Plos ONE: Visoko manoze-Zavezujoča protivirusnih lektinom PFL od Pseudomonas fluorescens Pf0-1 spodbuja Cell Smrt želodca Cancer Cell MKN28 preko interakcije z a2-integrin

Povzetek

Nova anti-HIV lektin družina, ki kaže strogo zavezujoč specifičnost za visoko manozo glikanov je bilo ugotovljeno v nižjih organizmov. Bakterijski orthologue je bila ugotovljena v genomu Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 je kloniran gen kodira domnevnega lektina, izražena v Escherichia coli
in očistimo z enim korak gelsko filtracijo. Glikana paleto pregled rekombinantnega lektin, imenovan PFL, je pokazala, da PFL prednostno priznava visoke manozne glikane z α1-3 Man, ki je bila močno izpostavljena na položaju D2. V nasprotju s tem, da prikrijejo to α1-3 Man z α1-2 Man močno oslabljena interakcij lektin-ogljikovih hidratov. Zmanjšanje terminal disaharid, je bistvenega pomena za PFL veže tudi GlcNAc-GlcNAc visokih manozo glikanov. PFL je pokazala močan anti-virus gripe, aktivnost, tako da zavira vstop virusa v celice v odmerkih z nizko koncentracijo nanomolarnem. Na mikromolarnem koncentracije ali več, PFL pokazala citotoksičnost spremni izgubo celično adhezijo proti človeškega raka želodca MKN28 celic. molekula celične površine, na katero PFL bila vezana sooborjenih z-biotina označene Pfl in identificirani kot integrin α2 s peptidno množično prstnih odtisov uporabo MALDI-TOF. Zanimivo, po zdravljenju z eksogenim Pfl, integrina α2 na celični površini doživel hiter internalizacijo v citoplazmo in nabrali na perinuclear regijo, skupaj z vezanim Pfl. Nastala izguba celice prilepile sproži signalno pot, ki inducirano anoikis podobno celično smrt. Ti dogodki so bili dejansko zavira predobdelavo PFL z mannnan, kar kaže na vpletenost visokih manozo glikanov na PFL-inducirane celične smrti, ki je sprožila PFL-integrinskih interakcij a2

Navedba. Sato Y, Morimoto K, Kubo T, Yanagihara K, Seyama T (2012) visoko manoze-Zavezujoča protivirusnih lektinom PFL s Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 spodbuja Cell Smrt želodca Cancer Cell MKN28 preko interakcije z a2-integrin. PLoS ONE 7 (9): e45922. doi: 10,1371 /journal.pone.0045922

Urednik: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brazil

Prejeto: 7. maj 2012; Sprejeto: 27. avgust 2012; Objavljeno: 20. september 2012

Copyright: © Sato et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta raziskave je podprl delno Grant-in-pomoč za mlade znanstvenike (B) iz japonskega društva za promocijo znanosti (JSP) (število Grant 24790101). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Visoka manozo veže lektini, ki ciljajo na določene glikane na površini virusa so obetavne morebitne virusne-inaktivaciji sredstva, ki bi jih lahko uporabili za preprečevanje in obvladovanje okužb z virusom [1], [2]. Številni lektini, ki specifično prepoznavajo visoke manozne glikane najdemo iz različnih taksonomijo vključno bakterij, alg, rastlin in živali, in nekateri, ki so pokazale, da kažejo aktivnost anti-HIV [3]. Pred kratkim smo ugotovili novo lektinsko družino anti-HIV porazdeljene v nižjih organizmov, vključno z bakterijami, cianobakterij in morskih alg [4]. Ti kažejo skupne značilnosti, kot so zaporedja množenje visoko ohranjenih N-terminalne domene in ekskluzivnih visokih manozo oligosaharidnih priznanj. Nekateri lektini v tej družini, kot cianobakterij OAA iz Oscillatoria agardhii
[4] in rdeče alg ESA-2 s Eucheuma serra
[5], so pokazale, da zavirajo vstop virusa HIV v celice gostitelja z ES _{50s nizke nanomolarnem območju z neposredno vezavo na ovojnico gp120. Poleg tega, rdeče alge lektin KAA-2 s Kappaphycus alvarezii
, ki sodi tudi v tej družini zavira okužbo z različnih sevov virusa gripe v ES 50s nizke ravni nanomolarnem v sev neodvisen način, s pomočjo priznavanje visoke manoze oligosaharida na virusni ovojnici glikoprotein hemaglutinina (HA) [6].}

Poleg močnega protivirusno aktivnost, ESA-2 prikazuje različne biološke aktivnosti, kot so mitogeni dejavnosti za miško in človeških limfocitov in vitro
zaviranje rasti tumorskih celic [7], [8]. Čeprav so biološke lastnosti te lektin družine postaja jasno, lastnosti bakterijskih orthologues iz Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 in Herpetosiphon aurantiacus
treba še pojasniti.

ta študija, smo klonirali orthologue lektinsko gen P. fluorescens
Pf0-1 in kodirani lektin protein (PFL) je bilo izraženo v Escherichia coli
. Funkcionalna PFL smo uspešno očistili z visokim dobitkom in označen v smislu njegovih bioloških aktivnosti, kot protivirusno in protitumorsko aktivnost. Kot je napovedal, intenzivne strukturne podobnosti PFL z drugimi člani tega lektin družine, PFL razstavljeni izključno specifičnost za visoko manoze oligosaharida in močan protivirusno aktivnost proti virusom gripe. Poleg tega PFL povzroča anoikis podobno celično smrt želodca rakave celice MKN28 prek interakcije s celično površinsko integrina a2.

Materiali in metode

Materiali

Stab kultura P. fluorescens
Pf0-1 je velikodušno, ki jih dr Mark W. Silby (University of Massachusetts Dartmouth, ZDA). Virusi gripe in celice pasje ledvične Madin-Darby (MDCK) so velikodušno, ki jih Dr. T. Sakaguchi (Hiroshima University, Japonska): virusi influence gojimo v horioalantoisnih tekočini 10 dni starih kokošjih jajc. MDCK celice gojimo v Dulbeccovem modificiranem Eagle mediju (DMEM), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma in penicilina-streptomicin. Celična linija raka na želodcu, MKN28 je prijazno, ki jih prof Suzuki (Fukušima Medical University, v Fukušimi, Japonska). Celično linijo smo vzdrževali v RPMI-1640 medij (GIBCO, Grand Island, NY), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (FBS, GIBCO), 100 IE /ml penicilina G natrija in 100 mg /ml streptomicin sulfata. Drugo rak želodca celična linija, GCIY, smo kupili od Riken celične banke (Ibaraki, Japonska) in jo vzdržujemo na enak način, kot je opisano zgoraj. Primarni normalna človeška hepatocitov celic (ACBRI 3716) je bila kupljena od DS Pharma Biomedical (Osaka, Japonska) in vzdržuje v CS-C srednje komplet za raziskave (DS Pharma biomedicinske).

hemaglutinacijo Vsebnost

hemaglutinacijo test smo izvedli ob uporabi 2% (v /v) suspenzije-tripsinu zdravljenih kuncev eritrocitov kot je opisano predhodno [9]. Na kratko, je zajec rodu eritrocitov suspenzijo obdelamo z 0,5% tripsinom v slanici in zmes inkubirali pri 37 ° C za 60 minut. Po spiranju s fiziološko raztopino, je bila 2% tripsina zdravljenih eritrocitov suspenzijo pripravimo v raztopini. Hemaglutinacijo aktivnost je bila izražena kot titer, obratne najvišje 2-krat razredčitve, ki kaže pozitivne hemaglutinacijo.

Gene kloniranje in izražanje lektin PFL

genomske DNK iz P. fluorescens
Pf0-1 smo uporabili kot predlogo za kloniranje genov za PFL gena. Pri prvič, oligonukleotid primerski niz, 5'-GGCAGGTCTCCCGAAACTTCAAG-3 'in 5'-AGTCGAACGCCTGAACCTGTTGA-3', ki se hibridizira s gorvodno in dolvodno od PFL kodirni regiji, oziroma so bili uporabljeni, in PCR smo izvedli z uporabo Prime STAR DNA polimerazo (TAKARA). Z ojačeno PCR fragment kot predlogo, je naknadno PCR izvedemo s sprednjim primerjem, 5'-CACCATGTCTAAATACGCAGTGGCA-3 ', ki je imel dodatno sekvenco CACC da ATG startnega kodona gena PFL in povratne primer, 5'-TTACTCTATCTGCCCACGGAAG -3 "(TTA, ki ustreza stop kodon gena RFL). Pomnožene fragmente smo ligirali v pET101 /D-TOPO ekspresijski vektor. Rekombinantni plazmid je spremenila v Escherichia coli
top10 celice (Invitrogen). Dobljene rekombinantne klone smo potrdili, da je pravilna konstrukt sekvenciranje DNA. Funkcionalne klone pretvorijo v Escherichia coli
BL21 Star (DE3) celic za inducibilnih izražanje gena PFL. IPTG s končno koncentracijo 0,8 mM dodamo v transformirani kulturo za induciranje ekspresije PFL. Po 6 h inkubacije pri 37 ° C celice zberemo s centrifugiranjem pri 8000 obratih na minuto za 20 minut.

S čiščenjem lektin PFL

požete bakterijske celice smo ponovno suspendirali v 20 mM fosfatnem pufru ( pH 7,0), ki vsebuje 0,15 M NaCl (PBS) in so bili moten s sonikacijo. Po centrifugiranju pri 8000 obratih na minuto za 20 minut smo alikvot supernatanta podvržemo Superose 12 kolono (GE Healthcare) uravnotežili s PBS. Kolono smo eluirali s PBS pri pretočni hitrosti 0,8 ml /min s strani izokratičnem način. Eluat smo spremljali z absorpcijo pri 280 nm in pregledamo hemaglutinacije aktivnost in zberemo aktivne frakcije.

Molekularna teža Določitev PFL

molekulska masa Pfl bila določena z MALDI-TOF analiza MS z Autoflex masni spektrometer (Bruker, Japonska), po kalibraciji s peptid masa standardni komplet (Bruker, Japonska) z sinapinic kisline kot matrico.

zaporedje DNK analiza

Nukleotidna zaporedja smo določili z metodo terminator dideoksi verige z uporabo BigDye Terminator različica 3.1 cikla sekvenciranje (Applied Biosystems). DNA zaporedja smo izvedli z uporabo ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

glikan niz analiza

PFL je označena z Alexa Fluor 488 v skladu z navodili proizvajalca (Invitrogen, Eugene, OR). Glikana vezavo specifičnost PFL je bila določena z natisnjenih glikana mikromrež (različica 5.0) v skladu s standardnim postopkom za CoreH konzorcija za funkcionalnih Glycomics (CFG) (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp~~HEAD=pobj ). Povprečna relativna fluorescence v ponovitvah šestih je bila izračunana tako v povprečju štiri vrednosti po odstranitvi najvišje in najnižje vrednosti za odpravo nekaterih lažnih zadetkov z zelo visokim ali nizkim točk. V barih napako, predstavljajo standardno napako povprečja (SEM), in% CV je koeficient variacije (SD /povprečno), izračunan kot%.

Anti-Gripa Aktivnost PFL

vitro
aktivnost proti gripi Pfl bila določena z nevtralno rdeče (NR) privzema barvilo testu. Različne koncentracije Pfl bili pripravljeni z DMEM, ki vsebuje 10 mg /ml tripsina v 96 vdolbinami mikroplošče. V vsako vdolbinico smo virus dodamo kot množica okužbe približno 0,001 kužnih delcev na celico. Po inkubaciji pri 37 ° C 48 ur, dodamo 100 ul za NR barvilom (150 ug /ml v DMEM) in nadalje inkubiramo 2 uri. NR barvilo vključena v celice smo ekstrahirali z dodatkom 100 ul za 1% ocetne kisline /50% etanola. Vodnjaki so bile izmerjene pri 540 nm z mikroploščnem čitalniku (1420 multilabel števec, PerkinElmer, MA, ZDA) kot dejavnika preživetja od učinka virus citopatskega.

bil imunofluorescenčni mikroskopija

imunofluorescenco izvedli vizualizirati inhibicije vnosa virusa gripe po PFL. Na kratko smo MDCK celice gojijo v zaščitnega stekla okužene z A /Udorn /72 na množico okužbe približno 0,001 kužnih delcev na celico, v prisotnosti ali odsotnosti 200 nM Pfl v DMEM, ki vsebuje 10 mg /ml tripsina. Po 24 h po okužbi so bile okužene celice določen z 80% acetona v 5 min. Po spiranju s PBS smo celice inkubirali z mišjimi monoklonskimi anti HA protitelesa (HyTest, Turku, Finska) pri 37 ° C 1 uro. Po spiranju s PBS smo celice inkubirali s fluorescein izotiocianatom protitelesa (FITC) označenih s kozji anti-miš IgG (Anticorps Secondaires, Compiegne, Francija), pri 37 ° C 1 uro. Po nadaljnjih PBS spiranju smo celice nameščena uporabo Vectashield s 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) in pod fluorescenčno-mikroskopa (OLYMPUS BX51, Olympus, Japonska) so opazili.

ELISA

Neposredna interakcija PFL z virusno ovojnico glikoprotein HA smo analizirali z uporabo encimsko immnosorbent testom (ELISA). PFL (5 ug /ml) v karbonat pufru (pH 9,6) smo prevlečena s 96 vdolbinicami ELISA plošč (BD bioznanosti, Bedford, MA). Vdolbine smo sprali trikrat s PBS, ki vsebuje 0,1% Tween20 (PBST) in blokirali s 3% posnetega mleka pri 37 ° C 1 uro. Po spiranju s PBST, spreminjanjem koncentracije pripravka gripe cepiva HA (Astellas, Tokio, Japonska), dodamo v vsako vdolbino in inkubiramo pri 37 ° C 1 uro. Po spiranju s PBST, so vdolbinice inkubirana z miško anti-HA monoklonskih protiteles (HyTest) pri 37 ° C 1 uro, čemur sledi inkubacija z hrenova peroksidaza (HRP) označenih s kozji anti-mišji IgG protitelesa (GE Healthcare, UK ) pri 37 ° C za 1 uro. Kasneje 3,3 ", je bil dodan substrat 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MI). Reakcijo smo ustavili z uporabo TMB stop reagenta (Sigma-Aldrich) in absorbanca pri 450 nm smo merili s čitalnikom mikroplošča (1420 multilabel števec, PerkinElmer).

proliferacijo tumorskih celic, ki jih MTS testa

celično proliferacijo smo kvantificirali z običajnim MTS testom z uporabo CellTiter 96 celic testa proliferacije (Promega, Madison, WI). Celice zasejanih na 96 jamicami mikroplošče inkubiramo 72 ur z različnimi koncentracijami Pfl v ustreznem mediju z 10% FBS. Celice smo nato inkubirali z 20 ul iz MTS reagenta za 1 uro pri 37 ° C in merimo z mikroploščnem čitalniku (1420 multilabel nasprotnega, PerkinElmer) pri 490 nm. Učinek kvasa manan na cytotoxity za Pfl določimo z inkubiranjem celic s 5 pM Pfl v prisotnosti različnih koncentracij kvasovk manan v RPMI 1640 z 10% FBS 72 h in viabilnost celic smo izmerili kot je opisano zgoraj.

Izolacija PFL vezave molekule (i) na MKN28 celic

PFL je označena z biotin uporabo označevanja biotin komplet (Dojindo molekularne tehnologije, Japonska) v skladu z navodili proizvajalca. Da konfluentne MKN28 celic na pokrovu listih, Biotinilirana-PFL (200 mikrogramov) je bila dodana in inkubirana 2 uri pri sobni temperaturi. Po spiranju z mrzlo PBS, smo celice postrga in lizirali v 800 ul RIPA pufra (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P40, 0,5% natrijev deoksiholat, zaviralca proteaz koktajla, 0,1% SDS ). Pozneje je bil 100 xl biotin zajemanje avidinom kroglice (Adar Biotech, Izrael), dodamo k celičnega lizata in inkubiran preko noči pri 4 ° C z rahlim mešanjem. Kroglice speremo trikrat s 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. Posnete proteinov na kroglice smo eluirali z 50 ul s SDS-PAGE vzorcev pufrom (62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerol, 1% merkaptoetanola, 0,003% bromfenol modro) za 15 min pri 90 ° C in podvržemo SDS-PAGE. Protein pas specifični za delček zdravljenja PFL je bila analizirana z MALDI-TOF MS po v-gel prebavi z tripsina. Na kratko, so CBB obarvajo beljakovin trakovi izrežemo in razbarvamo z 25 mM amonijev bikarbonat, ki vsebuje 50% acetonitrila. Reduktivno alkilacijo smo izvedli s 50 mM TCEP (tris [2-karboksietil] fosfin) v 25 mM amonijevega bikarbonata, čemur sledi inkubacija z 50 mM iodoacetoamide 1 h. Po dehidraciji z acetonitrilom, je protein v gelu razgradili z 10 ul s TPCK-tripsinom (100 mg /ml) v 50 mM amonijevega bikarbonata. Prebavo čistimo z Zip konici (Millipore, Japonska) in opazil mirno MALDI tarčo. Eden ul raztopine matričnega (α-ciano-4-hydroxycinnapic matrice kisline [Bruker, Japonska] v aceton-etanol [01:02]), nato dodamo na kraju samem. MALDI-TOF MS Analiza je bila izvedena z Autoflex masni spektrometer (Bruker, Japonska), po kalibraciji s peptidno množično standardni komplet (Bruker, Japonska). Masa podatki prstni odtisi peptid iskali s programsko opremo Mascot (Matrix Science, Japonska).

Cellular lokalizacija PFL in integrinskih α2

MKN28 celice smo gojili na coverslips v 6 vdolbinicami . Celice rastejo na coverslips so bili zdravljeni z 30 mg /ml Alexa488 konjugirano-PFL v RPMI 1640 in inkubirali različnih časovnih obdobjih. Po spiranju s PBS, smo celice določen z 80% acetona v 5 min. Po spiranju s PBS smo celice inkubirali z mišjimi monoklonskimi anti-integrina a2 /CD49b protitelesa (R &D Systems, MN), pri 37 ° C 1 uro. Po spiranju s PBS smo celice inkubirali z Alexa568-konjugiranim protitelesom kozji anti-miš IgG (Life Technologies, Japonska) pri 37 ° C 1 uro. Po nadaljnjih PBS spiranju smo celice nameščena uporabo Vectashield z DAPI (Vector Laboratories) in pod konfokalnim laserskega skeniranja mikroskopom so opazili (IX70, Olympus, Japonska). Z uporabo druge želodčni rak celične linije GCIY in normalne človeške hepatocitnih celice ACBRI 3716, so bili pregledani celični lokalizacija integrinskih a2 in Alexa488-PFL na enak način, kot je opisano zgoraj, in opazili pod fluorescenčnim mikroskopom (OLYMPUS BX51). Učinek kvasa manan na celično lokalizacijo PFL in integrin a2 je bil ocenjen kot sledi. Zraščene MKN28 celice rastejo na coverslips v 6 vdolbinami smo obdelali s 20 ug /ml Alexa488-Pfl v RPMI 1640 v prisotnosti ali odsotnosti 700 ug /ml manan kvasa 4 h. Celice so bile določene, vizualizirali z uporabo anti-integrina a2 /CD49b protitelesa, kot je opisano zgoraj, in opazimo pod fluorescenčnem mikroskopu (OLYMPUS BX51). Učinek različnih lektinov na celične lokalizacije integrina a2 bila preučena na podoben način, s inkubiranje MKN28 celic s 20 ug /ml vsake lektin v RPMI 1640 4 h.

Rezultati

molekulsko kloniranje, izražanje in čiščenje PFL

smo že našli genoma p. fluorescens
Pf0-1 vsebuje možno homolog anti-HIV lektin družine, ki je bila pred kratkim našli v nižjih organizmov, vključno z bakterijami, cianobakterij in morskih alg [4]. Na osnovi nukleotidne sekvence hipotetičnega lektin o P. fluorescens
Pf0-1 na bazi podatkov, so oligonukleotidov, ki so izdelani za razširitev gen lektinsko. Domnevni gen lektin je uspešno klonirali s smerno TOPO sistem za kloniranje in kodiranje protein je heterologously izražen v E. coli
BL21 (DE3). Izraženo lektinom protein smo očistili do homogenosti z eno od stopenj gelsko filtracijo na Superose 12 koloni (sl. 1A). Aktivna vrh z hemaglutinacije aktivnostjo dobimo enojno proteinsko pas 13 kDa na SDS-PAGE (sl. 1B). Končno, od 1. legla E. coli
kultura, visok donos prečiščenega lektin (240 mg) je bil pridobljen. Očiščen lektin je bil imenovan za PFL in uporabi za nadaljnji pregled. Molekulska masa PFL (13.883,7), ki ga MALDI-TOF MS določen je bil v soglasju z izračunano maso (13881.1) iz izpeljanega zaporedja aminokislin in da je ocenjena vrednost, ki ga je mobilnost na SDS-PAGE.

sklepal aminokislinska sekvenca od Pfl gojila dve homologne domene, vsaka sestoji iz N- in C-terminalnih polovic z 62% sekvenčne identičnosti med njimi. PFL razstavljena visoko sekvenčno homologijo s cianobakterij lektinom OAA iz Oscillatoria agardhii
, rdeče alge lektin ESA-2 s Eucheuma serra
in bakterij lektin MBHA iz Myxococcus xanthus
(Slika . 2B), ki predstavljajo novo anti-HIV lektinsko družino. Molekulska masa Pfl in OAA bili podobni, 13883,7 in 13924,1, v tem zaporedju, in tako lektini bila sestavljena iz 132 aminokislin. Oba PFL in zračni prostor imajo skupno lastnost v svoji zaporedno podvajanja, ampak zračni prostor prikazuje višjo stopnjo notranje sekvenčne identitete z 75% med večkratnim domen. Nasprotno pa ESA-2 in MBHA so sestavljeni iz štirih tandemsko ponovljenih homolognih domen 67 aminokislin. Stopnje podobnosti OAA, ESA-2 in MBHA z Pfl na svojem N-terminalu odseki (vsaka 132 ostanki) iz aminokislinskih sekvenc je bilo 62,1, 61,4 in 62,1% za identičnih aminokislin oz.

ogljikovih hidratov veže specifičnost PFL

Če želite ugotoviti specifičnost ogljikovih hidratov veže s PFL je glikana array analize opravljene na konzorcija za funkcijsko Glycomics uporabljajo tiskani niz različice 5.0. Od 611 vrst oligosaharidov testiranih PFL (10 ug /ml) je pokazala izključno specifičnost za visoko glikanov manozo tipa, kot je prikazano na sliki. 3. Celotni seznam oligosaharida testirani in rezultati so na voljo na spletni strani (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp).

PFL močno veže na M6 glikana (216 ) in M8 glikana (212), ki sta imeli izpostavljeno α1-3 Človek na D2 roko, s podobnimi stopnjami visokih RFU vrednot, 43471 in 40759, oz. V nasprotju s tem, prikrivanje tega α1-3 Man z α1-2 Man močno oslabljeno interakcijo med PFL in glikanov. To je bilo najbolj razvidno iz primerjave M6 glikanom (216) in M7 glikanom (211), kjer dodatni α1-2 človek na D2 kraku zmanjšano vezavno jakost približno 53%. Podobno je bilo zavezujoče Jakost PFL do M9 glikana (213) zmanjšalo (RFU = 8535) v primerjavi z njegovim kolegom M8 glikana (212), ki nima D2 terminala α1-2 Človek, ki se kaže le 21% od jakosti. Zanimivo je, da odstranitev zmanjšuje terminala disaharid, GlcNAc-GlcNAc visokih manozo glikanov precej drastično zmanjšala PFL zavezujoče. Na primer, je PFL zavezujoča moč skoraj v celoti odpravljena z glikanov 316 in 317, ki nimajo GlcNAc-GlcNAc zaporedje medtem ko so nasprotna glikane 212 in 213, v tem zaporedju, razstavljena veliko večjo moč. Pomen terminala GlcNAc-GlcNAc je nadalje potrdila primerjavo glikanov 217 in 315, čeprav je bil obseg oslabitev PFL-vezavo omejena. Ta lektin je brez monosaharida-vezave vključno manoze. Poleg tega PFL ni interakcijo z Man α1-6 Man (314) in mannotriose (214), ki so sestavine razvejenega odseka visokih manozo glikanov. Pentasaharid jedro N-glikan (50), ki ga PFL ni bila priznana vendar fucosylated kolegom (485) prikaže šibko interakcijo (RFU = 746). Te oligosaharid zavezujoče profili PFL so zelo podobni tistim, OAA, ESA-2 in KAA-2, ki pripadajo nove anti-HIV lektin družine v nižjih organizmov [4] - [6].

Anti- gripe virus dejavnost PFL

virus Anti-gripe aktivnost PFL je bila ocenjena z dvema sevov virusa gripe, A /Udorn /72 (H3N2) in A /Beijing /262/95 (H1N1) vstopanjem na barvanje NR esej. PFL učinkovito blokirana citopatskega efekta obe sevi virusov influence, z ES _{50 let od 19,4 ± 1,5 nM, in 4,5 ± 0,4 nM (sl. 4A). Za potrditev, da PFL inhibira začetni korak vstopa virusa gripe v celicah, smo opazili distribucijo virusnih antigenov v okuženih celicah v prisotnosti ali odsotnosti Pfl uporabo imunofluorescence mikroskopijo. Fig. 4B prikazuje porazdelitev virusnega antigena po 24 h po okužbi z A /Udorn /72 s specifičnim anti-hemaglutinin protitelesa odkrite. PFL učinkovito inhibira vstop virusa gripe v celice ker so virusi lahko prodrejo in pomnožuje v gostiteljskih celic v odsotnosti Pfl. Galaktoza posebno lektinom PNA iz Arachis hypogaea
ni zavirajo vstop virusa v celice. Ti rezultati kažejo na prisotnost visokih manozo glikanov na površini virusa na položaju kritični za vstop virusa v celice. Če želite preveriti, ali bi PFL neposredno vežejo na virusne ovojnice glikoprotein HA, je ELISA test izvedemo s tržno razpoložljivo pripravo cepiva, ki vsebuje HA iz A /California /7/09 (H1N1), A /Victoria /210/09 (H3N2), in B /Brisbane /60/08 kot glavno komponento. Kot je prikazano na sl. 4C, so opazili od odmerka odvisen vezave HA PFL.}

PFL povzroča celično smrt človeške želodčne celice raka MKN28

In vitro
tumorja učinek PFL na želodčni rak celic MKN28 je bila ocenjena s konvencionalnim MTS testom. Kot je prikazano na sliki. 5A (levi panel), PFL pokazala učinek odvisen od odmerka širjenja MKN28 celice. Ob 72 h naknadno PFL zdravljenju, je viabilnost celic znatno zmanjšal v odmerkih od 0,5 mikrometra ali višje. Nasprotno pa pri nizkih odmerkih 0,1-0,3 um, celična proliferacija je nekoliko spodbudila. PFL-inducirano celično smrt MKN28 celic je spremljala izgubo celično adhezijo na dno kulture plošče, kot je prikazano na sliki. 5B, kjer so opazili everted skupek celic kot rjavkasto linij. PFL-inducirano celično smrt je učinkovito inhibirana v prisotnosti kvasa manan, glikoproteina, ki nosi visoke manozne oligosaharide (sl. 5A, desno plošče). To kaže na visoko manozne glikane na MKN28 celic vključujejo v PFL-inducirane signalizacijo celic, ki lahko pripelje do celično smrt. V nasprotju s tem so normalne hepatocitov celice človeka (ACBRI 3716) relativno odporne na zdravljenje PFL primerjavi z MKN28 celic (sl. 5A, leva plošča).

Izolacija PFL-vezave molekule (-e) na človeške želodčne celice raka MKN28

za reševanje molekularni mehanizem, s katerim PFL inducira celično smrt MKN28 celice, celične površinske molekule (s), v katerem PFL vezan so raziskovali. Biotiniliranega PFL bila inkubirana 2 uri pri MKN28 celice in celice lizirali z RIPA pufrom, ki vsebuje 0,1% SDS. molekula celične površine (-i), na katerega biotin-PFL vezan bile sočasno oborimo z avidinom prekritimi kroglice. Proteini ujete v kroglice smo nato eluirali z SDS-PAGE vzorcev pufrom in analizirali na SDS-PAGE (sl. 6A). Čeprav je bilo odkritih več nespecifične trakovi, smo opazili 150 kDa bend, ki posebej zaznati v PFL obdelan del. Ta skupina je nadalje tudi izpostavljeni v-gel prebavo tripsina sledi MALDI-TOF analizo z masno spektrometrijo. pridobljen peptid podatki množičnih Identifikacija materiala (. Slika 6B) smo iskali za bazo podatkov in beljakovin je bila opredeljena kot integrin α2, z verjetnostjo rezultati temeljijo od 57 (p < 0,05).

Cellular lokalizacija eksogeno dodane PFL in integrin α2

vedenja samega PFL in integrin a2 ob zdravljenju z PFL so bile pregledane z uporabo konfokalnega fluorescentni mikroskop. V tem poskusu je fluorescentno markirana PFL (Alexa488-PFL) za sledenje PFL lokalizacije. Alexa488-PFL smo inkubirali s celicami MKN28 za 1, 5 in 24 ur pri odmerkih od 30 ug /ml. Integrin α2 bili odkriti z anti-integrina a2 /CD49b monoklonskega protitelesa, ki mu sledi Alexa568-konjugiranega 2. protitelesa. Zanimivo je, da Alexa488-PFL vezan na površini celice in sproži internalizacijo v citoplazmi v 1 uri (sl. 7). Integrinskih α2, ki je bil predvsem lokalizirana na površini celice v stanju dinamičnega ravnovesja je doživel tudi internalizacijo, in pomembno je, lokalizacija integrin a2 dobro sovpadalo z PFL. Po 5 h inkubacije, so bili tako PFL in integrin α2 co-lokaliziran in nabrali v perinuclear regiji in nadaljnji inkubaciji v bistvu ni spremenil lokacijo obeh proteinov. Zato je verjetno, da ko PFL vezan na integrinskih a2, oba beljakovine niso bile nikoli reciklira nazaj na celični površini. Rapid znotrajcelični trgovina z PFL-integrin a2 kompleksa je prišlo tudi na kolagen I prevlečenih pokrova liste (podatki niso prikazani). Podobno so opazili prerazdelitev integrina a2 po obdelavi z Pfl v drugem želodčni rak celične linije, GCIY, vendar ne v normalnih hepatocitnih celicami, ACBRI 3716 (sl. 8). V ACBRI 3716 celic, internalizacija PFL ni bilo opaziti po možnosti manjše izražanje integrinskih a2 na površini celice.

Sodelovanje visokih manozo glikanov na PFL-integrin interakcijo a2

Če želite preveriti, ali mobilnega prerazporeditev integrinskih a2 s PFL povzročeno lahko nastanejo iz določenega interakcijo PFL z visokimi manozo glikanov na integrinskih a2 molekule, smo ocenili vpliv kvasovk manan na PFL-inducirane integrin a2 internalizacije uporabo MKN28 celice. V odsotnosti kvasa manan, oba proteini doživel pomembno internalizacijo (sl. 9A, zgornje plošče). Nasprotno, v prisotnosti kvasovk manan, PFL ni veže na celični površini in kasnejše intracelularno trgovina z Pfl je povsem odpravljen (sl. 9A, nižji desno). Dogovorom na te ugotovitve, integrina a2 ni spremenila lokalizacije v prisotnosti kvasovke manan (sl. 9A, spodaj levo). Ti rezultati jasno kažejo, da PFL vezan na integrinskih a2 s priznanjem visokih manozo glikanov na integrinskih a2. Da bi še dodatno potrdi zahtevo visokih manozo glikanov za integrinskih a2 prerazporeditev, ki smo jih testirali učinek različnih lektinov na celično lokalizacijo integrin a2. Kot je prikazano na sliki. 9B, drugi lektini z različnimi posebnostmi, kot galaktoza veže PNA od Arachis hypogaea
, fukoze vezavo AOL od Aspergillus oryzae
, sialne kisline vezavo MAM iz Maackia amurensis
D-GlcNAc veže Uda od Kopriva
ni vplivala na lokacijo integrinskih a2. Zanimivo je, da tudi visoko vezavo manozo lektini, kot je enokalična manoza (Man) -binding lektin, GNA iz zvonček
niso pokazali nobene pomembne spremembe na integrinskih a2. V nasprotju z visoko manoza vezavo zelenjavnega lektin ConcanavalinA (cona) izkrivilo dogovor o integrinskih a2 kot PFL storil.

Pogovor

V tej študiji smo ocenili biološko aktivnost nove bakterijske lektin PFL od P. fluorescens
Pf0-1, ki pripada nedavno ugotovljena protitelesa proti virusu HIV lektin družine v nižjih organizmov. Pojav povečanja drog odporna virusa influence, pa tudi pojava visoko patogene seve virusov, kot sta ptičja H5N1 nas je vodilo, da razišče PFL kot novo sredstvo proti gripi. PFL je pokazala močan anti-virus gripe, aktivnost in mehanizem, s katerim PFL zavrla replikacijo virusa je zaviranje v začetni fazi vstopa virusa v celice. To je najbolj verjetno, da PFL izvajal aktivnosti za boj proti gripi s selektivno vezavo na visokih manozo glikanov na virusne ovojnice HA, kot je prikazano v testu ELISA [9]. Pravzaprav je site specific pojav visoko manoze oligosaharida prikazano na območju HA bližini vezavno mesto receptorja [10].

Če želite raziskati anti-tumorski učinek PFL smo zaposlili človeški želodčni rak celična linija MKN28 ki izvira iz zmerno diferenciranega črevesne tipa tumorja. rdeče alge lektin ESA-2, ki pripada isti lektin družine z PFL razstavljene proti tumorjem učinek, tako in vitro
in in vivo
[7], [8]. ESA-2 je protein izpeljan iz užitnih morskih alg in pričakuje izvajati protitumorsko učinek na raka gastrointestinalnega trakta z zaužitjem. Omembe vredno je, da PFL spodbuja celično smrt MKN28 celice, izključno s pomočjo priznanja visokih manozo glikanov na integrin a2 molekule, ki se večinoma nahajajo na površini celic v stanju dinamičnega ravnovesja. Heterodimerna integrini delujejo ne samo kot pritrdišče molekula za pritrditev celic na ustrezen ekstracelularnega matriksa (ECM), ampak tudi kot senzorjev ECM okolje [11].

• Plos ONE: Honokiol povzroča kalpainskega-posredovana glukoza-Predpisane Protein-94 Cepitev in Apoptoza v človeške celice želodca raka in zmanjšuje tumorje Growth
• Vrste raka na želodcu