Stomach Health > elodec Zdravje >  > Gastric Cancer > želodčni rak

Plos ONE: Odkrivanje Molekularni mehanizem želodca Rak Marker aneksin A4 Cancer Cell širjenju Uporaba eksonu Arrays

Povzetek

Rak želodca je maligna bolezen, ki izhaja iz želodca epitela. Potencialno biomarkerjev za raka želodca je protein aneksin A4 (ANXA4), znotrajcelični Ca 2 + senzor. ANXA4 najdemo predvsem v epitelijskih celic, in je znano, da je vpleten v različnih bioloških procesov, vključno z apoptozo, celični kolesarjenje in antikoagulantov. V zvezi z rakom, je ANXA4-prekomerno opazili raka različnega izvora, vključno želodčnih tumorjev, povezanih s Helicobacter pylori
okužbe . H. pylori
povzroča ANXA4 izražanja in intracelularni [Ca 2 +] i nadmorske višine, in je pomemben dejavnik tveganja za rakotvornost, ki povzroči raka želodca. Kljub tej povezavi, vloga ANXA4 v napredovanje želodčnih tumorjev ostaja nejasna. V tej študiji smo raziskali, ali lahko ANXA4 posredujejo stopnjo rasti celic in ali so nadaljnji signali ANXA4 vpleten v tumorigeneze. Po opazovanju stopnjo rasti celic v realnem času, smo ugotovili, da ANXA4 pospešuje celično proliferacijo. transkripcija gena profil-ANXA4 čezmerno izraženim celicah smo merili in analizirali s človeškimi eksonu nizi. Od teh transkripcijskih podatkov gena, smo pokazali, da čezmernim ANXA4 uravnava gene, ki so znane, da so povezane z rakom, na primer aktivacije hialuronan posredovane gibalnega receptor (RHAMM), AKT, in ciklina-odvisne kinaze 1 (CDK1), kot tudi zatiranje p21. Ureditev teh genov nadalje inducira proliferacijo rakavih celic. Ugotovili smo tudi, Ca 2+ bi lahko urejal prenos nadaljnjih signalov ANXA4. Priporočamo, da ANXA4 sproži signalno kaskado, kar vodi k večji proliferacijo epitelijskih celic, na koncu spodbujanje rakotvornost. Ti rezultati bi zato lahko zagotovi nov vpogled za terapijo raka želodca, in sicer s spremembo ANXA4 dejavnosti

Navedba. Lin LL, Huang HC, Juan HF (2012) Odkrivanje molekularni mehanizem, želodčnega raka Marker aneksin A4 v Cancer Cell širjenju Uporaba eksonu Polja. PLoS ONE 7 (9): e44615. doi: 10,1371 /journal.pone.0044615

Urednik: Eric Y. Chuang, National Taiwan University, Tajvan

Prejeto: 6. junij 2012; Sprejeto: 6. avgust 2012; Objavljeno: 7. september 2012

Copyright: © Lin et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprl National Science sveta Tajvana (NSC 99-2621-B-002-005-MY3, NSC 99-2621-B-010-001-MY3), National Taiwan University Cutting Edge Volan Research Project (10R70602C3) in National Health Research Institute, Tajvan (NHRIEX100-9819PI). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka po vsem svetu in kaže visoko prevalenco v azijske populacije. Čeprav se je incidenca raka želodca se zmanjšuje, na splošno 5-letno preživetje ostaja nizka [1]. Določanju najučinkovitejših želodčne terapije raka in razvoju v zgodnji fazi diagnostična orodja so pomembne strategije v vplivajo na klinične rezultate. Celovita preiskava molekularne mehanizme, ki so osnova želodca rakotvornost lahko zagotovi pomoč pri razvoju uporabnih terapevtskih strategij za zdravljenje te bolezni.

Helicobacter pylori
je želodca patogen in je prevladujoča etiološki dejavnik za želodčne rakotvornost . Približno polovica svetovnega prebivalstva je okužena z H. pylori
, in več kot 60% bolnikov z rakom želodca imeli H. pylori
-positivity [2] [3] [4]. Nedavne študije so pokazale, da je H. pylori
lahko povzročijo tako širjenje želodca rakavih celic in sluznice vnetne odzive [5], [6]. Tako, da se razišče molekularne mehanizme osnovno želodčne rakotvornosti je treba raziskati vlogo in mehanizme za H. pylori
želodčnega rakotvornost.

Annexins so povsod izraženi v večini organizmov, vključno z živali, rastline, glive in protistov. To je povezano z različnimi fiziološke funkcije [7]. Temelji na strukturi njihovega ohranjenega jedrnega področja, so annexins štejejo medceličnega Ca 2+ senzorji in vezavo fosfolipidne proteini. Opazili so jih za spodbujanje trgovine membrane in združevanje mehurčkov v odziv na povečane znotrajceličnih [Ca 2 +] i [8], [9]. Pri ljudeh, niso opazili annexins, da imajo vrsto celičnih funkcij, ki so bili implicitno v citoskeletnim organizaciji, eksocitoze, endocitozo, regulacijo ionskega kanala, vnetja, apoptoza, fibrinolizo in koagulacijo [8]. Annexins se šteje tudi, da sodelujejo pri rak, sladkorna bolezen in vnetje [10]. V zadnjem času je vedno več študij pokazalo, da implicirajo sodelovanje annexins v kancerogenosti, kakor tudi spodbujanje širjenja [11], [12], invazija [13] in metastaze [14], [15]. Vendar pa je razmerje med vsemi člani družine annexins z rakom ni bila značilna.

aneksin A4 (ANXA4) je član annexins družine, povezane s prebavili. To je vidno izražena v epitelijskih celic [16]. Nedavne študije so pokazale, da je ANXA4 šteje potencial želodca biomarker temelji na identifikacijo v tkivih bolnikov z rakom želodca v proteomskimi študijah. Up-regulacijo ANXA4 posebej najdemo v H. pylori
okuženimi tumorske tkiva [17], [18]. Poleg tega so številne študije poročajo razmerje med ANXA4 izražanja in raka. To razmerje je bilo navedeno v trebušne slinavke adenokarcinom [19], jasno karcinoma jajčnikov [20], [21], ledvičnega raka [22], kolorektalnega karcinoma [23] in raka na prostati [24]. V karcinomom ledvičnih celic, up-regulacija ANXA4 sodeluje pri širjenju tumorskih celicah, spodbuja celično migracijo [22]. Pri bolnikih z rakom debelega črevesa, je bila visoka izraz ANXA4 povezana s stopnjo nizko preživetja in so poročali kot potencialni biomarker za tumorsko diagnostiko [23]. Kolikor celične funkcije, lahko ANXA4 povzroči kalcija signalizacijo, antikoagulantno in odpornost na apoptozo [25], [26]. Ti dogodki kažejo, da ima ANXA4 na tumorogeno funkcijo z zakonsko ureditvijo rast celic.

V tej študiji smo želeli osvetliti molekularni mehanizem, s katerim ANXA4 inducira rakotvornost. Da bi to dosegli, smo preverjali stopnjo rasti želodčnih rakavih celic z različnimi stopnjami izraženosti ANXA4. Prav tako smo ocenili transkripcijski izraz profil ANXA4-prekomerno ekspresijo celic in se uporablja EXON matrike za analizo signalizacija na nižji stopnji od ANXA4. Iz teh raziskav smo identificirali 9, povezanih z rakom gene iz ANXA4 nadaljnjim signale s pomočjo baze podatkov Iznajdljivost Pathway Analysis (IPA). Poleg tega smo pokazali, da ANXA4 ureja aktiviranje RHAMM, AKT, CDK1 in zatiranje p21, in zato predlaga, celične poti širjenja orožja za-ANXA4 urejeno.

Rezultati

aktivacijo ANXA4 Spodbuja Cell orožja

smo že poročali, da je ANXA4 prekomerno v H. pylori
okuženih želodca tumorsko tkivo [17]. Da bi še dodatno raziskati odnos med ANXA4 in rakotvornosti smo želeli ugotoviti, ali ANXA4 spodbuja proliferacijo celic. Celice so transfekciji s bodisi celovečerni ANXA4
cDNA za povečanje ANXA4 izražanja ali posebne siRNA naj bi utišali ANXA4 izraz. Po transfekciji smo preverjali stopnjo rasti AGS raka želodca celic z uporabo analize v realnem času celic (RTCA) sistem. Cell številke so bile prikazane kot vrednostjo indeksa celic (CI). Krivulje rasti AGS celice so bile spremenjene naslednje transfekciji. Prevelike količine ANXA4 znatno povečala stopnjo rasti celic v AGS celic v primerjavi s kontrolnimi celicami ( P
< 0,001; slika 1A), medtem ko ANXA4 rasklapanje občutno zmanjšala stopnjo rasti ( P
<0,001; slika 1B). Ti rezultati kažejo, da ima ANXA4 potencial za spodbujanje celične proliferacije.

ANXA4 Poveča izraz membranskih proteinov, RHAMM in LAMP2

Proučili smo tudi razlike v izražanju genov med ANXA4-prekomerno ekspresijo celic in kontrolnih celicah, ki izražajo prazen vektor. Pregledali smo to z uporabo EXON analizo matrike, ki omogoča bolj natančen pregled izražanja na ravni genov z uporabo štirih sond na eksonu, v primerjavi s konvencionalnimi 3 "nizi [27]. Na sliki S1, X
-os parcele razpršenem prikazuje intenzivnost izražanja sonde, merjeno v enem poskusu in Y
os prikazuje intenzivnosti izražanja sonde merijo v drugem poskusu . Ti rezultati kažejo na korelacijo med rezultati obeh poskusov in zato kažejo na skladnost med našimi podvojenih mikromrež. Stopnje izraženosti genov so bili izračunani iz intenzivnosti izmerjenih preko nizov sonde. Na splošno je bilo ugotovljeno, da je bistveno drugačna ( P
< 0,05) izraz 1.052 genov. Med-ANXA4 prekomerno ekspresijo celic in kontrolnih celicah

ANXA4 je vezan protein plazma membrane, zato smo predlagamo, da bi se drugi plazma membranski proteini ureja ANXA4 in se skupaj transducira svoje prodajne signalizacijo. Raziskati signalno transdukcijo s ANXA4 urejeno, smo raziskovali plazemske membrane beljakovine EXON analize matrike. Opazili so sedeminštirideset plazma membranski proteini da imajo ≥ 1,5-kratno spremembo-ANXA4 prekomerno ekspresijo celic (tabela S1). Med njimi,-hialuronan posredovano gibljivost receptor ( HNMR
) je pokazala največje povečanje izražanja (2,4-krat; Tabela S1). Poleg tega je naš Prejšnja študija je pokazala, da ( LAMP2
), lizosomalne marker, celična površinska izraz z dne-lizosomalne povezana membranski protein 2 up-ureja ANXA4 in je vključena v eksocitoze (Slika S2 in datoteke S1) . Tu transkripcije izraz LAMP2
pokazala tudi povečanje izražanja (1,8-krat; Tabela S1), merjeno z analizo ekson diod. V tej študiji je bila ANXA4 prekomerno ali utišani (slika 2A) in se nato analizirajo s imunoblotanju preveriti izražanje beljakovin RHAMM in LAMP2. ANXA4 overexpression povečala izražanje RHAMM (Slika 2B) in LAMP2 (slika 2C), in v skladu s tem je rasklapanje od ANXA4 izražanja znižala na raven njihove izražanja (slika 2B in 2C).

ANXA4 Čezmerno Uravnava Cancer -povezana Gene Expression

smo uporabili baze podatkov iznajdljivost Pathway Analysis (IPA) za izvajanje analize genov funkcijo podatkov o ekson polj in ugotovili, da je 25 od 42 genov, primerni za analizo funkcije omrežja (≥2-krat razlika izraz, t
test, P
< 0,05) (tabela 1). Tri funkcionalne omrežja so bistveno povezano s ANXA4 reguliranih genov. Najbolj tesno povezano omrežje je rak, celični cikel in reproduktivni sistem bolezen
( P
< 0,05; slika 3A) in najvišje uvrščen bolezni ali motenj je rak
( P
< 0,05; slika 3B). Je bilo 9 geni so razvrščene kot povezanih z rakom genov-ANXA4 prekomerno ekspresijo celic, vključno s 7 genov, ki so up-urejena v naših poskusih. Ti geni so evkariontskih prevod začetek faktor 4E ( EIF4E
), sukcinat dehidrogenaze kompleks, podenote C, integralni membranski protein, 15 kDa ( SDHC
), ciklin-odvisne kinaze 1 ( CDK1
), črta v limfocitno levkemijo 2 ( DLEU2
), kromatin spreminjanje protein 5 ( CHMP5
), BREZČASNA interakcije protein ( TIPIN
), PDZ- vezavo kinaze ( PBK
). Horionski somatomammotropin hormon 1 (laktogena placente) ( CSH1
) in interferon, alfa 2 ( IFNA2
) so navzdol ureja ANXA4. Na podlagi naših rezultatov, smo predlagali, da ima ANXA4 funkcijo v inducira proliferacijo celic. Poleg tega, CDK1
in PBK
(slika 3B in tabela 1) so menili, da sodeluje pri modelu ANXA4 orožja indukcijo. Ker je aktivacija CDK1 povezana s širjenjem celic v razvoju v želodcu slad limfoma [28]. Vzajemno aktivacija CDK1 in PBK je že poročali [29]. V tej študiji je up-ureditev CDK1
in PBK
opazili-ANXA4 prekomerno ekspresijo celic je bila potrjena s kvantitativno v realnem času verižne reakcije s polimerazo (QRT-PCR) analiza (Slika S3) .

ANXA4 Uravnava aktiviranje AKT, CDK1 in zatiranju p21

aktivacijo CDK1, ki ga ureja p21, zavira G2 /M fazi aretacije, s čimer se spodbuja mitoze in proliferacijo celic [30 ]. Ugotovljeno je bilo tudi, da akt blokov aktivacijo p21, ki ima za posledico kopičenje v citoplazmo in s tem spodbuja proliferacijo celic [31]. S pomočjo analize imunoblot, smo ugotovili, da čezmernim ANXA4 povečala fosforilacijo serinom 473 na AKT in treonina 161 za CDK1 in zmanjšano izražanje p21 (slika 4A). Poleg tega je rasklapanje od ANXA4 izražanja zmanjšala fosfo-AKT in fosfo-CDK1 in povečano izražanje p21 (slika 4B). Ti podatki kažejo, da so fosfo-AKT, fosfo-CDK1 in p21 ureja ANXA4 in so nižji stopnji signali ANXA4.

Ca 2+ posreduje ANXA4 nadaljnjega signalnega Transdukcija

V rakotvornosti Ca 2+ sodeluje pri povzročanju prenos signala za posredovanje različnih bioloških procesov, vključno z invazijo, širjenje, angiogenezo in metastaze [32]. Ugotovljeno je bilo, da lahko annexins posreduje nekatere fiziološke mehanizme na Ca 2 + -dependent način [9]. V predhodnih študijah, intracelularni [Ca 2 +] i nadmorske višine je bila povzročena s H. pylori
okužba, ki v zameno, up-ureja ANXA4 izraz [17], [33]. Da bi ugotovili, ali je povečanje znotrajceličnih [Ca 2 +] i posreduje prenos nadaljnjih signale iz ANXA4, so AGS celice zdravijo z ionomicina. Ionomicin je Ca 2+ ionofornega in dodamo k medijem kulture v našem AGS celičnem modelu spodbuditi trajno zvišanje znotrajceličnih [Ca 2 +] i [34]. Beljakovinsko izrazi ANXA4, LAMP2, RHAMM, p21, fosfo-AKT in fosfo-CDK1 smo izmerili z analizo imunoblot (slika 5A). Podobno kot pri naših opazovanj ANXA4 prekomerno, povečano [Ca 2 +] Ravni i močno reguliran izraz RHAMM ( P
< 0,01) in fosfo-AKT (Ser 473) ( P
< 0,05) in močno navzdol reguliranim izražanje p21 ( P
< 0,01) (slika 5B). Aktivacija CDK1 se je nekoliko povečala za [Ca 2 +] i nadmorske višine. Vendar pa je imel povišano [Ca 2 +] Ravni i ne vpliva na izražanje ANXA4 in LAMP2. V prejšnji raziskavi, lahko ANXA4 in LAMP2 lokalizirati na plazemske membrane po H. pylori
okužba z znotrajceličnih [Ca 2 +] i nadmorske višine (slika S4 in datoteke S1). Ti rezultati kažejo, da Ca 2+ samo spremeni intracelularno lokacijo ANXA4 in LAMP2, vendar ne ureja njihovo izražanje.

Pogovor

V raziskavah raka, identifikacija biomarkerjev in naknadno pojasnilo njihovega mehanizma delovanja odnosov z tumorigeneze lahko prispeva k razvoju uporabnih diagnostičnih orodij in povzroči optimalnih terapevtskih strategij. V zadnjem času je vedno več študij pokazalo, da so proteini biomarkerjev kandidatke v družini annexins lahko pomembno vlogo pri napredovanju različnimi vrstami raka; na primer, ANXA1 jasne celic raka ledvic, ANXA2 za rakom želodca in debelega črevesja, ANXA4 kolorektalnega raka, ANXA8 za raka dojk, ANXA10 za raka jetrnih celic, ANXA11 za rakom jajčnikov in debelega črevesja [35]. ANXA4, član družine annexins, so opazili, da se prekomerno v želodčnih tumorskih tkiv in je povezano tudi z želodčno povezane z rakom H. pylori
okužba [17]. Poleg tega so opazili tudi drugi annexins družinski član, ANXA2, kot močno izraženi pri raku želodca in je povezana s slabo klinični izid, tako da je potencialni prognostični dejavnik [36]. Če povzamemo, ti rezultati kažejo, vključevanje ANXA4 v tumorigeneze; Vendar pa njegov natančen mehanizem v procesu ostaja nejasno. Da bi še dodatno ocenili celično funkcijo ANXA4 v napredovanje raka želodca, smo raziskovali povezavo med njima, nato pa so pokazale, da lahko ANXA4 urediti, povezanih z rakom gene in širi pot do proliferacije celic.

ta študija, smo ugotovili, da so-karcinogenezo povezana proteini kot RHAMM, AKT, p21, PBK in CDK1 ureja prekomerno ANXA4. Shematska predstavitev ANXA4 induciranih zaključnih signalov, povezanih s celično proliferacijo je prikazano na sliki 6. HNMR
(RHAMM) je onkogena ki je močno izraženi pri številnih raka, vključno z rakom želodca in je vpleten v številne celične procesi, kot so mobilni signalizacijo, celično proliferacijo in tumorigeneze [37], [38].

To so poročali, da RHAMM sproži signalno kaskado, RAS in aktivira AKT [39]. Signalizacijo kaskadni RAS transduces nadaljnjim signale, ki jih aktivira fosfo-AKT skozi fosfoinozitidnih 3-kinaz. To aktiviranje AKT so poročali tudi kot označevalec želodčne napredovanje raka [40]. prej smo poročali, da je H. pylori
okužba je povezana z ANXA4 prekomerno [17]. H. pylori
lahko prinesejo citotoksin povezan gen (CagA) v gostiteljske celice, kar povzroči aktiviranje AKT, in tako spodbujajo celično proliferacijo [41]. Glede na preživetje celic, AKT zavira apoptozo s spodbujanjem NF-κB [42]. Nedavne študije so tudi pokazale, da ANXA4 komunicira z P105 (v NF-κB P50 predhodnimi sestavinami beljakovin) in zavira transkripcijski aktivnost NF-κB inducira anti-apoptotske učinek [25]. Skupaj, te ugotovitve kažejo, da ima ANXA4 pomembno vlogo pri preživetju celic in rast celic.

CDK1-ciklin B1 kompleksi uravnavajo celični cikel G2 /M fazi in so bili prav tako vpleteni v spodbujanju tumorigeneze [43]. Nedavna študija je pokazala, da se poveča ekspresija CDK1 povezana z napredovanjem iz H. pylori
-associated gastritis do sluznice povezana limfnem tkivu limfoma [28]. V tej študiji je bila aktivacija CDK1 navzgor ureja ANXA4. Ti dogodki kažejo, da bi ANXA4 posredovanje signala pot na nižji stopnji, ki vodi do tumorigeneze pri bolnikih z rakom želodca s H. pylori
okužba.

Poleg sodelovanja pri napredovanje raka, ANXA4 je bila povezana tudi z pridobljeno chemoresistance za proti raku drog [44] [45] [46]. V celični liniji paklitaksela odpornim (H460 /T800), ki je ANXA4 ekspresija poveča in lokalizirane v jedru [44]. V očitnem karcinomom celic jajčnika in mezotelioma je ANXA4 izraz povišana in so povezane z odpornostjo na zdravljenje s karboplatinom, in se šteje, da je biološki marker občutljivost za cisplatin [45], [46]. Poleg tega ANXA4 je intracelularni Ca tipalo 2+ in Ca 2+ igra pomembno vlogo pri nevrotoksičnosti in srčnega popuščanja [47], [48]. Nedavne študije so pokazale, da je povečana količina ANXA4 ni povezana le z rakom, ampak tudi Alzheimerjeva bolezen, odpoved srca in celične lezija etanol povzročil [49], [50], [51].

Ca 2+ je potrebno sel sistem tudi za proces celične proliferacije in lahko uravnavajo celični cikel [52], [53]. Ugotovljeno je bilo, da lahko Ca 2+ aktiviranje AKT poti za spodbujanje celic preživetja [54]. V tej študiji smo ugotovili, da so bile izraz RHAMM, fosfo-AKT in zatiranje p21 znatno povečal za [Ca 2 +] i nadmorske višine (slika 5). H. pylori
okužba je povezana s ANXA4 prekomerno in znotrajceličnih [Ca 2 +] i nadmorske višine (slika S4 in vloži S1) [17], [33]. Ti rezultati kažejo, da je H. pylori
okužba lahko povzroči signalizacijo ANXA4 nekaj nižji stopnji, in sicer s spodbujanjem intracelularni [Ca 2 +] i nadmorske višine. Kljub temu pa se lahko mehanizem podrobnosti v procesu zapletena in ostaja nejasna. To bi lahko bila pojasnitev želodca procesa tumorigeneze, ki je podlaga H. pylori
stimulacijo. Skupaj, to dokazi kažejo, da Ca 2+ lahko pomagajo ANXA4 za transducira signalizacijo in spodbujanje tumorigeneze v želodčnih bolnikih s H. pylori
okužba.

Skratka, naši rezultati kažejo, da je utišanje ANXA4 zmanjša proliferacijo epitelijskih celic, medtem ko je njegov čezmernim poveča proliferacijo. Poleg tega ANXA4 povzroča nižji stopnji signale, ki spodbujajo rast celic. Predpostavljamo, da so lahko signali in aktiviranja delitve gostiteljske celice ti nižji stopnji patogeni dogodki v H. pylori
inducirano rakotvornost. V sedanjem kliničnem zdravljenju so bili AKT, p21 in CDK1 uporabimo kot tarčo za proti raku drog. AKT inhibitor Perifosine je oralna proti raku in ima aktivnost proti orožja v različnih tumorskih modelih [55], [56], [57]. Paklitaksel (Taxol) in vinkristin lahko povzroči in povečanje p21 izraz za zmanjšanje G2 /M aretacijo in blok proliferacije celic [58], [59], [60], [61]. Flavopiridol je zaviralec več CDK, vključno CDK1, da inducira apoptozo in anti-angiogenezo [62]. Te študije kažejo, da je mogoče zvišanje ANXA4 pri bolnikih obravnavajo kot tarčo drog za terapijo raka želodca. Uporaba več drog v kombinaciji bi zagotovila bolj učinkovito zdravljenje za blokiranje signalov na poti. Če povzamemo, lahko ta študija omogočila širši vpogled v razvoj terapevtskih strategij za raka želodca.

Materiali in metode

celične linije in kultura Pogoji

Človeški želodec adenokarcinom AGS celice (CRL-1739, ATCC) gojimo v 90% RPMI 1640 medija (Biological Industries, Bet-Haemek, Izrael), ki je bila dopolnjena z 1% penicilin /streptomicin in 10% fetalnega govejega seruma (Biological Industries, Bet-Haemek, Izrael) . Celice smo gojili pri 37 ° C v nadzorovanem navlaženi atmosferi v inkubatorju, ki vsebuje 5% CO 2.

plazmidi in Transfekcije

Celovečerni ANXA4
je bil s PCR pomnožili z uporabo primerska par ANXA4
-F (5 'atataagcttgccaccatggccatggcaaccaaa 3') in ANXA4
-R (5 'gcgcgggaattcttaatcatctcctccaca 3) in ojačanje produkt je bil vstavljen v HindIII /EcoRI mesta v pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA). ANXA4
-specifične siRNA in negativni kontrolni Stealth siRNA (Stealth RNAi ™) so bile kupljene od Invitrogen (Carlsbad, CA, ZDA). Celice smo kultivirali v šestih vdolbinami ali premazanih pokrova zdrsi za 24 h. Celice smo nato prehodno transfekciji s pcDNA 3.1 (+) / ANXA4
(8 mikrogramov za šest vdolbinicami; 0,4 mg /ml za 96-E-plate) ali ANXA4
siRNA (100 pmol za šest vdolbinicami; 10 pmol za 96-E-plošče) z Lipofectamine 2000 (Invitrogen) v skladu z navodili proizvajalca. Učinkovitost ekspresijskega vektorja in siRNA transfekciji smo analizirali z imunoblot. Po transfekciji za 48 ur, je bila odkrita razlika izražanje proteinov in genov

Protitelesa

monoklonska protitelesa miško, ki se uporabljajo v tej študiji, so bili naslednji:. CDK1 P34 (sc-51578) Božičkov Cruz Biotechnology (santa Cruz, CA, ZDA); LAMP2 (ab25631) in RHAMM (ab67003) od Abcam (Cambridge, Velika Britanija); in α-tubulin (T5168) Sigme (Dorset, UK). Zajec poliklonska protitelesa so bili naslednji: ANXA4 (sc-28.827), p21 (sc-397), in pCDK1 P34 (CX 161; sc-101.654) od Santa Cruz Biotechnology; in AKT (9272) in PAKT (Ser473; 9271S). od signalizacijo med celicami tehnologijo (Beverly, MA, ZDA)

imunoblot

Celične lizate smo pripravili iz AGS celic, ki so bile prehodno transficirane z izraz vektorjev pcDNA 3.1 (+) / ANXA4
(8 mikrogramov) ali ANXA4
siRNA (100 pmol). Da se določijo razlike v izražanju proteinov v pogojih visoke znotrajceličnih [Ca 2 +] i, ionomicin (5 uM) dodamo k celicam za 1 h. Da bi preučili učinke inhibicije Akt fosforilacijo, so bile celice stradajo 1.5 ure sledi 48-h transfekciji in smo obdelali s 5 pM inhibitorja AKT VIII v (Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija) za 1 h. Vzorci so bili ločeni z 10% SDS-PAGE in nato prenese na poliviniliden difluorida (PVDF) membrane (Millipore, Billerica, MA, ZDA). Po blokiranje v 5% nemastnim mlekom in tris-pufrom (TBS), ki vsebuje 0,1% Tween 20 (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA) 1 h pri sobni temperaturi z blagim zibanja, so bile uporabljene nasledenje primarna protitelesa: anti-ANXA4 ( 1:1000), anti-p21 (1:500), anti-AKT (1:500), anti-PAKT (Ser473, 1:500), anti-CDK1 (1:1000), anti-pCDK1 (CX 161; 1:500) in anti-RHAMM protitelesa (1:400). Membrane smo inkubirali s sekundarnim kozje anti-mišje IgG protiteles konjugiranih (Sigma) ali kozjega anti-zajca konjugirano IgG (Rockland, Gilbertsville, PA), oz. a-tubulin protitelo (1:4000) smo uporabili kot notranje kontrole. Immunoblots bil razvit z izboljšano chemiluminiscence (ECL), komplet za odkrivanje (Millipore) in vizualizira na X-ray filme. Intenziteta opazovanih pasov je normalizirana intenzivnosti α-tubulina pasu. Denzitometrijska Analiza je bila izvedena z uporabo Kodak 1-D različico Analiza Image programske opreme 3.6 (Kodak, London, Velika Britanija).

Exon Array hibridizacija in analiza

Za študij gene na nižji stopnji iz ANXA4, smo primerjali je gen izraz profili med celicami transficirane z pcDNA3.1 (+) / ANXA4
in kontrolnih celicah, transfektiranih s praznim vektor z uporabo eksonu matriko. Skupno celični RNA je bila ekstrahirana z uporabo TRIzol® reagenta (Invitrogen) in RNA čistost je bila potrjena s spektrofotometrijo (razmerje A260 /A280), kot tudi s kapilarno elektroforezo (Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, ZDA). obdelava RNA in hibridizacije smo izvedli s pomočjo Affymetrix Human Exon 1.0 ST nizi (Affymetrix, Santa Clara, CA, ZDA) po protokolu proizvajalca. Vsak niz ima 28,869 dobro označeni-gene z 764,885 različnimi sondami. Matrika vsebuje približno 26 sond za vsak gen. Affymetrix sonde Nastavi podatki so prikazani na spletni strani NetAffx (http://www.affymetrix.com) [63]. Analiza mikromrež (n = 2 na skupino) je bila izvedena s pomočjo Partek Genomics Suite različice 6.5 (Partek Inc., St Louis, MO, ZDA). Neobdelani podatki (CEL datoteke) smo normalizirali s pomočjo algoritma robusten èipi povprečenja (RMA) in analizirali z t
testov. Analiza delovanja in biološkega mehanizma za različno izraženih genov je bila izvedena z različico iznajdljivost Pathway Analiza programske opreme (IPA) 7,5; je oceno 3 ali nad štelo statistično značilna ( P
< 0,01), za označevanje informacij. Smo predložili podatke matrične z bazo podatkov GEO in serijska številka zapisa je GSE33620.

Kvantitativni PCR v realnem času (QRT-PCR)

podatki ekson zaporedji, pridobljeni z uporabo Partek programske opreme in baza IPA je bilo potrjeno s QRT-PCR. RNA smo izolirali iz AGS celic z uporabo TRIzol® Reagent (Invitrogen) in RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Nemčija) v skladu z navodili proizvajalca. Prvi sklop cDNA sintetiziramo iz vseh mRNA s pomočjo reverzne transkripcije komplet (Invitrogen, Carlsbad, CA). Temeljni premazi (tabela S2) so namenjeni uporabi DNAStar opreme (DNAStar, Inc., Madison, WI, ZDA) in PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank). Izražanje genov je bila izmerjena z uporabo v realnem času sistem PCR Bio-Rad iQ5 odkrivanje z SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, ZDA), in je bil normaliziran GAPDH izražanja.

Cell orožja Vsebnost

AGS celice smo naložili v vsako vdolbino 16-kanalne mikrotitrski E ploščo. Vsak tudi vsebuje mikroelektronskih senzorskih nizi na osnovo za odkrivanje indeks celic (CI). Za transfekcijskih poskusov, po inkubaciji 24 ur, smo AGS celice transfektirali z ekspresijskimi vektorji ali siRNAs za 6 ur in spremljajo za skupno 84 ur. E-plošča je bila nameščena v sistemu v realnem času Cell analizatorja (RTCA) in inkubirali v inkubatorju, ki vsebuje 5% CO 2 pri 37 ° C. Stopnja proliferacije celic je bila predstavljena kot CI, ki je temeljila na električno impedanco, merjena z uporabo sistema xCELLigence (Roche, Mannheim, Nemčija).

Statistična analiza

Podatki so izražene kot povprečje ± standardna deviacija (SD). Razlika med neodvisnimi skupinami smo analizirali s pomočjo t
preizkus neke dvorepe študenta. Pridobljeni podatki iz testu celične proliferacije smo analizirali s Kolmogorov-Smirnov test dva vzorca. A P
vrednost manj kot 0,05 navedeno statistično značilnost.

Podpora Informacije
Slika S1.
Raztreseni parcela intenzivnosti sonde v ponavljajočih EXON matrik poskusih. Intenzivnosti sonda dveh ponovljenih poskusih so bili predstavljeni ločeno na X
-os in Y
-os. Vsaka sonda je bila predstavljena z enim samim piko v razpršenem ploskvi. Ti rezultati so pokazali skladnost v naše dvojnik eksonu polj eksperimentov
doi:. 10,1371 /journal.pone.0044615.s001
(IOD)
Slika S2.
ANXA4 sodeluje pri popravilu membranski plazme, ki jo zaposli exocytotic membrane. Predstavnik pretočno citometrijo analiz pokazala prisotnost LAMP2 v H. pylori
okuženimi celicami. (A) celice, ANXA4 prekomerno ekspresijo smo primerjali z (B) ANXA4
-silenced celice. Rezultati kažejo, da ANXA4 spodbuja LAMP2 ekspresijo na površini H. pylori
okuženimi celicami. ANXA4 overexpression, Over-ANXA4; Nadzor siRNA, siControl; . ANXA4
siRNA, si ANXA4
doi: 10,1371 /journal.pone.0044615.s002
(IOD)
Slika S3.
ANXA4 sproži prenos signala na nižji stopnji. QRT-PCR za ANXA4-čezmerno izraženim AGS celice (črne škatle) je bila izvedena za potrditev podatkov, pridobljenih od EXON nizi (sive škatle). Ravni relativna mRNA za CDK1
in PBK
so bile izmerjene in normalizirana na GAPDH
ravni mRNA
doi:. 10,1371 /journal.pone.0044615.s003
(IOD)
Slika S4.
Znotrajcelične Ca 2+ nadmorske višine, ANXA4 in LAMP2 lokalizacija na H. pylori
okužbe. (A) H. pylori
okuženimi AGS celice so bili naloženi z Fluo-3 /AM za spremljanje znotrajcelično Ca 2+ ravni s pretočno citometrijo. (B) Dinamična lokalizacija ANXA4 v žive celice. Realnem času fluorescence slike prikazujejo lokalizacijo EGFP-ANXA4 v H. pylori
okuženimi AGS in SC-M1 celice (rumena puščica) barvanega z Hoechst 33258. (C) LAMP2 fluorescence na površini H.

Other Languages