Plos ONE: Resveratrol zavira rast želodčnega raka, ki ga indukcijo G1 faza za prijetje in staranje v SIRT1 odvisnih Manner

Povzetek

resveratrol, naravno polifenolnih spojin, so poročali, da izvajajo aktivnosti proti raku, ki vplivajo na razni molekularne tarče. V tej študiji smo preučevali učinke in temeljnih mehanizmov resveratrola na raka želodca. Ugotovili smo, da resveratrol inhibira proliferacijo želodčnih rakavih celic na način, odvisen od doze. Pri koncentraciji 25 in 50 um, resveratrol zaviral preživetja celic in zmanjšalo klonogene potencial želodčnih rakavih celic. Zdravljenje Resveratrol aretiran želodčne rakave celice v G1 fazi in je privedla do staranje namesto apoptoze. Regulatorji celičnega cikla in staranje poti, vključno s ciklin D1, ciklin-odvisne kinaze (CDK4 in 6), p21 in P16, smo dysregulated z obdelavo resveratrol. Zaviralni učinki resveratrola na raka želodca so bili preverjeni tudi in vivo
uporabo gola modela miši ksenotransplantskih. Resveratrol (40 mg /kg /d), ki deluje inhibitorne aktivnosti na razvoj raka želodca in znatno zmanjšal frakcij Ki67-pozitivnih celic v tumorskih vzorcih iz golih miši. Po zdravljenju resveratrola, sta bila indukcija staranje in spremembe v izražanju regulatorjev, ki sodelujejo pri poti na celičnega ciklusa in staranje podoben temu, kar smo opazili in vitro
. Vendar pa je izčrpavanje Sirtuin (sirt) 1 obrnil zgoraj opisanih učinkov resveratrola tako in vitro
in in vivo
. Naši podatki kažejo, da resveratrol zavira raka želodca v SIRT1 odvisnega način in podrobno dokaz za možnost uporabe resveratrol želodčnega preprečevanju raka in zdravljenju

Navedba. Yang Q, Wang B, Zang W, Wang X Liu Z Li W, et al. (2013) Resveratrol zavira rast želodčnega raka z indukcijo G1 faza Arrest in staranje v SIRT1-odvisen način. PLoS ONE 8 (11): e70627. doi: 10,1371 /journal.pone.0070627

Urednik: Dominique Heymann, Fakulteta de médecine de Nantes, Francija

Prejeto: March 20, 2013; Sprejeto: 19. junij 2013; Objavljeno: 21. november 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprl Nacionalni Natural Science Foundation Kitajske (št 81101869, 81100103, 81171536 in 81000868), Nacionalni Temeljni raziskovalni program Kitajske (973 program, št 2012CB911202) in Independent Foundation inovacije Shandong University (2012TS108) .The financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. avtorji so izjavili, da niso konkurenčni interesi obstajajo

Uvod

rak želodca (GC) je četrti najpogostejši rak in drugi najpogostejši vzrok smrti, povezanih z rakom na svetu. Glede na globalno oceno, je bilo skupno 989,600 novih primerov GC diagnosticirane in najmanj 738,000 bolnikov je umrl zaradi te bolezni leta 2008, kar predstavlja 10% vseh smrti zaradi raka [1]. Čeprav je pojavnost GC upada po vsem svetu, je še vedno visoka v državah v razvoju, predvsem na Kitajskem [1], [2]. Prejšnje študije so pokazale intimen odnos med kronični gastritis s povzročil Helicobacter pylori
okužbe in razvoj GC [3]. Poleg tega so bili gostiteljske genetskih, okoljskih, prehranskih in drugih dejavnikov vpleten v želodčnem onkogenih postopka [1]. Ker je še vedno težko, da bi zgodnjo diagnozo za GC, večina bolnikov zboli v poznejših fazah. Kljub izboljšanju konvencionalnih zdravil za napredno GC, vključno z operacijo, kemoterapijo in obsevanjem, dolžino in kakovost življenja bolnikov z napredovalim GC je še vedno slaba [2], [4]. Zato je nujno potrebno iskanje novih preventivnih zdravil ali terapevtskih ciljev GC.

Poraba svežega sadja in zelenjave prispeva k zmanjša incidenco raka, vključno z GC [2], [5]. Klinične aplikacije prav tako kažejo, da imajo nekateri bioaktivne dietni molekule zmožnost inhibiranja več onkogenih korake [5] - [7]. Resveratrol (Res, 3,5,4'-trihydroxystilbene) je naravno polifenolni spojina prisotna v skoraj 70 rastlinskih vrst, vključno s kožo, rdeče grozdje, arašidi, jagode in druge [6] - [8]. Res je bil prvič poročali izvajati protitumorske aktivnosti v letu 1997 [8]. Slej poročila so pokazale, da Res vezni zaviralno na več vrst raka, kot je rak debelega črevesa, raka na dojki in limfomi in vpliva na različne molekulske cilje [9] - [11]. Sirtuin 1 (SIRT1), razred III nikotinamid adenin nukleotidov (NAD ^{+) - odvisno histon /beljakovine deacetilaze, so poročali, da je ključni cilj Res v različnih modelih tumorjev [9], [10]. Vendar pa nekateri podatki kažejo, v nasprotju rezultate, ki kažejo, da Res izvaja kemo-zaščitno učinke neodvisna od SIRT1 [11]. Zaviralni učinki Res na GC in osnovnega mehanizma niso dobro raziskani.}

V tej študiji smo pokazali, da Res inhibira proliferacijo GC celic in vitro
. Zdravljenje res povzroča aretacijo celičnega cikla v fazi G1 in je privedla do celično staranje. Ti učinki Res so se vrnila s izčrpavanja SIRT1. Zaviralni SIRT1 odvisna od dejavnosti Res o GC celic so bili preverjeni tudi in vivo
. Skupaj, naši rezultati kažejo, da Res izvaja SIRT1 odvisna od zaviralno na GC in predlaga terapevtsko vlogo OVE v GC.

Etika Izjava materiale in metode

Vse študije na živalih so bili odobreni Odbor za etiko Shandong University School of Medicine (št 001 v letu 2011 za etiko živali soglasja) in je bila opravljena vsa prizadevanja za zmanjšanje trpljenja.

Cell Lines, Kultura pogoji in Res Zdravljenje

Human GC celične linije AGS (pridobljeni iz celic Resource Center, Shanghai Institute of biokemijo in biologijo celice na kitajske akademije znanosti), BGC-823 in SGC-7901 (kupljen iz kitajske Center za Type Culture Collection, Wuhan, Kitajska), so bile uporabljene v tej študiji. Celice smo kultivirali v F12 (AGS) ali RPMI 1640 (BGC-823 in GSS-7901), ki vsebuje 10% FCS, 100 enot /ml penicilina in 2 mmol /L L-glutamin pri 37 ° C v navlaženi atmosferi, ki vsebuje 5% CO _{2. Visoke čistosti Res smo kupili pri Sigma (St. Louis, MO, ZDA), raztopimo v DMSO in dodamo v mediju kulture pri navedeni koncentraciji. Vse poskuse smo izvedli 24 ur po Res dopolnitev, razen če ni navedeno drugače.}

Mali Motnje RNA Transfekcija

Kemično modificirane mala motečih RNA (siRNA), ki ciljajo SIRT1 in nadzor siRNA so kupili od GenePharma (Shanghai , Kitajska). Sekvenca SIRT1 siRNA je 5'-CCAUCUCUCUGUCACAAAUTT-3 '. Celice smo inkubirali čez noč in nato transfekciji s siRNA uporabo Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) v skladu s protokolom proizvajalca. Oseminštirideset ur po siRNA transfekciji smo celice zdravljeni z 50 um Res 24 ur pred nadaljnjo raziskavo.

preživetje celic testu

orožja je bila ocenjena s pomočjo Cell titer 96 ® vodni One Solution celični proliferacijski test (Promega, Madison, WI, ZDA). Na kratko, 2 x 10 ^{3 celice smo zasejali v 96 vdolbinicami in pustimo, da raste pri 24 h. Štiriindvajset ur kasneje, 20 ul MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-karboksi-metoksifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazolijevega) dodamo v vsako dobro. Po inkubaciji 3 ure pri 37 ° C, je bila absorbanca pri 490 nm posneli na Varioskan Flash večploščnimi Reader (Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA). sposobnost preživetja celic smo izračunali po naslednji formuli: Relativna viabilnost celic = (povprečna absorbanca tretirani skupini - povprečna absorbance praznih) /(povprečna absorbance kontrole.Pri skupinski povprečne absorbance prazno). Teste smo izvedli v treh izvodih ponovili trikrat.}

kolonija Formation Vsebnost

Celice smo zasejali v 6 vdolbinami (300 ali 500 celic na jamico) in inkubirali 10 dni, dokler so bile kolonije dovolj velika, da se jasno razloči. Celice so bile določene z metanolom in obarvamo z kristal vijoličnim in število kolonij z več kot 50 celic smo prešteti ročno. Eksperimente smo izvedli v treh izvodih ponovili trikrat.

Cell Cycle Analiza

Celice požanjemo, določen z vnaprej ohlajeno 70% etanolom pri 4 ° C preko noči in nato obarvali s propidijevim jodidom (Beyotime , Jiangsu, Kitajska), ki vsebuje RNaze A pri 37 ° C za 30 minut v temi. Porazdelitev celični cikel je bila določena z uporabo pretočnim citometrom (BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA) in podatke smo analizirali z multicycle programske opreme (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA, ZDA). Poskuse smo izvedli neodvisno trikrat.

Apoptoza Vsebnost

Odkrivanje in kvantitativna apoptoze smo izvedli z označevanjem prelomov verige DNA z uporabo in situ Cell Death Detection Kit, TMR rdeče (Roche Applied Science, Basel, Švica). Celice ali parafin deli presadkov so označeni z Tunel v skladu z navodili proizvajalca. Za celice, zdravljenje z 0,2 mM H _{2O 2 za 12 h služil kot pozitivno kontrolo. Za parafinskih sekcijami so bile pozitivne kontrole kupljene od Millipore (Billerici, MA, ZDA). Jedra so jih nasprotno z DAPI (Beyotime) in diapozitive ali odseki so posneli s fluorescenčno mikroskopijo (Olympus, Tokyo, Japonska), z uporabo programske opreme cellSens razsežnosti. Poskuse smo izvedli neodvisno trikrat.}

β-galaktozidaza obarvanje

staranje je bila ocenjena s pomočjo staranje beta-galaktozidaza barvanje Kit (Beyotime). Na kratko smo celice ali zamrznjenih sekcije presadkov fiksna in nato inkubiramo s sveže pripravljeno beta-galaktozidaza (β-Gal) obarvanje raztopine pri 37 ° C preko noči. Poskuse smo izvedli neodvisno trikrat.

Stabilni lentivirusni-kratek Ostra RNA (shRNA) GC celice

lentivirusni vektorji vsebujejo nadzora ali SIRT1 shRNA so bile zgrajene s GenePharma in se uporabljajo za transfekcijo BGC-823 celic. Učinkovito rasklapanje od SIRT1 je bila preverjena z western blot. Za stabilno transdukcija, nadzor lentivirusom okuženih ali SIRT1 shRNA lentivirusom okuženih BGC-823 celice smo gojili v kompletnem mediju dobili z 2 ig /ml puromicina štiri tedne in se šteje za LV-C in LV-S, v tem zaporedju.

golih miših ksenotransplantskih Model

Ženski atimične BALB /c golih miši (6~8 tednov) so bile kupljene iz Peking University (Peking, Kitajska) in so bile ohranjene pod posebnimi pogoji, brez patogenov na ključ laboratorij za kardiovaskularno Remodeling in funkcije raziskave, Qilu bolnišnici, Shandong University. Miši smo naključno razdelili v štiri skupine (8 miši za vsako skupino): skupina I in II, BGC-823 celice (1 x 10 ^{6 celic na injiciranje v 0,1 ml PBS) so subkutano injicirali v bok območju od golih miši; Skupina III, smo injicirali LV-C (BGC 823 celic); in skupina IV, LV-S (BGC-823 celic) vbrizgamo. Po implantaciji, golih miši iz skupine II, III in IV so bili zdravljeni z Res (40 mg kg -1 v 0,1 ml rastlinskem olju, upravlja z gavažo, enkrat na dan). Podkožno velikost tumorja je bila izmerjena z čeljusti in obseg tumorja smo izračunali s formulo (dolžina) × (širina 2) /2. Miši smo usmrtili štiri tedne kasneje. Tumorji so bile pridelane in predelane za Western Blot in imunoloških raziskavah.}

Real Time-kvantitativno PCR (RT-qPCR)

Total RNA v celicah smo izolirali s pomočjo TRIzola reagenta (Invitrogen) in pretvori v cDNA z PrimeScript ™ RT reagenta komplet (Takara, Tokio, Japonska). RT-qPCR smo izvedli za gene, vključno s ciklin D1, ciklin-odvisne kinaze 4 (CDK4), p21 in P-aktina, kot smo že prej opisali [12]. Sekvence iz ojačevanja primerji so navedeni v tabeli S1. MRNA izraz ciklin D1, CDK4 in p21 je normalizirana na beta-aktina v primerjavi z nadzorom z uporabo 2 ^{-ΔΔCt metodo. Vsak poskus smo ponovili v treh izvodih.}

Western Blot

Skupaj beljakovin iz celic ali vzorcev tumorjev smo ekstrahirali z RIPA lizo Buffer (Beyotime), kot je opisano [12]. Koncentracijo proteina smo določili z BCA Protein analiznega kompleta (Pierce, Rockford, IL, ZDA). Membrana je skeniran s protitelesi proti SIRT1 (Abcam, Cambridge, MA, ZDA), bcl-2, BAX, kaspaze-3, ciklin D1, CDK4 in 6 (celična signalizacija, Danvers, MA, ZDA), P16 in p21 (Božiček Cruz Biotechnology, santa Cruz, CA, ZDA). Sekundarna protitelesa uporablja bil s hrenovo peroksidazo (HRP), označenih s anti-zajec ali protitelesa miške. Beljakovinsko trakovi smo prikazali z uporabo sistema ECL (Pierce). β-aktin (Cell signalizacija) je služila kot kontrola nakladanja.

Imunohistokemija

so deparaffinized Tumorske vzorce iz golih miših rehidrirano in antigen najdena. Oddelki inkubiramo s protitelesom proti Ki67 (1:500, Abcam) preko noči pri 4 ° C. HRP-konjugirana anti- zajec IgG in DAB madeži so bili zaposleni za vizualizacijo protitelo Ki67. Diapozitivi so bili končno jih nasprotno z hematoksilinom. Diapozitivi so posnel z Olympus svetlobnim mikroskopom (Tokio, Japonska), z uporabo programske opreme cellSens razsežnosti. Je Ki67-pozitivne celice preštejemo ročno in odstotek Ki67-pozitivnih celic so bile ocenjene na poljih. Pet ločena polja so šteli za vsak del.

Statistična Analize

Podatki so izraženi kot povprečje ± SD. Statistične analize so bile izvedene s pomočjo statističnega paketa za družbene vede (SPSS, različica 16.0, Chicago, IL, ZDA) enosmerno ANOVA s Tukey post-hoc test. P-vrednosti manj kot 0,05, so bile obravnavane statistično značilne.

Rezultati

Res zavira sposobnost preživetja GC celic v SIRT1-odvisen način

Tri GC celične linije (AGS, BGC-823 in SGC-7901) so bile pregledane v naših poskusih. Kultiviranje celice v vozilu (0,1% DMSO) ni vplivala preživetja celic (podatki niso prikazani). Vendar, če obdelamo z različnimi koncentracijami Res 24 h, celična proliferacija je v odvisnosti od odmerka zaviral pri 25, 50, 100 in 200 pm Res (slika 1A). Pomembno je omeniti, je širjenje AGS očitno zaviral, če jih zdravimo z 10 mikrometrov Res, ki ni bilo opaziti v drugih dveh celičnih linij (slika 1A). V vseh treh celičnih linij, je bila prisotnost 100 um Res dovolj, da povzroči več kot 50% inhibicijo rasti (56.78% za AGS, 54.87% za BGC-823 in 52.16% za SGC-7901, v tem zaporedju). Zato smo uporabili 25 in 50 um Res za nadaljnje poskuse. Za določitev funkcionalnega vlogo SIRT1 pri zdravljenju Res smo podrli SIRT1 izraza z posebno siRNA. Učinkovito zaviranje SIRT1 izražanja je bila preverjena z western blot (slika 1B). Rezultati testa so pokazali, da MTS v SIRT1-osiromašenega celic Res ni inhibira celično proliferacijo (slika 1C). Ti podatki kažejo, da je Res lahko zavira proliferacijo GC celic in da je zaviralni učinek lahko rešili izčrpavanje SIRT1.

Res zmanjšuje klonogene potencial GC celic na način SIRT1 odvisna od

za tumorskih celic, je tvorba kolonija ugotovljeno, da je bolj občutljiv parameter kot izvedljivosti, da ocenijo učinek zdravila. Tako so bila prizadevanja opravile za določitev učinka Res na klonogene potencial GC celic. Res, pri koncentraciji 25 pM, povzročila znatno zmanjšanje poudarkov številu kot tudi velikosti v GC celicah. Po zdravljenju z 50 um Res je klonogene morebitno dodatno zmanjšala. Vendar rasklapanje od SIRT1 pred zdravljenjem Res povečalo število žarišč na raven, primerljivo s skupino vozil (slika 2).

Res povzroča kopičenje GC celic v G1 fazi v SIRT1 odvisnega načinu

Da bi preučili zaviralni učinek Res na GC celic, smo izvedli analizo celičnega cikla. Opazili smo, da 25 in 50 um Res povečal delež celic v fazi G1 tako BGC-823 in SGC-7901 celic (sliki 3a in 3b). Indukcija G1 fazo prijetje ga Res je tudi odvisna od odmerka. Res v koncentraciji 50 pM pokazali močnejši učinek, kot je to storil pri 25 uM. Povečanje števila celic v G1 fazi je spremljalo zmanjšanje populacije celic predvsem v fazi S. Izčrpavanje SIRT1 pred zdravljenjem Res zmanjšala G1 fazi indukcije Res (sliki 3a in 3b). Za potrditev zgornje rezultate, smo pregledali izražanje regulatorjev celičnega ciklusa faze G1, vključno ciklin D1, CDK4, CDK6, p21 in P16 v BGC-823 celic. Kot je prikazano na sliki 3C, pri Res zdravljeni BGC-823 celic, koncentracijo proteinskih aktivatorjev G1 /S prehoda (ciklin D1, CDK4 in CDK6) znižala, medtem ko se količina beljakovin inhibitorjev CDK (CDKIs) (p21 in p16) se je povečala. V nasprotju s tem pa so bile te spremembe ni bilo mogoče najti v SIRT1-osiromašenega BGC-823 celic, ko so bili zdravljeni z 50 um Res. Podobne rezultate smo dobili z RT-qPCR za ciklin D1, CDK4 in p21 (slika 3D).

Pomanjkanje sub-G1 celic, je pokazala, da zdravljenje Res ni sprožil apoptozo v GC celic (slika 3A) , ki je bil v skladu z rezultati TUNEL poskusov označevanja iz BGC-823 celic (Slika S1A). Ravni proteinske povezanih z apoptoze molekul, kot bcl-2, BAX in kaspaze-3, iz vsake skupine so bili primerljivi (slika S1B). Skupaj, naši rezultati kažejo, da Res povzroča G1 fazi aretaciji v GC celic v SIRT1 odvisnega način in ne inducira apoptozo.

Res povzroča staranje GC celice v SIRT1 odvisnega načinu

v naših rokah, Res se kaže v rasti aretaciji namesto povečano apoptozo. Zato smo še naprej prizadeva, da razišče, ali bi Res sprožijo staranje v GC celicah. beta-Gal obarvanje, posebno označevalec senescentnih celicah sesalcev, je bila uporabljena. Po zdravljenju Res smo ugotovili Povečani frakcije celic smo obarvali z beta-Gal. Vendar pa je predobdelava z SIRT1 siRNA blokiran Res inducira celično staranje (slika 4). Podobne rezultate smo dobili iz obeh BGC-823 in SGC-7901 celic, kar kaže, da Res vzdrževani na SIRT1 inducira celično staranje v GC celicah.

Res zavira rast tumorja in vivo v načinu SIRT1 odvisnega

Nato so bile izvedene dodatne študije za določitev učinkov Res na BGC-823 rasti presadkov pri golih miših. Za in vivo
raziskavi smo uporabili stabilne transducirani lentivirusni-shRNA BGC-823 celic. Od štirih SIRT1 shRNA-lentiviruses, LV-1 in LV-4, ki deluje očitne utišanje učinke na SIRT1 izražanja (Slika S2). Po štirih tednih pregleda, je izraz SIRT1 ohranila na zmanjšala ravneh v stabilnih lentivirusni-shRNA BGC-823 celic (Slika S2). Stabilni LV-1 lentivirusni-shRNA BGC-823 celic smo uporabili v naslednjih presadkov študij zaradi močnejših zaviralne učinke na SIRT1 izražanja v primerjavi s LV-4. Vse živali preživela do konca naših eksperimentih in ni očitna razlika je bila najdena v svojo telesno težo (podatki niso prikazani). Štiri tedne po implantaciji, meritve količin tumorskih je pokazala, da zdravljenje Res močno zmanjšala rast BGC-823 presadkov (Res vs nadzor: 0.5728 ± 0,2276 cm ^{3 vs 1.4288 ± 0,1741 cm 3, P < 0,001) . Stabilno transdukcija kontrolnega shRNA lentivirusom ni bistveno vplivalo na obseg tumorja (Res vs Res + Ci: 0.5728 ± 0,2276 cm 3 vs 0,68 ± 0,0672 cm 3, P = 0,603). Vendar pa je v SIRT1-izčrpanih presadkov, zaviralni učinki Res na rast tumorja so rešili (Res + Si vs Res + Ci: 1.2313 ± 0,1777 cm 3 vs 0,68 ± 0,0672 cm 3, P < 0,001, Res + Si vs nadzor: 1.2313 ± 0,1777 cm 3 vs 1,4288 ± 0,1741 cm 3, P = 0,123) (slika 5A). V Res zdravljenih presadkov so, marker orožja, Ki67, bistveno zmanjšalo (slika 5B) (v% Ki67-pozitivnih celic, Res vs nadzor: 3 ± 1,8 vs 44,67 ± 3,79, P < 0,001). Senescenco opazili v presadkov iz Res zdravljenih miših s β-Gal barvanjem (slika 5B) navedene. Vendar pa ni bilo jasno, apoptozo inducira Res v presadkov (Slika S1D) in regulatorji apoptoze, kot bcl-2, BAX in kaspaze-3 (slika S1C) niso opazili nobenih sprememb. Ti rezultati so skladni z in vitro
poskusih. Poleg tega so bile spremembe v izražanju regulatorji celični cikel, vključno ciklin D1, CDK4, CDK6, p21 in P16 podoben temu, kar smo opazili in vitro
(slika 5C). Vse opažene v Ki67, P-Gal in regulatorji celičnega ciklusa spremembe so bile odpravljene s SIRT1 izčrpanosti (sliki 5B in C) (v% Ki67-pozitivnih celic, Res + Si vs Res + Ci: 46,32 ± 6,03 proti 2,65 ± 1,53, P < 0,001, Res + Si vs nadzor: 46,32 ± 6,03 proti 44,67 ± 3,79, P = 0,946)}

Pogovor

Res, naravni polifenol, ki se trenutno ocenjuje kot obetavno proti raku. sredstvo. Čeprav je bilo dokazano, da jim dajo antiproliferativne učinke proti več vrstam raka tako v celičnih kulturah in ksenotransplantskih modelov [9] - [11], njegove kemoprevencija učinki na GC in osnovnega mehanizma niso dobro raziskani. V tej študiji smo dokazali, da Res inhibira proliferacijo GC celičnih linij (AGS, BGC-823 in SGC-7901). aktivnost anti-rast smo opazili, ko smo celice obdelali s 25 um Res 24 ur, in zaviralni učinek je odvisna od odmerka. V koncentraciji od 50 um Res, razmerja inhibicija teh treh celičnih linij bilo 41%, 34% in 32%. Ko je koncentracija Res še povečala, so se okrepili zaviralni učinki. Oba 100 in 200 um Res inhibira rast za več kot 50% v primerjavi s skupino vozil. Poleg tega je večji odmerek Res je prevelika, da bi dosegli in vivo
in zato nima smisla v kliničnem okolju [13], [14]. Zato smo uporabili dve spodnji učinkovite koncentracije 25 in 50 um Res v nadaljnjih raziskavah. Zdi se, da zaviranje dejavnost rast Res, da je specifičen za celice, kot IC50 razlikuje glede na vrsto celic in se giblje od 27 uM do 180 pM [9] [10] [15] [16]. Nekatere od teh študij so pokazali tudi, da Res izvaja zaviralne učinke v odvisnosti od časa način [15], [16]. Koncentracija in trajanje zdravljenja Res se uporablja v naši raziskavi so bili v skladu z večino poročil iz drugih skupin [8], [9], [16]. Za in vivo
študije, metoda uprava smo uporabili, je v grlo, ker je to način, ki se običajno uporablja pri miših kot alternativa za intraperitonealno injekcijo [15], [17]. Poleg tega so raziskave na miših je pokazala, da je Res učinkovito absorbira po peroralni uporabi in jih lahko najdemo po vsem telesu [17], [18]. Ko se uporablja in vivo
, Res znatno zmanjšal proliferacijo celic, kot je značilna Ki67 izražanja, ki je v skladu z rezultati naših vitro
poskusov.

Res lahko upočasni širjenje rakavih celic z različnimi mehanizmi, med katerimi, regulacija celičnega ciklusa je pomembna [9] [15] [19]. Naš in vitro
podatki pokazali, da je zdravljenje GC celic z Res povzroča G1 fazo aretacijo. G1 faza je prva od štirih faz celičnega cikla, ki poteka pri delitvi evkariontski celici. G1 je še posebej pomembna faza celičnega ciklusa, ker je točka, na kateri se celica obvezuje, da bo krog delitve. Napredovanje po G1 fazi zahteva oblikovanje in delovanje ciklin D-CDK4 ali -CDK6 kompleksov. Ti kompleksi potem fosforilacije retinoblastom, ki vodi k izpustitvi E2F transkripcijskih faktorjev in genskega prepisovanja na nižji stopnji, ki sodeluje v S fazo napredovanje. Dejavnosti ciklin D-CDK kompleksov ureja nabavnih inhibitorjev, vključno s člani INK (P15, P16 in P18) in družine CIP (p21, p27 in p57) [20], [21]. Ob isti liniji, skupaj z G1 fazo aretacijo je, smo opazili, da downregulation za ciklin D1, CDK4 in CDK6 in uravnavanjem p21 in P16 v Res zdravljenih GC celic. Naša in vivo
rezultati izražanjem teh regulatorjev celičnega ciklusa v vzorcih tumorjev so v skladu s in vitro
rezultatov. Naši rezultati so skladni tudi s tistimi iz prejšnjih študij [15], čeprav so nekateri drugi pa so poročali, da je S faza prijetje ki jih povzroča Res [9], [19]. Obstojnost rasti prijetje lahko povzroči apoptozo ali staranje v celicah. Ker sta P21 in P16 signalnih poti sodelovati pri napredovanju staranje, posredovanega z različnimi vrstami stresa [22], [23], smo izvedli beta-Gal madeže. Zdravljenje res znatno povečala pogostost senescentnih GC celic na način, odvisen od doze. Celični Program senescenco predstavlja pomembno oviro pred začetkom raka in razvoj [24], [25]. Čeprav so prejšnje študije kažejo, da se s pomočjo slabljenje oksidativnega stresa in izboljšanje stanja metabolizma, Res izvaja anti-aging učinke tako in vitro
in in vivo
[26] - [28], nasprotni učinki so prikazani v raku. Res je bilo ugotovljeno, da inducira inhibicijo rasti staranjem, kot v nekaterih vrstah raka [29], [30]. Dvojna vloga obnovljivih virov energije v celičnem staranje, zavirajo staranje v normalnih tkivih in pospešeno staranje v tumorjih, zaradi česar je idealen kandidat za preprečevanje in zdravljenje raka.

Apoptoza je še en skupni učinek, ki je običajno opaziti v Res obdelano rakave celice [9] [11] [15] [16]. Eksperimentalni dokazi kažejo, da se apoptozo lahko posreduje več različnih poti in številnih regulatornih molekul. Med temi regulatorji, proteini obsegajo družine Bcl-2, so pomembne. Obstajajo tako antiapoptozne proteini (bcl-2, bcl-xl) in pro-apoptotske proteini (BAX, slabo, bak in bcl-xs) v tej družini. Povečanje bcl-2 razmerje pro-apoptotični BAX /anti-apoptotske poveča prepustnost mitohondrijske membrane, povzroči sproščanje citokroma c iz mitohondrijev za citosolu in po drugi strani za posledico aktivacije kaspaze-9 in nadaljnji ciljno kaspazo-3 [31]. Kljub temu intrinzične apoptotske poti, pro-apoptotična ligande, kot FasL, z vezavo na njihove receptorje in tako povzroči aktivacijo kaspaze-8 in zaključnih efektorjev, kot kaspaze-3. Aktivacija efektor kaspazah povzroči cepitev mnogih celičnih substratov in se neposredno povzroča apoptozo [31] - [33]. Čeprav so številni prejšnjih poročilih je navedeno, da je apoptoza odgovoren za Res inducirane inhibicije rasti nismo upoštevali očitno apoptozo v Res zdravljenih GC celic. Ta odsotnost apoptoze lahko zaradi koncentracije in trajanja zdravljenja Res prilagojen v našem poskusu saj študije iz različnih skupin kažejo, da Res izvaja dosage- in trajanje odvisni učinke [34], [35]. Poleg tega, kot učinkov Res je tudi, specifičen za celice [36] - [38], lahko GC celice, ki se uporabljajo v naši raziskavi so odporne proti Res inducirane apoptoze

Res ima več ciljev.; med katerimi, v razred III NAD ^{+ - odvisno deacetilaze SIRT1 je najpogosteje preučevali. Čeprav biokemični študija je pokazala, da Res ni bil neposredno aktivator SIRT1 [39] Res je vedno veljala za klasično agonistom SIRT1. Številne študije kažejo, da Res izvaja različne učinke v različnih modelih v SIRT1 odvisnega način [40], [41]. V našem poskusu, SIRT1-izčrpavanje obrnil inhibicijo rasti Res tako in vitro
in in vivo
. G1 faza prijetje in senescenco po zdravljenju Res povzročene so rešili s SIRT1-izčrpavanje. Ti rezultati kažejo, da so učinki inhibicije Res o GC odvisna od SIRT1. Po predhodnih študij, lahko SIRT1 uravnavajo izražanje genov preko dveh različnih mehanizmov. Prvič, neposredno, SIRT1 neposredno posreduje Deacetilacijo beljakovine, nato pa povečuje njeno ubikvitinacije in kasnejše ubikvitin degradacija proteasoma [42]. Drugič, posredno SIRT1 izvaja deacetilaze dejavnost, ki vpliva na potrditev kromatin ali zatiranje dejavnosti transkripcijskih faktorjev in nato uravnava transkripcijo genov [43] - [45]. Kot niso bile prijavljene zaradi neposrednih ciljev SIRT1 molekul (ciklin D1, CDK4, CDK6, P21 in P16), ugotovljenih v naših poskusih smo razmišljal, da bi SIRT1 uravnavajo izražanje teh genov v glavnem skozi posredno mehanizma. Rezultati RT-qPCR podpira tudi to hipotezo.}

Če povzamemo, naše ugotovitve kažejo, da Res zavira tudi širjenje GC celic in vitro
in rast presadkov in vivo
. Zdravljenje res povzroča G1 fazi aretaciji v GC celicah in vodi v staranje namesto apoptoze. SIRT1-izčrpavanje reši zgoraj opisani učinki Res tako in vitro
in in vivo
. Naše delo kaže, da Res zavira GC v SIRT1 odvisnega način in zagotavlja podrobne dokaze za možnost uporabe obnovljivih virov energije v preprečevanju GC in terapijo.

Podpora Informacije
Slika S1.
Res izvaja nobenih učinkov na apoptozo BGC-823 celic. (A) Apoptoza je označeno z TUNEL označevanja (rdeča) in BGC-823 celic, so jih nasprotno z DAPI (modra). Zdravljenje z H 2O 2 služil kot pozitivno kontrolo. Original povečava: × 200. Dimenzijske barov, 50 um. (B) Regulatorji apoptoze v BGC-823 celic, vključno bcl-2, BAX in kaspaze-3 smo analizirali z Western blot. (C) Regulatorji apoptoze v presadkov, vključno bcl-2, BAX in kaspaze-3 smo analizirali z Western blot. Za odkrivanje cepljen kaspaze-3, BGC-823 celice zdravijo z H 2O 2 služil kot pozitivno kontrolo (prikazano na desni strani zaslona). (D) Apoptoza v presadkov odkril TUNEL označevanje (rdeča) in odseki so jih nasprotno z DAPI (modro). Profili iz female glodalcev mlečnih žlez, pridobljen 3~5 po odstavitvi podganjih mladičev (Millipore) je služila kot pozitivno kontrolo. Original povečava: × 200. Dimenzijske barov, 50 um. "R" predstavlja resveratrol, "Ci" pomeni nadzor siRNA, in "Si" predstavlja SIRT1 siRNA
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070627.s001
(IOD)
Slika S2.
rasklapanje od SIRT1 s shRNA lentivirusom. (A) BGC-823 celice smo transfektirali z nadzorom ali SIRT1 posamezne shRNA-lentiviruses. Učinkovitost transfekciji je bila ovrednotena s fluorescenčno mikroskopom. Na multipliciteto infekcij (MOI) 50, je bilo več kot 90% celic transfektiramo s shRNA lentivirusom. Po štirih tednih presejanje z puromicina, so bili vsi živih celic transduciramo. Povečava: x 100, bar za 200 um. (B) Celice požanjemo 4 dni po okužbi in 28 dni po presejanju puromicina. Učinkovitost utišanje SIRT1 je preveril Western Blot
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070627.s002
(IOD)
Tabela S1.
premazi za poskuse RT-qPCR, opravljenih v tej študiji
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070627.s003
(DOC)

• Plos ONE: RhoE Spodbuja metastaze želodčnega raka prek mehanizma Odvisno na povečano ekspresijo CXCR4
• Plos ONE: Mikofenolna kislina zavira migracije in Invazija želodca raka celic prek več molekularnih poteh,