA-135A posnema in v YCC2 celice z zaviralci miRNA-135a. Prav tako zgrajena ROCK1 3'UTR Mut s točko mutacije C → G pri morebitnem vezavno mesto (slika 3A). Relativna luciferazno aktivnost ROCK1 3'UTR WT je v prisotnosti inhibitorjev miRNK-135a (slika 3B) znatno povečala. Nasprotno pa je bila ta dejavnost bistveno zmanjšalo v prisotnosti miRNA-135A posnema (slika 3c). V želodcu raka celičnih linijah, miRNA-135a in ROCK1 pokazali nasprotno izraz vzorec. Western blot analiza je pokazala, da je bila ROCK1 izraz navzdol urejeno v prisotnosti miRNA-135A posnema, in up-urejena v prisotnosti inhibitorjev miRNA-135A (Slika 3D in 3E). Če povzamemo, ti rezultati kažejo, da miRNA-135a zavira ROCK1 izraz, ki ga neposredno ciljanje svojo 3'UTR.

Izražanje ROCK1 je obratno povezana s položajem miRNA-135a pri bolnikih z EGC

Analiza 59 bolnikov z EGC pokazala, da je ekspresijski nivoji ROCK1 znatno negativno korelacijo s tistimi miRNA-135a (r = -0.697, p < 0,001; slika 4A). Poleg tega so bolniki z regulacijo navzgor miRNA-135a izražanja imela znatno nižje ravni ROCK1 beljakovin izražanja kot tisti z zmanjšanjem števila miRNA-135a (pomeni tumor na normalno razmerje, 0,81 v primerjavi z 1,55, p < 0,001; slika 4B) .

ROCK1 je povezana z LN metastaz v EGC in sodeluje pri migraciji želodčni rak celic in vdor miRNA-135a

zatreti Za dodatno oceni povezavo med ROCK1 izražanja in kliničnih rezultatov v EGC, smo analizirali vzorce ROCK1 izražanja glede na status LN metastaz vključenih bolnikov. Bolniki z LN metastaz imeli bistveno višjo izraz ROCK1 beljakovin kot tisti brez LN metastaz (pomeni tumor na normalno razmerje, 1,86 vs 0,93, p = 0,007; Slika 5A). Poleg tega so bile stopnje ROCK1 IHC obarvanjem podobne tistim ROCK1 izražanja v zahodni blot analizo ( tj
, bolniki brez LN metastaz imela šibke IHC obarvanja vzorcev [Slika 5b], ampak tisti z LN metastaz imela močan pozitiven IHC madeži [Slika 5C]).

Končno, da razišče, ali zatreti migracije in invazijo sposobnosti, ki jih daje miRNA-135a up-ureditev opazili v želodcu raka celičnih linijah so posledica ROCK1 regulacijo navzgor, smo izvedli migracijo in invasion testi, ki uporabljajo želodčni rak celičnih linij transfekciji s posebnim ROCK1 siRNA. ROCK1 siRNA zatreti migracijskih in invazivnih dejavnosti SNU668 celic (Slika 5D). V YCC2 celicah co-transfekciji z zaviralci miRNA-135A in ROCK1 siRNA (Slika 5E), migracije in invazijo testi so pokazali, da zaviranje ROCK1 ga siRNA znatno zmanjšalo krepijo migracijskih in invazivnih učinke miRNA-135a navzdol, uredbe z zaviralci miRNA-135a (Slika 5F).

kolektivno, ti rezultati kažejo, da je ROCK1 povezana z LN metastaz pri bolnikih EGC, in da je to posledica povečanega izražanja ROCK1 v okviru miRNA-135a navzdol regulaciji. Zato lahko ROCK1 vključeni v miRNA-135a-zatreti želodca metastaz raka.

Pogovor

V tej raziskavi smo ugotovili, da so imeli miRNA-135a tumorskih omejevalno vlogo pri raku želodca. Pri bolnikih z EGC, je navzdol ureditev miRNA-135a neodvisen dejavnik tveganja za LN metastaz. Pri želodčnih rakavih celic, kar je regulirano miRNA-135a zatreti želodčne rakotvornost s supresijo celične proliferacije, EMT in metastaz. Poleg tega smo ugotovili tudi nov ciljni gen miRNA-135a, ROCK1, ki je povezano z LN metastaz raka želodca.

Pri bolnikih z EGC, vrednotenje LN metastaz Pred zdravljenjem je pomemben korak pri določanju strategij zdravljenja. Manj invazivne zdravljenja kot endoskopsko resekcijo [5] - [7] ali sentinel LN navigacija kirurgija [9], [10] bo mogoče pri bolnikih EGC brez LN metastaz. Ti pristopi zdravljenja so izboljšali kakovost življenja bolnikov glede na poznih zapletov, povezanih s standardnimi kirurških posegov, vključno s stopnjo sindrom, hujšanje in povezanih simptomov refluksa [31]. Zato so potrebne bolj specifične in občutljive biomarkerjev napovedati status LN metastaz pri bolnikih z EGC. V tej študiji je miRNA-135a navzdol uredbe naj bi bil neodvisen dejavnik za LN metastaze in napoved vrednost statusa izražanja miRNA-135a je bila relativno visoka, z občutljivostjo 75% in specifičnost 73%. Čeprav so potrebne nadaljnje študije validacije, ti rezultati so pokazali, da je merjenje ravni miRNA-135A pred določanju načrt zdravljenja za bolnike EGC bi bil lahko uporaben test za napovedovanje stanja LN.

Zanimivo je, da so poročali o miRNA-135a biti tumorja omejevalno in onkogeni. Čezmerno miRNA-135a je bila povezana z preprečevanju širjenja tumorja in rasti karcinomom ledvičnih celic [21] in s povečano apoptozo in preživetje boljše proste bolezni limfoma [22]. V nasprotju s tem je miRNA-135a vključeni v kolorektalnega raka napredovanja [32] in povečane migracije prsi celic in invazije [33]. V tej študiji so miRNA-135a izkazalo, da je tumor supresivno miRNA, ki je v skladu z rezultatom predhodne študije [23]. Posebej, večji izraz miRNA-135a zatreti nekaj korakov želodca rakotvornost, vključno s proliferacijo, migracijo in invazijo. Poleg tega smo tudi ugotovili, da bi lahko miRNA-135a zatreti EMT, ki je poročal, da je povezana z začetkom večstopenjski proces kancerogenosti in promocijo metastaz [34], [35]. Pred tej študiji je povezava med miRNA-135a in EMT ni bila raziskana, čeprav so prejšnje študije pokazale, da miRNAs kot miRNA-27 [19] miRNA-200 družina [20], miRNA-7 [36] in miRNA-1228 [37] zatreti EMT prek svojih ciljnih genov pri raku želodca. Skupaj, miRNA-135a je tumor supresivno miRNA pri raku želodca.

Prejšnja študija analizira 353 človekove želodčne raka tkiva je pokazala, da so izraz vzorci miRNAs raznolike in da so bili nekateri miRNAs povezana z napredovanjem in prognozo v želodcu raka [14]. V študiji so miRNA-135a razvrščen kot onkogenih miRNA pri bolnikih z rakom želodca, ki temelji na rezultatih analize DNK mikromrež. Vendar pa je v nedavni [23] in naši raziskavi, miRNA-135a deloval kot zaviralnih kljub visoki stopnji bolnikov z miRNA-135a regulaciji navzgor. Čeprav je veliko bolnikov (66%) je imelo up-regulacijo miRNA-135a podoben rezultat predhodne študije [14], ti bolniki so pokazale bistveno manj napredno stopnjo in nižjo stopnjo LN metastaz. Poleg tega dodatni in vitro
študije so pokazale, da je bila višja izraz miRNA-135a povezan z zatiranjem želodčne rakotvornost. Ti rezultati kažejo, da bi izraz vzorci miRNAs razlikujejo od kliničnih izidov, in tako potrjujejo natančne vloge posameznih miRNAs, so potrebne nadaljnje študije.

ROCK1 je član Rho-povezano serin /treonin kinaze družina, ki deluje kot centralni regulator aktina citoskeletona organizacije in dinamike [23], [38]. ROCK1 ima raznoliko paleto funkcij tumorigeneze, vključno z migracijo, invazijo in metastaz [28]. ROCK1 je tarča številnih miRNAs v različnih vrst raka, vključno z miRNA-584 v karcinomom ledvičnih celic [39], miRNA-335 v nevroblastoma [40], in miRNA-146a pri raku prostate [41]. Pri raku želodca, ROCK1 je v pozitivni korelaciji z LN metastaz in stopnji TNM [42], ki je vključena v miRNA-148a-inducirane zatiranja migracij želodca rakave celice in invazije [30]. Poleg tega ROCK1 inhibitor spodbuja apoptozo v želodčnih rakavih celic [29]. V tej raziskavi smo ugotovili, da je ROCK1 tarča miRNA-135a pri raku želodca in njen izraz je pozitivno povezana z LN metastaz pri bolnikih EGC. In vitro
poskusi tudi pokazala, da je ROCK1 vključen v želodčni rak celic gibljivost in invazijo. Ti rezultati kažejo, da lahko ROCK1 nov terapevtski cilj, s sposobnostjo, da inhibira želodčne metastaze raka.

Na koncu smo opredelili Mirna-135A kot nov prognostičnih biomarker za LN metastaz pri bolnikih z EGC in pokazali, da miRNA-135a zatreti želodčne rakotvornost ( tj
, orožja, EMT in metastaze v želodcu raka celičnih linijah) z usmerjanjem ROCK1. Čeprav so te ugotovitve zahtevajo potrditev v drugih neodvisnih skupin bolnikov, ki kažejo, da so lahko miRNA-135a in njen ciljni gen ROCK1 nov biomarker in terapevtski cilj za raka želodca z LN metastaz.

dodatne informacije
Tabela S1 .
Clinicopathologic značilnosti bolnikov z zgodnjim rakom želodca glede statusa izražanja miRNA-135A
doi:. 10,1371 /journal.pone.0085205.s001
(DOC)

Other Languages