Stomach Health > elodec Zdravje >  > Gastric Cancer > želodčni rak

Plos ONE: neinvaziven Vizualizacija MicroRNA-16 v Chemoresistance želodčnega raka Uporaba sistema Dual Reporter Gene Imaging

Povzetek

MicroRNAs (miRNAs) so bili vpleteni igrati osrednjo vlogo pri razvoju odpornosti na zdravilo v različnih malignih bolezni. Vendar pa so bile številne študije, opravljene na vitro
ravni in ne more zagotoviti vivo
informacije o funkcijah miRNAs v odpornosti na zdravila proti raku. Tukaj smo uvedli dvojni sistem reporter gena za slikanje za noninvasively spremljanje kinetično izraz miRNA-16 med chemoresistance na raka želodca, tako in vitro
in in vivo
. Human natrijev jodid symporter (hNIS) in firefly luciferaza (Fluc) geni so bili povezani, da tvorijo hNIS /Fluc dvojno gen fuzija reporterski in nato ustvari želodčnega raka celična linija človeških NF-3xmir16 in njegovo odpornost proti več zdravilom celična linija NF-3xmir16 /VCR. Radioiodide vnos in Fluc luminescence signali in vitro
povezana tudi z števila živih celic. luciferazne aktivnosti in radioiodide privzema v NF-3xmir16 celicah so izredno zatrta s eksogeno ali endogenega miRNA-16. NF-3xmir16 /VCR celice so pokazale znatno povečanje 131I absorpcije in luminiscenč- intenzivnosti v primerjavi z NF-3xmir16 celic. Radioaktivnost iz in vivo
99mTc-Pertehnetatna slikanje in intenzivnost od bioluminiscenčnega slikanja so se povečale tudi v NF-3xmir16 /VCR v primerjavi s tisto v NF-3xmir16 tumorskih presadkov. Nadalje, uporaba tega reporterski gen sistem, smo ugotovili, da je etoposida (VP-16) in 5-fluorouracil (5-FU) aktivira miRNK-16 ekspresijo vitro
in vivo
in Povecanje Mirna-16 je p38MAPK odvisna, vendar NF-κB neodvisni. Ta dvojni reporterski gen slikanje lahko služil kot novo orodje za in vivo
slikanje microRNAs v chemoresistance raka, kot tudi za zgodnje odkrivanje in diagnosticiranje v kliniki

Navedba. Wang F, Song X, Li X Xin J Wang S Yang W, et al. (2013) neinvazivno Vizualizacija MicroRNA-16 v Chemoresistance želodčnega raka Uporaba Dual reporterski gen Imaging System. PLoS ONE 8 (4): e61792. doi: 10,1371 /journal.pone.0061792

Urednik: Javier S. Castresana, University of Navarra, Španija

Prejeto: 21. november 2012; Sprejeto: 13. marec 2013; Objavljeno: 17. april 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprt s strani programa nacionalne Temeljni raziskovalni in razvojni program Kitajske (973), Grant No. 2012CB518101, 2011CB707702, National Natural Science Foundation Kitajske pod Grant številkami 81090272, 81090274, 81227901, inovacije Team Development Grant, ki ga Kitajska Department. za izobraževanje (2010CXTD01), 863 Program Kitajske (2012AA02A603) in nacionalnega programa za podporo Key tehnologijo pod Grant No. 2012BAI23B06. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi. Soavtor Xiaoyuan Chen služi kot urednik te revije. To ne spremeni pripadnost avtorjev vseh PLoS ONE politike o izmenjavi podatkov in materialov.

Uvod

rak želodca ostaja prvi vodilni vzrok smrti zaradi raka na Kitajskem in četrti najpogostejši malignost po vsem svetu kljub dramatičnim zmanjšanjem njegovega obolevnosti in umrljivosti v zadnjih treh desetletjih [1]. Kemoterapija se pogosto uporablja za zdravljenje tako resektabilne in napredovalega raka želodca, ki vodijo k izboljšanju celokupnega preživetja, kot tudi kakovost življenja bolnikov [2], [3]. Vendar pa je dolgoročna kemoterapija pogosto ne odpravi vse tumorske celice zaradi resnične ali pridobljene odpornosti proti več (MDR), ki je najbolj primarni vzrok tumorja ponovitve [4]. Trenutno je MDR šteje kot multifaktorska pojav, ki vključuje več glavnih mehanizmov, vključno s povečano presnovo zdravil, zmanjšan privzem vodotopnih zdravil, spremenjenih ciljev zdravil, zmanjša znotrajcelično koncentracijo drog s izlivnimi črpalke, spreminjajo kontrolnih točk celičnih ciklov za ustvarjanje izrednih razmer odzivni geni škodovati apoptotičnih poti, etc
[5]. Čeprav so bili mehanizmi MDR temeljito raziskati, ključni dejavniki tega pojava ostajajo večinoma jasno.

MicroRNAs (miRNAs) so nov razred endogenih majhnih nekodirano RNA (19-23 nukleotidov), ki negativno uravnavajo genskih izrazov na post-transkripcijski ravni s popolno ali nepopolno osnovno seznanjanje z neprevedene regije 3 '(UTR) ciljnih mRNA in s tem povzroči mRNA razgradnje ali prevod represijo [6]. Trenutno so v vzponu študije kažejo na obstoj in pomembnost miRNAs v razvoju odpornosti proti raku drog in miRNAs izražanja profiliranje je lahko povezana z razvojem odpornosti na zdravila [7] - [10], kar kaže, da miRNAs posredovano oblika upora drog dodaja še en mehanizem MDR. V naši prejšnji študiji, so poročali, da sta miRNAs, miRNK-15b in miRNK-16, so bili različno izražena v rezistenten proti človeški želodčni rak celične linije SGC7901 /VCR in njegova celična linija starševska SGC7901 [11]. Vendar pa je bila izvedena samo na vitro
ravni in ne more odražati in vivo
informacij o funkcijah miRNAs v odpornosti na zdravila proti raku.

Zadnji napredek tehnik molekularne slikanje omogoča noninvasively vizualizacijo normalnih in nenormalnih celičnih procesov v živih predmetov na molekularnem nivoju, ne pa na anatomsko ravni [12]. Več neinvaziven strategije, kot so uporaba fluorescentni protein, luciferaza reporter gena, nucleolin aptamer ali fluorescentno molekularna svetilnik konjugirano nanodelcev, so bili razviti za spremljanje izražanja vzorcev različnih miRNAs med rakotvornosti Neurogeneza ali myogenesis in vitro
in in vivo
[13] - [16]. Sedanja študija je uvesti neinvazivno metodo za spremljanje miRNA-16 v chemoresistance raka želodca skozi dvojno slikanje reporter genov sistema, v katerem natrijev človek jodid symporter (hNIS) in firefly luciferaza (Fluc) geni so povezane s fuzijskega gena za Bioluminiscenca slikanje in 99mTc-Pertehnetatna slikanje gama kamero in vivo
.

Materiali in metode

Živali

Posebna patogenov brez 8-tedensko -old BALB /c golih miši so bili pridobljeni iz centra Shanghai živali na Kitajskem in gojeni v četrti vojaški Medical University živali center, Kitajska. Vse poskusne živali so bile nastanjene pod posebnimi pogoji, brez patogenov. Protokoli za živali, ki se uporabljajo v tej študiji so bili potrjeni na četrti Military Medical University etični presoji sveta. Vsi postopki so bili izvedeni v skladu s četrtega vojaške Medical University Vodnik za nego in uporabo laboratorijskih živali, ki jih je National Society pripravljene za medicinske raziskave.

Reagenti in protitelesa

Mouse monoklonsko protitelo proti hNIS (ab17795) je bila kupljena od Abcam. Rabbit poliklonsko protitelo, specifično za Bcl-2 je bila kupljena iz Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Bay11-7082 (NF-κB inhibitor) in SB203580 (p38 inhibitor MAPK) so bili pridobljeni iz Beyotime Inštituta za biotehnologijo (Shanghai, Kitajska). Zdravila proti raku, vključno vinkristin (VCR), etopozidom (VP-16), mitomicina C (MMC), cisplatin (CDDP), so 5-fluorouracil (5-FU) in Adriamicin (ADR), kupljene od Wolsen biotehnologijo (Xi'an, Kitajska). lentivirusni plazmid GV260-Fluc-puro je bilo pridobljeno iz Shanghai GeneChem Company (Shanghai, Kitajska). Vse celičnih kultur mediji in v serumu so bile kupljene od Gipco (Grand Island, NY).

Dual reporterski gen plazmid gradnjo

kodiranje zaporedje hNIS gena smo pomnožili s PCR iz plazmida prijazno, ki ga Dr. Weidong Yang (četrti Military Medical University, Kitajska), z uporabo naslednjih primerjev:

hNIS-Fw: 5'-CGGGATCCCGCCACCATGGAGGCCGTGGAGACC-3 '

hNIS-Rev: 5'-CGGGTACCGGTACGAGGTTTGTCTCCTGCTGGTC-3 "

za gradnjo dvojnega izražanja vektor, cDNA hNIS gena je bil vstavljen v BamH
I in Age
sem omejitev encimski območja, lentivirusni vektorja GV260 -Fluc-puro (Shanghai GeneChem, Kitajska), ki kodira gen Fluc pod nadzorom promotorja ubikvitina. Nastala dvojno Konstrukt ekspresije GV260-hNIS /Fluc bila nadalje uporabljena za ustvarjanje GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 plazmida. Tri kopije dopolnilnih sekvence proti miRNA-16 (3xmir16) so po stop kodonom za hNIS /Fluc fuzijskega gena za ustvarjanje GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 (slika 1A) vstavi. Oznaka je bila vstavljena umešana nukleotidno zaporedje podobne dolžine do 3xmir16 tudi 3'UTR hNIS /Fluc fuzijskega gena za pridobitev kontrolnega konstrukt (GV260-hNIS /Fluc-scramble. Dobimo zaporedje 3xmir16 zaporedje ali scramble s kaljenja naslednje oligonukleotidov :

3xmir16-FW: 5'-CGCCAATATTTACGTGCTGCTACGCCAATATTTACGTGCTG-CTACGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3 '

3xmir16-Rev: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCGTAGCAGCACGTAAATAT-TGGCGTAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3'

Scramble-FW: 5 "- TCGTGGCGTCATTTCTTCAGAATCCGTCCTCCCAAGTACT-CAGTGTGCTAATGTCTATCGATACAA-3 '

Scramble-Rev: 5'-TTGTATCGATAGACATTAGCACACTGAGTACTTGGGAGG-ACGGATTCTGAAGAAATGACGCCACGA

želodca kultura rakava celica in stabilno ustvarjanje celično linijo

Human želodčni rak celične linije SGC7901 in njegova multidrug odporna varianta SGC7901 /VCR (vzpostaviti in vzdrževati v našem laboratoriju, kot je prej opisano [11]) smo kultivirali v RPMI-1640 medij z dodatkom 10% fetalnega telečjega seruma in 100 enot penicilina in 100 fig /ml streptomicina (Invitrogen ). Vzdrževati MDR fenotip, vinkristin (s končno koncentracijo 1 ig /ml) dodamo k gojišča za SGC7901 /VCR celic. Če želite ustvariti stabilne celične linije, lentivirusni vektorsko GV260-hNIS /Fluc ali GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 je bila prvič kotransfektiramo v 293T celice z embalaže plazmidov ( Gag, Pol, VSV-g
). Gojišče se je spremenila v 6 h po transfekciji in supernatant, ki vsebujejo lentivirusni je pridelano na 48 h post-transfekciji. Požete Supernatante smo centrifugirali pri 4000 g 10 minut, da Celični naplavin. Zgoščeno virus titriramo na 293T celic. SGC7901 celice in SGC7901 /VCR celice transduciramo z GV260-hNIS /Fluc in GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 virusa oziroma na množico okužbe (MNZ) z dne 10. Nato celice so pregledani s puromicina za 3 tedne in celične kolonije so bile poberejo razširili za naslednji korak poskuse

RNA oligo in transfekciji

miRNA-16 in negativna kontrola (NC) RNA oligo smo sintetizirali (Shanghai GenePharma, Kitajska), s pomočjo naslednjih zaporedij.:

miRNA-16 občutek: 5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3 '

miRNA-16 anti-sense: 5'-CGCCAAUAUUUACGU-GCUGCUA-3'

NC občutek: 5 "-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3 '

NC anti-sense: 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3'

Pred transfekcijo smo celice zasejali SGCC7901 na 1 x 10 5 celic na vdolbino v Sistemu 24-dobro ploščo in raste 24 h. Transfekciji smo izvedli z Lipofectamine 2000 reagentom (Invitrogen) v skladu s protokolom proizvajalca. Vse transfekciji smo izvedli v treh izvodih.

Kvantitativna realnem času PCR (QRT-PCR) Analiza

Celotno RNA smo izolirali iz kultiviranih celic z uporabo TRIzola (Invitrogen). RT je bila izvedena z PrimerScript RT Regent Kit (Takara, Japonska) in qPCR je bila opravljena z Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster mesta, CA) in ABI StepOne Plus Real-time PCR sistem (Applied Biosystems) po protokolu proizvajalca . PCR produkti so bili analizirani na 3% agaroznem gelu. Relativna količina miRNA-16 je normalizirana na U6 snRNA. In relativna višina Fluc bil normaliziran GAPDH gena. Pregib-sprememba za miRNA-16 ali Fluc gena iz poskusa skupine glede na kontrolno skupino je bila izračunana z 2 -ΔΔCt metoda, kjer ΔΔCt = ΔCt eksperiment - nadzor ΔCt in ΔCt = Ct miRNA - Ct U6 ali ΔCt = ct Fluc - ct GAPDH. PCR smo izvedli v treh izvodih. Primerji, ki se uporabljajo za izvornih zanke RT-PCR za pokoj-16, so naslednji:

U6 FW: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 '

U6 Rev: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3 "

miR-16 RT 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGG-ATACGACCGCCAAT-3 '

miR-16 Fw: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3'

miR-16 Rev: 5 "-TGCGTGTCGTGGAGTC-3 '

Fluc-FW: 5'-GGTCCTATGATTATGTCCGGTTATG-3'

Fluc-Rev: 5'-ATGTAGCCATCCATCCTTGTCAAT-3 '

GAPDH-Fw: 5'-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3 '

GAPDH-Rev: 5'-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3'

Western blot analizo

SGC7901 celice smo sprali trikrat s PBS in nato liziramo v hladnem liznega pufra (20 mM NaCl, 200 mM Tris-HCl [pH 7,4], 1 mM fenilmetilsulfonil fluorid, 1% Triton X-100 in 1% aprotinina) 30 minut na ledu. Celične lizate nato centrifugirali pri 12.000 obratih na minuto za 15 minut pri 4 ° C. Supernatant smo zbrali in enake količine proteina bila rešena z 8% SDS-PAGE in prenesli na nitrocelulozne membrane. Membrane inkubiramo pri blokiranju raztopino, ki vsebuje 5% BSA 1 h pri sobni temperaturi, nato pa immunoblotted z navedenimi protitelesi. Imunološko trakovi smo prikazali uporabo okrepljenega kemiluminescenco komplet (Amersham Pharmacia Corp, Piscataway, NJ).

MTT test

Za določitev stopnje rasti NF-prazna, NF-3xmir16 in NF-3xmir16 /VCR celice, so bile te tri vrste celic inokulirali v 96-vdolbinami z istimi številkami (5.000 celic) na vdolbino. V različnih časovnih točkah (24, 48, 72, 96 h), 25 xl 5,0 mg /ml sterilno filtriramo 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5- difenil tetrazolijevega bromida (MTT; Sigma) dodamo v vsako vdolbino. Nezreagiran barvilo smo odstranili po 4 h inkubaciji in netopne kristale formazana raztopili v 100 ul dimetilsulfoksida (DMSO). Absorbanco pri 570 nm (referenčno valovno dolžino, 630 nm) smo merili s Synergy II multimode mikroploščnem bralcu (Biotech Instruments, VT).

Radioaktivni privzem jodida test

Če želite ugotoviti povezavo med jodida privzem in število celic, smo serijo razredčitev celice nacepili v 24-vdolbinami. Po 12 h inkubacije, je preučila raven 131I poraba. Sprejem jodid je bil določen s inkubiranje celic z uravnoteženi solni raztopini 500 ul Hanks '(HBSS), ki vsebuje 0,5% goveji serumski albumin z 37 kBq iz nosilnega brez natrija 131I in 10 mM NaJ 30 minut. Po inkubaciji smo celice dvakrat speremo čimprej z 1 ml ledeno mrzle HBSS pufra. Celice so bile sneti s 200! Li tripsinom in radioaktivnost smo merili s pomočjo y-števec (Perkin-Elmer). Ovrednotiti funkcionalno ekspresijo hNIS v reporterskega gena sistemu, so bile NF-3xmir16 celice zasejali v višini 1 x 10 5 celic na vdolbino v 24-vdolbinami dan pred transfekcijo, nato pa smo transfektirali Mirna-16 in NC oligi . 24 ur kasneje, bi bila poraba jodida merjena kot je opisano zgoraj.

In vitro
Bioluminiscenca slikanje test

Če želite ugotoviti povezavo med luminiscenco signalov in mobilne številke, serija razredčitev celic smo inokulirali v 24-vdolbinami. Po 12 h inkubacije, smo vsako dobro izperemo s fosfatom beffered slanico (PBS). Nato dodamo D-luciferin (Xenogen) pri koncentraciji 0,5 mmol /L tik pred testom. Bioluminiscenca smo merili z IVIS 100 Imaging sistema (Xenogen) in analizirali z različico Dnevna Image programske opreme 2.50 (Xenogen). Ovrednotiti funkcionalno ekspresijo Fluc v reporterskega gena sistemu, so bile NF-3xmir16 celice zasejali v višini 1 x 10 5 celic na vdolbino v 24-vdolbinami dan pred transfekcijo, nato pa smo transfektirali Mirna-16 in NC oligi . 24 ur kasneje, je Bioluminiscenca test meri, kakor je opisano zgoraj.

bioluminiscenčnimi in 99mTc-Pertehnetatna slikanje v golih miših

enakih številk (5 × 10 6 celic) v NF-prazno in NF-3xmir16 ali NF-3xmir16 /VCR in NF-3xmir16 celice, so ksenotransplantirali kožo v levo in desno zadnjo bok vsakega golih miši, kot je navedeno v rezultatih. Bioluminescentno slikanje smo pridobili en dan po injekciji celic. Vse miši smo anestezirali z 2,5% Izofluran plina kisika pri pretoku 1,5 L /min. Vodno raztopino D-luciferine (150 mg /kg telesne mase) smo injicirali perkutano 10 minut pred slikanje. celotnega telesa slike za Fluc signali so bili pridobljeni za 2 min in dnevne programske opreme Image (Xenogen) tekel za pridobitev bioluminiscenčnimi slik. ROI je ročno izbrana preko intenzitete signala. Bioluminiscenca signali so izražene kot fotonov na sekundo na kubični centimeter na sr (str /min /cm 2 /sr) znotraj ROI.

Za jedrsko slikanje, tumor ob miši so intraperitonealno injicira 18,5 MBq o 99mTc-Pertehnetatna na 2weeks po injiciranju celic. 30 minut po injekciji je bila žival postavi v položaj širjenja-leže na postelji SPECT skenerja (Symbia T2 Siemens). Anestezija je bila izvedena z 1% -2% izofluran v 100% O 2 med injiciranjem in slikanje. Vse slike so rekonstruirali z 2-dimenzionalni naročeno-podskupinah pričakovanja največje algoritma. Aktivnost je količinsko z ogledom regije interesov (ROI) v tumorjih in na področju ROI je konstantna za vse jedrske in optičnih slik. Po bioluminiscenčnimi in 99m Tc-Pertehnetatna slikanje, so tumorji zberejo in stehtajo.

Statistična analiza

Rezultati so izraženi kot povprečje ± SD. Podatki prikazujejo primerjavo med obema skupinama so bile ocenjene z uporabo t-test. Primerjave med več kot dvema skupinama so bili ocenjeni s pomočjo analize variance (ANOVA) z ustreznim testiranjem posthoc. P vrednosti. ≪ 0,05, so bile obravnavane statistično značilno

Rezultati

Vzpostavitev želodca raka celičnih linij stabilno izražajo hNIS in Fluc gene

Če želite ustvariti fuzijski reporterski gen (GV260- hNIS /Fluc iz NF-prazna) je hNIS cDNA smo klonirali v vektor lentivirusom (GV260-Fluc-puro) kodira gen Fluc ustvariti fuzijski protein, ki je bil pod kontrolo promotorja ubikvitina. Nato so tri kopije dopolnilnih sekvence proti miRNA-16 (3xmir16) po stop kodonom za hNIS /Fluc fuzijskega gena za ustvarjanje drugega konstrukta vstavljena (GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 iz NS-3xmir16) (slika 1A). je bil dodan je tudi umešana nukleotidno zaporedje podobne dolžine do 3xmir16 na 3'UTR hNIS /Fluc fuzijskega gena za pridobitev kontrolnega konstrukt (GV260-hNIS /Fluc bitki iz NF-žoga). In vitro
Bioluminiscenca slikanje je pokazalo, da je bila Fluc gen aktivnost od NF-praznih celic, podoben tistemu iz NF bitki celic (Slika S1A). Tako smo izbrali NF-prazno konstrukt v nadaljnji študij. Dve celični liniji, MDR človeška želodčni rak celična linija SGC7901 /VCR in njene celične linije starševski SGC7901 so transduciramo z lentivirusom vsebuje NF-prazna ali NF-3xmir16 gen oziroma vzpostaviti tri stabilne celične linije NF-prazno /SGC7901, NF -3xmir16 /SGC7901 in NF-3xmir16 /SGC7901 /VCR (iz NF-prazno, NF-3xmir16 in NF-3xmir16 /VCR). Najprej smo izvedli MTT test za merjenje stopnje rasti teh treh celičnih linij (slika S1B). Potem smo perfomed qPCR metodo za preiskavo integriranih kopije novinar konstruktov v treh celičnih linijah (Slika S1C). In vitro
Bioluminiscenca slikanje (slika 1B) in western blot (slika 1C) je bilo nadalje, da se dokaže uspešno izražanje Fluc in hNIS genov v teh treh celičnih linijah.

Linearnost korelacija Fluc in transgena dejavnosti hNIS s številkami celic vitro

Za oceno transgena dejavnosti Fluc in hNIS v celicah, smo izvedli vitro
Bioluminiscenca slikanje in 131I radioiodide privzema testi v seriji redčenja celičnih linij NF-3xmir16. Kot je prikazano na sliki 1D, po povečanju števila celic, povečano tudi kopičenje luminescence. Ugotovljeno je bilo Bioluminiscenca signali dobro ujema s številkami celic (γ 2 = 0.9990) (slika 1E). Medtem pa je bil 131I poraba povečala tudi z mobilnimi številkami (slika 1F). Poraba radioiodide so opazili tudi v korelaciji (γ 2 = 0,9543) z mobilnimi številkami (Slika 1G). Ker je bila Fluc spojen z hNIS, ki je tudi korelacija med intenzivnostjo bioluminiscenčnega in 131I radioaktivnost je bilo navedeno v celicah v skladu z linearno regresijsko analizo (γ 2 = 0,9339) (slika 1 H).

Potrditev miRNA 16-dejavnosti preko
je reporter gena sistema

da bi preveriti, ali je bil NF-3xmir16 reporter vektor, ki vsebuje miRNA-16 ciljne sekvence zatrta s eksogeno miRNA-16, smo preučiti Fluc in hNIS dejavnost po uvedbi Mirni-16. V primerjavi s celic, transfektiranih s NC oligov so bioluminiscenčnega signala v celicah, transfektiranih s miRNK-16 (slika 2A in 2B) zmanjšala za 35%. In 131I radioiodide privzema v miRNA-16 transfekciji celic je bila približno 70%, da je v transfekciji celic NC z radioaktivno štetjem (slika 2C) količinsko. In dejavnost Fluc in hNIS so v odvisnosti od odmerka (slika S1D-F) se je zmanjšalo. Ti podatki kažejo, da bi se NF-3xmir16 novinar konstrukt prirediti miRNA-16.

Odkrivanje endogenega miRNA-16 izražanja in vitro
in in vivo

za odkrivanje endogene miRNA-16 raven izražanja v želodcu rakavih celic in vitro
, enako število (1 × 10 6) NF-prazna in NF 3xmir16 celic zasejali in nato so bili preučeni dejavnost Fluc in hNIS. Kot je prikazano na sliki 2D in 2E, je Fluc aktivnost, ki izhaja iz NF-3xmir16 celic zmanjšana za približno 50% glede na endogeni miRNA-16 v primerjavi s tisto iz NF-praznih celic. In aktivnost hNIS od NF-3xmir16 celicah se je zmanjšala tudi približno 40% odziv na endogeni miRNA-16 v nasprotju tistemu iz NF-praznih celic (slika 2F). Pomanjkanje zatiranju Fluc ali hNIS dejavnosti, ugotovljenih v NF-praznih celic je v zvezi, da ni bilo Mirna-16 ciljnih območij v NF-prazni konstrukt.

Dvojni slikanje reporterski gen sistem omogočil v vivo
vizualizacija endogenega miRNA-16 izražanja v želodčnih rakavih celic. Enake številke (1 x 10 7) NF-praznih in NF-3xmir16 celice so ksenotransplantirali podkožno v levo in desno zadnjimi boki vsakega golih miši (n = 6) in nato bioluminescentno slikanje in 99mTc-pertehnetata gama slikanje kamere so bili pridobljeni. Kot je prikazano na sliki 2G, intenzivnosti luminiscentne od vsajenega NF-3xmir16 celice so bile približno 55% nižja od tiste od NF-prazne celice, podobno za razliko luciferaze aktivnosti, merjeno vitro
(slika 2D in 2E). Po intraperitonealno injekcijo 99m Tc-pertehnetata na 18,5 MBq, je slikanje z gama kamero izvedli. V nasprotju z NF-prazna tumorjev, ki so pokazale pomembno prevzem 99mTc-Pertehnetatna, NF-3xmir16 tumorji pokazala zanemarljivo vnos (Slika 2H), kar kaže na endogeni miRNA-16 zmanjšala izražanje hNIS. Fiziološka privzema opazili tudi na mestih žleze, želodcu in mehurju, v katerem je hNIS običajno izražen. Regije interesa (ROI) analiza je pokazala, da hNIS aktivnost NF-3xmir16 presadkov znatno zmanjšal v primerjavi s tisto v NF-praznih presadkov (Slika 2H). Po slikanju smo zbrali in pretehtal NF-prazne in NF-3xmir16 tumorje (slika S1G). Rezultati so pokazali, da so imeli enake uteži, je pokazala, da so razlike v jakosti signala v resnici zaradi notranjega miRNA-16 funkcije, vendar ne mobilnih številk.

Vizualizacija izražanja spremembe miRNA-16 v MDR raka želodca celic in vitro
in in vivo

je bila odkrita sprememba izraz miRNA-16 v drog želodčne rakavih celic, odpornih preko
dejavnosti Fluc in hNIS ga Bioluminiscenca slikanje in 131I privzema radioiodide testi. Tako Fluc aktivnosti (slika 3A in 3B) in hNIS aktivnosti (slika 3C) poveča za približno 1,5 krat v NF-3xmir16 /VCR celic v primerjavi s tistimi v 3xmir16 NF-celic, ki kažejo, da je bila miRNK-16 navzdol reguliranih v NF-3xmir16 /VCR celice. Da preverijo rezultate dobljene z reporterskega gena sistem, smo kvantitativno RT-PCR (Q-PCR) izvedemo analizo diferencialne ekspresije miRNA-16 v obeh celičnih linijah. V skladu s podatki sistema reporter genov, Q-PCR je pokazala zmanjšala Mirna-16 stopenj v NF-3xmir16 /VCR v primerjavi z njenim kolegom NF 3xmir16 celice (slika 3D).

Za neinvazivno kvantitativno spremljanje miRNA- 16 razlika izraz v MDR raka želodca celic v vivo
, bioluminescentnega slikanje in 99mTc-Pertehnetatna slikanje gama kamere niso bile izvedene. Bioluminescentno slikanje je pokazala, da so luminescence signali približno 1,7 krat povečanje NF-3xmir16 /VCR presadkov v primerjavi NF-3xmir16 presadkov (Slika 3E), v skladu s povečevanjem luciferazne aktivnosti, merjeno in vitro
(slika 3A in 3B). Injekcija 99m Tc-pertehnetata in pridobitev slikanje gama kamere so pokazali, da je bila bistveno višja akumulacija 99m Tc-pertehnetata opazili NF-3xmir16 /VCR presadkov, kot da je v NF-3xmir16 presadkov. Opazili so tudi fiziološko 99mTc-Pertehnetatna akumulacije v ščitnici, mehur in želodec (Slika 3F). In NF-3xmir16 in NF-3xmir16 /VCR tumorji so imeli enake teže (slika S1H).

VP-16 in 5-FU Povecanje od miRNK-16 ekspresijo noninvasively posnel s sistemom gena dvojno reporterskega

Če želite ugotoviti, ali bi lahko drugi proti raku drog spremeni miRNA-16 profila izraznosti, pet kliničnih zdravila za raka želodca so dodali celice NF-3xmir16 sledi vitro
bioluminiscenčnega slikanje in 131I radioiodide testi. Rezultati so pokazali, da je bila intenziteta luminiscenco (slika 4A in 4B) ali celični privzem jodida (slika 4E) močno zmanjša izpostavljenost VP-16, 5-FU in CDDP, vendar ne MMC in zdravljenje ARS v primerjavi s tistimi nontreated celice.

razlogi za zmanjšano signala opazili v VP-16, 5-FU in zdravljenje CDDP lahko, da so droge aktivirani endogeni miRNA-16 izraz ali zaviral celično rast celo povzroča odmiranje celic. Izključiti slednjo možnost, so pet droge dodan NF-prazna celic, ki ne vsebujejo nobenih miRNA-16 ciljnih mest v konstrukt. vitro
Bioluminiscenca rezultati slikovni pokazali, da je imel VP-16 in 5-FU ne zavira intenzivnost luminiscentne, ker CDDP zmanjšana signal luminiscentno (slika 4C in 4D), kar kaže, da CDDP lahko zavre celično rast, vendar ne aktivira endogeni miRNA-16 izraz. Po drugi strani, MMC in alternativnega reševanja sporov je bilo ugotovljeno, da se nekoliko poveča intenzivnost luminiscentno v obeh NF-3xmir16 in NF-prazne celice (Slika 4A-D), ki lahko izhajajo iz spodbuja celično proliferacijo.

Da bi preverili, miRNA-16 aktivacija sodelovali v proti raku učinkov VP-16 in 5-FU, Q-PCR smo izvedli za določitev stopnje miRNA-16 v NF-3xmir16 celice izpostavljenosti oblikami zdravljenja proti raku drogam. Zato je bila miRNA-16 izraz bistveno molekul po VP-16 ali 5-FU zdravljenja v SGC7901 celic v primerjavi z nezdravljenimi kontrolnimi celic, medtem ko MMC, ADR in CDDP imel majhen učinek na miRNA-16 izražanja (slika 4F).

Povečana Mirna-16 izrazi z VP-16 in 5-FU so vključeni v p38 MAPK vendar NF-κB signalne poti
, se zdi, da

Podobno kot modulacijo, ki kodirajo proteine ​​RNA genov transkripcija miRNA genov ureja več poti signalizaciji. Aktiviranje signalnih poti NF-κB ali MAPK je skupni odziv po citostatikov, [17], [18]. Zato smo predpostavili, da bi lahko Povecanje Mirna-16 je posledica povečanega NF-κB ali MAPK delovanja, ko VP-16 ali zdravljenje 5-FU. Osvetliti vlogo teh signalnih poti v VP-16 in 5-FU-inducirane transaktivacije miRNA-16, smo najprej izmerili intenziteto luminiscentno v 3xmir16 NF-celic v odgovor na VP-16 in 5-FU v prisotnosti ali odsotnosti farmakoloških zaviralcev NF-κB ali p38 MAPK. Zdravljenje celic s posebno NF-κB zaviralcem Bay 11-7082, ni vplivala na luminiscenč- signala v primerjavi s celicami zdravili brez inhibitorjev (Slika S2).

V nasprotju s tem, zdravljenje s posebnim p38 MAPK inhibitor SB203850, izrazito rešil zmanjšanje bioluminiscenco (slika 5A in 5B) ali jodidom privzema (slika 5C), ki ga VP-16 in 5-FU v primerjavi s obdelanih kontrolnih celicah. Za potrditev miRNK-16 raven ekspresije v prisotnosti SB203850, v realnem času PCR smo izvedli in rezultati so pokazali, da je inhibitorna od p38 MAPK drastično zatreti VP-16 in 5-FU inducirano miRNK-16 Povecanje (Slika 5D), kar kaže, da povečana miRNA-16 ekspresija z VP-16 in 5-FU se ukvarja p38 MAPK signalne poti.

Naša predhodna študija je pokazala, da je Bcl-2 protein neposredna tarča gen miRNA-16 pri razvoju MDR v SGC7901 želodčne rakavih celic [11]. Če želite preveriti, ali je Bcl-2 sodeluje pri VP-16 in 5-FU stimulacijo z dne miRNA-16 preko
p38 MAPK poti, smo ugotovili Bcl-2 raven beljakovin po zahodni blot analizo. Kot je prikazano na sliki 5E in 5F, VP-16 in 5-FU znatno zmanjšal nivo protein Bcl-2, za približno 50% v primerjavi z neobdelanimi kontrolnimi celicami v odsotnosti SB203850 s. Ko je zdravljenje skupaj z SB203850, zmanjšanjem Bcl-2 proteina močno oslabljen, kar kaže na pomembnost p38 aktivacije MAPK v VP-16 in 5-FU-inducirane downregulation z Bcl-2 proteina.

in vivo
spremljanje okrepljenega miRNA-16 izražanja, ki ga VP-16 in 5-FU

Za neinvazivno spremljanje okrepljenega miRNA-16 izražanja VP-16 in 5-FU, NF-prazna in NS inducirane -3xmir16 celice smo cepljen na levem in desnem zadnjega uda vsake miši (n = 6) oz. Da bi se izognili Bioluminiscenca signal iz NF-prazna vmešava, da je od NF-3xmir16 v času zdravljenja odvisnosti od drog, različne številke od NF-prazna (1 × 10 5 celic) in NF-3xmir16 (1 × 10 7 celic) smo cepljene. Kot je prikazano na sliki 6, je bil občutno zmanjšala intenzivnost Bioluminiscenca opazili NF-3xmir16 presadkov po VP-16 ali zdravljenje 5-FU v primerjavi s nontreatment. Zlasti pri miših, obdelanih z VP-16, bioluminiscenčnega signal, zmanjšana za približno 40% v NF-3xmir16 ksenograftih ker v NF-praznih presadkov primerjavi obdelamo podobe (slika 6A in 6B) nekoliko večja, prav tako za razliko od intenzivnosti luminiscentne povzročene ga VP-16 in vitro
(slika 4A-D).

Other Languages