Stomach Health > elodec Zdravje >  > Gastric Cancer > želodčni rak

Plos ONE: majhna molekula R1498 kot dobro prenaša in oralno aktiven kinaze za karcinomom jetrnih celic in želodca zdravljenje raka s pomočjo ciljanja angiogenezo in mitoza Poti

Povzetek

Beljakovinski kinaz igrajo pomembno vlogo pri razvoju in napredovanje tumorjev. Veliko inhibitorjev kinaze so vstopili na trg in kažejo obetavne klinične koristi. Tukaj smo poročilo o odkritju nove majhne molekule, dobro prenaša, peroralno delujoč kinaze, R1498, Majorly namenjenih tako angiogenim in mitotičnem poti za zdravljenje karcinomom jetrnih celic (HCC) in rak želodca (GC). Niz biokemičnih in na podlagi celic testi so pokazali, da je cilj kinaza grozd R1498 vključeni Aurora kinaz in VEGFR2 et al. R1498 je pokazala zmerno vitro
zaviranje rasti na plošči tumorskih celic z IC50 območju mikromol. in vivo
anti-tumor učinkovitost R1498 je bila ocenjena na plošči GC in HCC presadkov pri vzporedni primerjavi z drugim zaviralcem multikinazni sorafenibovi. R1498 pokazal večjo učinkovitost in varnost profila nad sorafenibovi v vseh testnih modelih z > 80% zaviranje rasti tumorja in tumorsko regresijo v nekaterih xenogratfts. Terapevtski potencial R1498 je bilo poudarjeno tudi njegove učinkovitosti na tri človeška GC primarnega tumorja, pridobljenih modelov ksenotransplantskih z 10-30% stopnjo tumorja regresije. R1498 je bilo dokazano, da aktivno zavira Aurora A dejavnost in vivo
in zmanjša vaskularizacijo v tumorjih. Poleg tega R1498 predstavil dobro in vivo
izpostavljenosti in terapevtsko okno v študij za ugotavljanje območja farmakokinetičnih in odmerkov. Teze dokazi kažejo, da je R1498 močan, dobro prenaša, peroralno delujoč multitarget kinaze z edinstvenim antiangiogenim in antiproliferacijskega profil in zagotavljajo veliko zaupanje za nadaljnji razvoj za terapijo HCC in GC

Navedba. Zhang C, Wu X, Zhang M Zhu L Zhao R, Xu D, et al. (2013) majhna molekula R1498 kot dobro prenaša in oralno aktiven kinaze za karcinomom jetrnih celic in želodca zdravljenje raka s pomočjo ciljanja angiogenezo in mitoze Poti. PLoS ONE 8 (6): e65264. doi: 10,1371 /journal.pone.0065264

Urednik: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Francija

Prejeto: 22. februar 2013; Sprejeto: 23. april 2013; Objavljeno: 5. junij, 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Blagajnami imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi: Vsi avtorji so zaposleni ali prejšnji zaposleni Roche R & D Center (Kitajska), razen Taiping Chen. , ki je zaposlen v družbi CRO imenom Crown Bioscience Inc Beijing, China. To ne spremeni pripadnost avtorjev vseh PLoS ONE politike o izmenjavi podatkov in materialov.

Uvod

Beljakovinski kinaz služi kot cilj za terapevtski poseg v raka, ki je potrjen in dokazujejo uspešno in široka uporaba inhibitorjev protein kinaze v več raka, bodisi kot samostojno zdravilo ali v kombinaciji režimih. Vendar pa, kot heterogeno bolezen, ki jo zbirnih več genov in ne mutacij z enim kinaze mutant pogon, raka, ki imajo dober odziv na zdravljenje enotnega agenta povzročil so zelo omejene. Poleg tega je pridobljena odpornost tumorjev se lahko hitro izogniti zaradi kemoterapije, nato ponovitve. Kompleks odstopajoča signalizacijo primerov raka privlači razvoj strategij, ki ciljajo na več bioloških poti, pomembnih za tumorsko biologijo, kot jedrskega orožja, metastaz in anti-apoptoze. Ena strategija vključuje racionalnih kombinacij drog. Na primer, kombinacija VEGF usmerjena monoklonsko protitelo z vstopi konvencionalno kemoterapijo dokazala pomembno preživetja prednost dojke, debelega črevesa in pljučnega raka [1]. Druga strategija je, da razvijejo spojine, ki pokrivajo več mehanizme v monoterapiji. Ta pristop ima več potencialnih prednosti pred kombinacijo strategij, vključno enostavnosti razvojno pot, hitrost do trga, in manj prekrivanja stranskih učinkov. Trenutno je zaviralec multikinazni sorafenib uporablja kot prvi liniji zdravljenja napredovale in metastatskega HCC z izboljšanjem časa mediane preživetja od 7,9 meseca (placebo skupini) do 10,7 mesecih [2]. Vendar pa je zdravljenje z rezultati Sorafenib v statistično pomembne, vendar klinično blage, izboljšave v celokupno preživetje, čas do progresije in hitrost nadzor bolezni [3]. Medtem, tradicionalno temelji cisplatin terapija je še vedno pogosto uporablja v kliničnih okoljih za napredne in metastatskega GC. Za HER2 /neu čezmerno izraženim želodčne adenokarcinomov, trastuzumab v kombinaciji s kemoterapijo podaljša mediano celotno preživetje z 11,1 mesecev (kemoterapijo) do 13,8 mesecev [4]. Čeprav je bil companioned diagnostični metodologijo, določenimi s ciljnim zaslon bolnikih, trastuzumab nima aktivnosti v veliki podskupini bolnikov z vzrejo visoko stopnjo HER2 /neu z razlogom, da je treba opredeliti [5]. Glede na visoko umrljivost HCC in GC in tekočih terapevtskih shemah z omejenim izidom, je še vedno veliko neizpolnjenih zdravstvenih potreb za obe vrsti raka.

Angiogeneza terapija temelji raka, vključno z anti-VEGFR-2 protitelesa, majhnih molekul proti VEGFR -2 signalizacijo [6], [7], in VEGFR zdravilo formulirano [8], se je izkazala kot učinkovita strategija za zdravljenje iz več vrst raka. Poleg tega bi se učinkovitost multikinazni inhibitorji sunitiniba sorafeniba delno pripisati VEGF signalizacijo blokiranje [9]. Vendar pa je število bolnikov, so same po sebi odporni ali razvijejo odpornost na anti-antiangiogenim terapijo po več ciklih zdravljenja [10], [11]. Tako se pričakuje, klinična preskušanja, ki združujejo angiogenim zaviralce in zdravil z alternativnim mehanizmom delovanja za izboljšanje učinkovitosti ali premagovanje odpornost na antiangiogenim zdravljenja [12]. To je splošno priznano, da je čezmernim aurora kinaz v različnih raka vključeni v proces tumorigeneze [13], [14]. Aurora kinaze VX-680 je lahko učinkovito zavira rast rakavih celic in vitro
in in vivo
, nato vključeni v klinično preskušanje, kar kaže, da so Aurora kinaz druggable cilji [15] .

glede na zbirnih dokazov za angiogenezo in Aurora kinaz pri bolnikih z rakom in njihove terapevtske vrednosti, dokazanih z biološkimi in malih zaviralcev molekul, smo odkrili inhibitor kinaze, R1498, ki je bistveno vplivala na ključne poti za angiogenezo in mitoza. R1498 je edinstven inhibicije kinaze profil, visoko učinkovitost in dobro farmakokinetičnih in toksikokinetićne profilov, vse to podpirala nadaljnji klinični razvoj.

Materiali in metode

Etika Izjava

Uporaba in oskrbo poskusnih živali je odobril Odbor za institucionalne živali nega in uporabo (IACUC), Roche R & D Center (Kitajska). Crown Bioscience, podjetje CRO storitev zavezuje, da zaščiti zasebnost bolnikov in spremljanje vseh etičnih načel za materiale bolnikov izhaja, zbrane sveže zavrženih vzorcih človeških tumorjev, z IRB (lokalna bolnišnica enakovreden odboru) odobritev in zahteve soglasja bolnikov s. Vse celične linije so bile kupljene iz ATCC, ZDA, ali Shanghai inštituti za biokemijo in biologijo celice, kitajske akademije znanosti

spojine

R1498 (čistost > 98%). Sintetiziramo Roche R & D Center (Kitajska). Za encimske teste in vitro
testi na celični osnovi, R1498 smo raztopili v DMSO kot 0,01 mol /L raztopine. Za študij na živalih, je R1498 raztopimo v 1% Klucel EF /0,1% polisorbat 80 /0,09% metilparaben /0.01% propilparaben vode, rešitev je bila pripravljena na tedenski osnovi. Sorafenib sintetiziramo z Roche R &D Center (Kitajska) in raztopimo v Cremophor EL® /etanola (50:50, Sigma) za pripravo 5 mg /ml osnovne raztopine, folijo zavit in shranjevanje pri sobni temperaturi. Ta raztopina je bila sveže pripravljena vsakih 3 dni. Končne odmerjanje raztopine smo pripravili na dan uporabe tako, da razredčimo osnovno raztopino s sterilizirano vodo.

Cell Lines

Vsi celične linije iz ameriškega tipičnega Collection Center (ATCC) in mobilni banki, Shanghai inštituti za biokemijo in celične biologije, so bile kitajske akademije znanosti ohranja pri 37 ° C s 5% CO 2 navlaženi atmosferi v gojišču priporoči, ki jih prodajalci in izpostavljena in vitro
testi med prehodi 8~15 so bile celične linije za študij na živalih med prehodi 5~10. Human popkovna veno endotelijskih celic (HUVEC), pridobljenega iz Allcells (Emeryville, CA), je bila shranjena v EGM-2 (Lonza, Allendale, NJ) s endotelijskih dodatki za rast celic in 10% fetalnega govejega seruma (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Cell Proliferation Vsebnost

Vsaka celično linijo smo zasejali v 96 vdolbinami tkivne kulture ploščo (Corning, NY) v vnaprej določeno gostoto pri 180 p.L končano srednjo, vezan preko noči in obdelamo s spojino drug 72 h. Nato smo medij zavrgli in nadomestili z 10% CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonska) v popolnem mediju, nato inkubiramo plošče za drugo 2 uri. OG 450 je bila izmerjena z SpectraMAX 190 spektrometra (MDS, Sunnyvale, CA). Ozadje absorbanca OD slepi odšteli od vseh vodnjakov. Potem zaviranje stopnja (IR) je bila določena z naslednjo formulo:. IR (%) = (OD DMSO-OD spojine) /OD DMSO × 100%

V VEGF-inducirane HUVEC proliferacije, so HUVECs suspendirane v 170! Li Egm-2 z 0,5% FBS semeni in inkubirali čez noč. Po celicah priloženih 10 u.l 1 ug /ml rekombinantnega humanega VEGF 165 (R &D sistemi, Minneapolis, MN), dodamo v vsako jamico skupaj z 20 p.l krmnih raztopin, pripravljenih v Egm-2 z 0,5% FBS. Test CCK-8 kot zgoraj je bila uporabljena za določitev preživetja celic.

kinaze Testi

afiniteta R1498 pred 402 kinaz je določena s KINOMEScan® (področje Biosciences, San Diego, CA) in podatki so bili predstavljeni kot vrednosti konstanta disociacije (Kd) [16]. Zaviranje na kinaze Aurora kinaz in VEGFR2 je nadalje označen s Z'-LYTE testih kinaza aktivnost pod ustrezne koncentracije ATP.

HUVEC Tube Formacija Vsebnost

HUVEC cev tvorba test je bil izveden kot že poročali [17]. Na kratko smo Študiie ™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) odtajali pri 4 ° C 3~4 h. 100 ul tekočine Študiie ™ dodamo predhodno ohladili s 96 ter tkiva kulture ploščo in ploščo inkubirali pri 37 ° C, 5% CO 2 navlaženi atmosferi za 1 uro, da se strdi Matrigel ™. HUVECs smo kultivirali v Egm-2 z 0,5% FBS preko noči in zasejali v 90! Li Egm-2 z 0,5% FBS z gostoto 2,2 x 10 5 celic /ml na Matrigel ™ prevlečenega ploščo. Celice smo obdelali s spojino, ali ekvivalentne količine DMSO. Plošča je bila inkubirana pri 37 ° C, 5% CO 2 navlaženi atmosferi 7 ur, potem smo celično morfologijo ujet s fazno kontrastnim mikroskopom (IX71, Olympus, Hamburg, Nemčija).

Western Blot

Celica lizat smo pripravili RIPA pufrom, in kvantitativno določimo z metodo bicinchoninic kisline (BCA) (Pierce, Rockford, IL). Trideset mikrogramov proteina na vzorec smo nanesli na 4~12% NuPAGE® Novex SDS gel (Invitrogen). Protein je bila prenesena s suhim blot napravo iBlot® (Invitrogen) na nitrocelulozne membrane. Po blokiranje nespecifično vezavo s TBS /Tween20 (0,1%) (TBS /T), ki vsebuje 5% mleka brez maščobe za 1 h pri sobni temperaturi smo membrano inkubirali v fosfo-Aurora A (Thr288) (C39D8) zajcev monoklonsko protitelo ( Cell signalizacije tehnologija, CSTij9, Beverly, MA) ali fosfo-histon H3 (Ser10) zajec poliklonsko protitelo (CSTϊ1) (1:1000 v TBS /T, ki vsebuje 3% goveji serumski albumin (BSA), in rahlo stresamo pri 4 ° C preko noči. membranski izperemo s TBS /T trikrat za odstranitev nevezanega protitelesa, nato inkubiramo pri sekundarnih protiteles (HRP-konjugiranimi kozji anti-mišji IgG ali kozje anti-kunčje IgG, 1:10000, KangChen Biotech, Šanghaj, Kitajska) 1 uro pri sobni temperaturi, v tem zaporedju. beljakovine pasovi so vidne tudi z izboljšano kemiluminescenca (ECL) komplet (Pierce, Rockford, IL).

Imunofluorescenčni

Celice posejali v komori drsi so bile določene v 4% paraformaldehida pri sobni temperaturi, nato permeabiliziramo z 0,15% Triton-X100 v TBS in blokirana v 3% BSA v TBS /T. primarno protitelesa (fosfo-Aurora A (Thr288) (SUĵ7), fosfo -Histone H3 (Ser10) (SUϊ1) in MPM2 (anti-fosfo-Ser /Thr-Pro) Millipore-368) smo inkubirali s strani v vlažni komori pri 4 ° C preko noči. Sekundarnih protiteles Alexa Fluor® 488 kozje anti-kunčje IgG (H + L) ali Alexa Fluor® 594 kozji anti-mišji IgG (H + L) (Invitrogen), so bili uporabljeni vsakokrat za eno uro po tem, ko so bili drsi izperemo s TBS temeljito. Potem ko so odstranili nevezane protitelesa, so diapozitivi posušimo in pritrdi z montažno DAKO antifide mediju. Slike so bile posnete z IX71 pod ustreznimi filtri vzbujanja in emisije.

pretočno citometrijo

vsebnost DNA smo merili s FACS-Calibur citometrom (Becton Dickinson, San Jose, CA) in distribucijo celičnega cikla je bila izračunana kot je opisano prej [18].

tubulinu in vitro
polimerizacija Vsebnost

In vitro
tubulin polimerizacije test izvedemo, kot je opisano prej [18 ]

farmakokinetike z enim odmerkom (SDPK) Študija

uporaba in oskrbo poskusnih živali je odobril institucionalno varstvo živali in uporaba odbora, Roche R &. D Center (Kitajska). Moški golih miši (telesna teža: 19 do 24 g) smo uporabili v študiji SDPK. Pred farmakokinetični študiji so živali naključno razdeljene v skupine za vzorčenje (3 živali na časovni točki). Deset dodatnih miši smo uporabili za zbrane plazme slepega za kalibracijskih krivulj. Miši smo postili preko noči, preden oralno dajanje.

Krvne vzorce zberemo s retro-orbitalnega punkcijo v predhodnem odmerku in 0.033, 0.083, 0.25,0.5, 1, 2, 4, 6, 8 in 24 urah po odmerku. Plazemske vzorce in oblikovanje odmerka smo hranili pri -20 ° C, dokler bioanalysis. Sistem za zajemanje podatkov in nadzor so bili ustvarjeni s pomočjo analitik 1.4 programsko opremo ABI Inc. koncentracije v plazmi pod mejo kvantifikacije (LOQ = 1 ng /ml) je bila imenovana za nič. Farmakokinetični Analiza podatkov je bila opravljena s pomočjo neprimerljivih analiz module v WinNonlin Professional V5.2 (Pharsight, ZDA) .The biološka uporabnost je bila izračunana kot F (%) = (odmerek iv × AUC PO (0-∞)) /(odmerek PO × AUC iv (0-∞)) * 100%. Pri podganah, psih in opicah SDPK, smo vzorce krvi, zbrane iz vratne vene punkcijo.

ksenotransplantskih Študija učinkovitosti pri celičnih linij in bolnikov izpeljanega Tumorji

Uporaba in oskrbo poskusnih živali je bil odobren s institucionalno varstvo živali in uporaba odbor, Roche R & D Center (Kitajska). Tumorske celice nacepili v desni bok BALB /C nu /nu
ženski akt miši (5~6 tednov, 16~18 g, pridobljeni iz kitajsko-britanski SIPPR /BK Lab. Živali Ltd, Šanghaj, Kitajska) je optimalna gostota glede na naše in-house validacijski študiji. Potem ko je bila tumor ustanovljena in dosegel 100~150 mm 3, miši je bilo razdeljenih v deset miši na skupino in zdravili v skladu z načrtom. Rast tumorja smo zabeležili trikrat tedensko z merjenjem dolžine (L) in širina (W) s šestilom, in se izračuna kot volumen tumorja (TV, mm 3) = 0,5 * L * W * W (mm) . zaviranje rasti tumorja smo izračunali kot TGI% = (1- (srednji volumen tumorja skupine zdravljenja na prvi dan povprečno volumen tumorja skupine zdravljenja na končni dan) /(srednji volumen tumorja v kontrolni skupini na prvi dan srednji volumen tumorja pri kontrolni skupini na končni dan)) x 100%. je bil opredeljen regresije tumorja posamezne miši. - prostornina tumor na koncu je bil manjši od volumna tumorja, ko se je začel zdravljenje

V človeških primarnih tumorskih modelih, so sveže človeške želodčne tumorske tkiva neposredno vsadi nonobese sladkorno bolezen in huda kombinirana imunska pomanjkanjem (NOD-SCID) miši v 5 ur po operaciji s 5 mm 3 fragmente vzpostaviti osnovne modele tumor ksenotransplantskih. Vsak model tumor je bil preverjen z vsaj tremi zaporednimi in vivo
prehodov dokazati stabilnost prijetje presadka. Tumorji iz rovov 4-7 so subkutano inokulirali z Trocars v desno boki BALB /C nu /nu ženski akt miši (5~6 tednov, 16~18 g). Zdravljenje je začelo, ko je dosegel obseg tumorja 100~150 mm 3. Protokol meritev tumor in operacija je bila enaka kot celične linije izpeljane modelu tumorja.

Imunohistokemija

8 mikrometrov parafin vgrajeni diapozitivi tkivo tumorja, pripravljene iz tumorja in vivo
učinkovitosti študije segrevamo v suhem sušilniku pri 60 ° C 1 uro, nato deparaffinized in hidroliziramo z Leica autostainer XL ST5010 pri sobni temperaturi. Antigen Preiskovalna bila izvedena na 95~99 ° C v citratnem pufru (0,01 M, pH 6,0), ogrevamo z medicinsko mikrovalovni pečici pri 92-98 ° C za 5 minut, nato pa ohladimo na sobno temperaturo. Potem peroksidazo blokiranje reagent (DAKO, DK-2600, Glostrup Danska) je bila uporabljena za pogasiti endogenega peroksidazo. Drsniki inkubiramo pri blokiranju seruma za 20 minut, nato pokrijemo s 100 ml fosfo-Aurora A (Thr288) (C39D8) zajcev mAb (SUij9, 1:200 v TBS /T) ali kunčjega anti-humanega CD31 poliklonska protitelesa ( santa Cruz Biotech, sc-8306, santa Cruz, Kalifornija, ZDA, 1:200 v TBS /T) pri 4 ° C preko noči, nato inkubirali v 100 ml DAKO predstavljate + /HRP, zajec /miš, potem ko je temeljito speremo z TBS. Sto mikro litrov substratom-kromogeni raztopine (DAB) so bili uporabljeni za diapozitive in inkubiramo pri sobni temperaturi 10 minut. Drsniki smo previdno speremo z vodo iz pipe 15 minut. Za nasprotno in dehidracija smo izvedli z XL ST5010 pri sobni temperaturi. Na koncu so bili diapozitivi, vgrajene v Permount zaščitnim sredstvom (Fisher znanstvenega, Miami, FL).

Doza Razpon Iskanje in toksikokinetičnih Študija

Doza območje ugotovitev in toksikokinetične študija je bila izvedena na podganah in Beagle psi, ki temelji na in vitro
metabolitov identifikacijo. Wistar podgane (moški: 3, ženska 3 v vsaki skupini, iz Vital River, Peking, Kitajska) postimo preko noči, nato pa prejeli testne izdelke, kot 0, 6.25, 50 in 100 mg /kg dvakrat na dan na oralno za 14 -dnevno stalno režim. opazovanje gibljivost je bila uporabljena na dnevni podlag, da bi našli največjo tolerantno odmerek za živali. Živali so bile žrtvovane na D14 in po opazovanje toksikologijo so bile izvedene tudi spremembe v telesni teži, kliničnega opazovanja, obdukcijo, hematološko kemijo in hispatologijo. Na dan 1. in 14. dan, so bili vzorci krvi pridobijo preko vratne vene punkcijo iz vseh živali (če je živ, z uporabo EDTA-K2 cevi). Vzorci so bili rahlo zmešamo in damo na zdrobljenega mokrem ledu do centrifugiranja, ki je bila izvedena takoj. Vzorce smo centrifugirali približno 15 minut pri 4 ° C 2700 rpm. Dobljeno plazmo smo ločili, prenesena enoznačno označenih jasnih polipropilenske cevi in ​​takoj zamrznemo po trdni ogljikov dioksid (suhi led), dokler se prenese na približno -80 ° C. Vsaka žival je izkrvaveti na naslednjih časovnih točkah: približno 5 minut, 15 minut, 30 minut, 1, 2, 4, 8 in 24 ur po prvem odmerku na določen dan. Koncentracije drog v plazmi so bile določene z LC-MS /MS. Farmakokinetični Analiza je bila izvedena z WinNonlin programske opreme (različica 5.2, Pharsight Corporation, CA, ZDA), in farmakokinetični parametri so bili izračunani z uporabo Non-kompartmentalnega metodo modela.

Beagle (približno 8-10 mesecev, od Beijing Marshall Biotechnology Co. Ltd, Peking, Kitajska), pa so bili v protokol študije, kot je opisano zgoraj. Vsaka skupina ima en moški in en ženski psa, so odmerki testnega članku: 0, 1, 7,5 in 15 mg /kg. Uporaba in skrb za poskusne živali je odobril institucionalno varstvo živali in uporaba odbora, Roche R &. D Center (Kitajska)

Analiza podatkov in statistika

Independent preizkus t je bila uporabljena za neprekinjeno podatkov analiza in χ2 preizkus je bila uporabljena za kategorične podatke. Podatke smo ocenili kot pomembne, ko so p vrednosti. ≪ 0,05

Rezultati

1. Karakterizacija R1498 kot multikinazni zaviralec,

Pyrazolobenzodiazepine analogni R1498, z odrom, ki temelji na fuziji benzodiazepina in pirazolnega obroča (slika 1A), je bila že prej ugotovil, da je šibka ciklinsko odvisna kinaza 2 (CDK2) inhibitor [19]. Ta molekula je pokazala naravo inhibitor multikinazni ko smo analizirali knjižnico inhibitor kinaze. Profil zaviranje kinaza R1498 (1 uM) je bila značilna po KINOMEScan® pri koncentraciji ATP okoli km vsakega kinaze. Stopnja inhibicije R1498 je več kot 80% proti 39 kinaz od 402 kinaz, vključno 359 divjega tipa kinaz in 43 kinaz mutanti (Slika S1). Disociacije konstante (Kd) za 39 zadetkih kinaz nato določimo, in kinaz s Kd < 0.2 uM bilo prikazano na sliki 1B. Večina potencialnih zadetkov spadajo v družino tirozin kinaze (TK) in AGC družino. Poleg tega je bil Z-LYTE test izvedemo nadaljnje določitve aktivnosti inhibicije kinaza z R1498. Rezultati so pokazali, da so bile IC50s iz R1498 25 ± 6, 67 ± 4, 167 ± 13 nM proti VEGFR2, Aurora kinazo A in B, v tem zaporedju (slika 1C). Nato je bila naša raziskava osredotočena na antiangiogena in anti-mitotićnih poti, ki jih R1498 majorly prizadela.

Panel celičnih linij 16 raka, vključno z najetrih, rak želodca in nazofaringealnega karcinoma celičnih linijah, je bila uporabljena za določitev in vitro
sposobnost za boj proti širjenju R1498. Večina celičnih linij potekajo od azijskih raka, saj so azijske prevladujejo rak naša usmeritev. Hepatokarcinoma in rak želodca celična linija plošča je bila bolj občutljiva na zdravljenje R1498 kot nazofaringealni rak celičnih linij. Skupne povprečne IC50s bila 7,81, 7,55 in 30.07 um, kar ustreza epatocellular karcinom, rak želodca in nazofaringealni karcinom celičnih linij, v tem zaporedju. Občutljivost celičnih linij, pridobljenih iz Azije prebivalstva (BEL-7402, QGY-7701 in QGY-7703) je bila primerljiva z občutljivostjo Hep3B, ki je bila od belcev (slika 1D).

2. R1498 zavira Aurora kinaz in inducira Cell Cycle nalog

Aurora zaviranje kinaza, ki R1498 smo vizualizirali imunofluorescencno v rak celične linije želodca SGC-7901. Neposredni fosforilacija strani fosfo-Aurora kinaza A (T288) in fosfo-histona H3 (S10), so bili uporabljeni za označevanje aktivnosti kinaze Aurora A in B, v tem zaporedju [20], [21]. Fosfo-Ser /CX-Pro Mitotićni protein monoklonsko(MPM2) je bila uporabljena kot mitotičnem označevalec (rdeča) za označevanje mitotićnih celic. Aurora kinaze A (T288) fosforilacija pojavi v centrosome z mitotićnih celic (zelena). Potem ko smo celice zdravljenih s 5 iM MR1498 24 h, Aurora T288 zelena žarišča v mitotićnih celic postala šibkejša ali izginil (slika 2A, zgornja plošča), kar kaže, da je aktivnost Aurora kinaze A znižala na zdravljenje R1498. Fosforilacijo histon H3 (S10) je v glavnem lokalizirana v centromera mitotićnih celic. Potem ko smo celice zdravijo z R1498 je fosfo-histona H3 (S10) močno zmanjšala (zelena). Ta ugotovitev je predlagal, da se dejavnost Aurora kinaze B prav tako padel na zdravljenje R1498. Ti rezultati imunofluorescenco so potrdili zahodni blot. Kot je prikazano na sliki 2B, fosforilacijo fosfo-Aurora kinaze A (T288) in fosfo-histon H3 (S10) zmanjšal v odvisnosti od koncentracije pri akutni obdelavi s R1498.

Zaviranje Aurora kinaz A in B proizvaja različne fenotipske spremembe v celični cikel. Zaviranje Aurora A povzroča celični cikel G2 faze prijetje [22], medtem ko je zaviranje na Aurora kinaze B poročali, da povzroča poliploidija v celicah zaradi endoduplication brez cytokinesis [15]. Potem ko so bile celice zdravljeni z 10 um R1498, tako SGC-7901 (želodčni rak celic) in BEL-7402 (hepatocelični karcinom) je pokazala, G2 /M fazi aretacijo in kopičenje poliploidnih celic. Za BEL-7402, celice distribuirajo v G2 /M fazi povečal s 25,6% na 57,0%, medtem, celice z > 4 vsebnost N DNK povečal z 6,7% na 17,6%. SGC-7901 je bila bolj občutljiva, z G2 /M prebivalcev povečalo z 25,2% na 75,5%, in poliploidne celice povečal z 3,1% na 21,6% (slika 2C). Mikrotubulov stabilizator (npr taksola) in destabilizer (na primer kolhicin) bo povzročila G2 /M fazi aretaciji, kot tudi. Razumeti, ali je R1498 mikrotubulsko ciljno reagent, vitro
tubulin polimerizacijo test je bil izveden. Podatki so pokazali, da R1498 niti stabiliziran niti destabiliziralo mikrotubulov polimerizacije celo pri visokih koncentracijah R1498 (40 uM) in vitro
(slika 2D), kar kaže, da je celični cikel G2 /M prijetje motnje mikrotubulsko citoskeletona ni povzročil. Če povzamemo, ti podatki kažejo, da R1498 zaviral Aurora kinaz A in B v celicah in proizvaja fenotipske spremembe v celicah.

3. R1498 antagonist na angiogenezo napredka Human endotelijskih celic

Angiogeneza je inicializiran z izločanjem angiogensko rastnega faktorja iz tumorskih celic, nato pa endotelijske celice razmnožujejo, selijo in cevi oblika plovil v odgovorih na stimulacijo VEGF. Obravnavati specifičnost R1498 antagonistični rasti endotelijsko celično z VEGF stimulirati so človeške umbilikalne venske endotelne celice (HUVECs) izpostavljene na dveh različnih dražljaje, VEGF in FBS, po zdravljenju R1498 za 72 ur. Pod pogoji gojenja, ki vsebujejo VEGF ali FBS, HUVECs pokazala drugačen odziv na R1498. V IC50s bilo 89 in 2064 nM za VEGF in FBS, oziroma; ti predlagal, da R1498 antagonistično HUVEC rasti z VEGF močnejši kot poganja FBS (slika 3A). V HUVEC oblikovanja cev testu, po 8. izpostavljenosti h do R1498, HUVECs oblikovana manj nedotaknjena cevi očesa kot DMSO tretiranih skupinah (slika 3b). R1498 ni vplival na HUVEC proliferacije v takem stanju obdelave (podatki niso prikazani).

4. R1498 Zavira rast človeških raka presadkov

Farmakokinetične lastnosti pri enkratnem odmerku R1498 leta so bile določene več vrst. Čas je razpolovna doba (T1 /2) in biološka (Oral BA%) podpira nadaljnje učinkovitosti študija v golih miših (tabela S1) z dvakrat dnevno oralno urnik. Panel presadkov, vključno z azijsko raka želodca, najetrih in raka nazofarinksu je bila uporabljena za primerjavo med R1498 in drugega zaviralca multikinazni sorafenibovi (slika 4, tabela S2). Sorafenib je odobren kot prvi liniji zdravljenja za najetrih [2], in je v kliničnem preskušanju kombinatorne terapije napredovalim rakom želodca [23]. Vzporedna primerjava sestavljalo inhibicije rasti tumorja, regresiji in telesne teže sprememb živali z odmerku 25 mg /kg dvakrat na dan na ustno. Pri vseh testiranih presadkov, R1498 pokazalo boljšo stopnjo rasti tumorja inhibicije (TGI%) nad sorafenibovi. Za najetrih je TGI% od R1498 je 10-19% več kot TGI% sorafeniba za raka želodca, 2-12% več kot TGI% sorafeniba. Stopnja regresije tumorja je bil vključen tudi druge terapevtske končno točko. V najetrih plošči so tumorske regresije opazili pri Bel-7402 modelu imel 8/10 (80%) živali regresijo v skupini R1498, medtem ko je imel 1/10 (10%) žival regresijo v sorafenibom skupini (slika 4, BEL-7402) . Za želodca raka plošči MGC-803 in SGC-7901 ksenotransplantati imel isto stopnjo regresije v odgovor na testiranega predmeta: 5/10 (50%) za R1498 in 2/10 (20%), za sorafenibovi (slika 4, SGC -7901 in tabela S2). Na podlagi končne točke učinkovitosti iz vseh 7 preizkušenih modelov, R1498 ima boljšo učinkovitost kot Sorafenib po enakem razporedu zdravljenja. Poleg tega R1498 je pokazala dobro učinkovitost na eni nazofaringealnega karcinoma ksenotransplantata je TGI% od R1498 (90% /kg dvakrat na dan, za oralno 25 mg) je bila boljša kot standard pozorno ciklofosfamidom (60%, vsakih 10 dni, intraperitonealna injekcija) (slika 4, CNE-2). spremembe telesne teže, ki so bile posnete v vseh modelih za primerjavo toksičnosti, je pokazala, da je gola miš pokazala bolj sprejemljiv za R1498 med celotnim zdravljenjem v BEL-7402, SGC-7901 in CNE-2 modelov, čeprav je pridobivanje telesne teže nekoliko zmanjšal v 10 dneh po tem, ko zdravljenje (slika 4, tabela S2). Vendar sorafenib povzročil neprekinjeno kapljo telesno težo živali. Za sorafenibom zdravljeni miško v BEL-7402 in SGC-7901 modelov, odstotek izgube telesne teže presegel 15% na dan prenehanja. Kot je prikazano v tabeli S2, R1498 pokazala manjši vpliv na miško telesne teže kot Sorafenib storil, ki je predlagal, da R1498 potekala boljši profil varnosti.

5. R1498 Down ureja fosforilacijo Aurora A in Vascular Gostota tumorja

fosforilirata Aurora A (T288) in CD31 v tumorjih iz študije učinkovitosti so bili uporabljeni za določitev učinka na-cilju R1498. Masa tumor odvzamejo iz študije BEL-7402 ksenotransplantskih je bil pripravljen v parafin vgrajeni diapozitivi in ​​izpostavljena immunohistochemisty za vizualizacijo angiogenezo kavo človeški CD31 in Aurora kinaza dejavnost marker fosfo-Aurora A (T288). V BEL-7402 tumorjev je CD31 obarvanje skupinah zdravljenja R1498 zmanjšala način odvisnosti od odmerka, ki je predlagal prekrvavitve v tumorjih je bilo zavrto (slika 5A). Dejavnost Aurora kinaze A se je zmanjšala tudi po obdelavi R1498, kar se je odrazilo s šibkejšo obarvanja fosfo-Aurora A (T288) v R1498 zdravljenih tumorjih (slika 5B).

Human primarni želodčni tumor izvira ksenogenskega modela je bila uporabljena za napovedovanje učinkovitosti za klinično prevajanje. Rakastih tkiv treh posameznih bolnikih z rakom želodca so engrafted v miško in ksenotransplantati razmejene različne krivulje rasti in vivo
. V ksenotransplantati pokazala različen vpliv na spremembe v telesni masi gostiteljev. Miši smo obdelali z R1498 (25 mg /kg) za navedeno obdobje, končna TGI% dosegla 73,6 ~ 91,6%, pri regresijskih stopenj 10~30%. omejene spremembe teže telesa je predlagal, da bi tumor ob miši dobro odporna na R1498 (slika 6).

6. R1498 je dobro farmakokinetični profil (PK) in terapevtskim oknom

SDPK je pokazala, da so sprejemljive biološka uporabnost in razpolovni čas lastnosti R1498 med golih miših, podganah in psih (tabela S1). Zbrane jetrni mikrosomi so bile uporabljene za napovedovanje glavnih metabolitov v različnih vrstah. Rat in beagle pes s podobnimi mikrosomov metabolitov človeka so bili uporabljeni v študiji maksimalno tolerantni odmerek (MTD), za določanje terapevtskih med učinkoviti in strupenih izpostavljenosti (tabela S4). Samice in samci podgan je pokazala drugačen odziv na prerasli odmerkov R1498.

Other Languages