FGF9 od raka povezana fibroblastov je mogoče posrednik invazije in anti-apoptoze želodca rakavih celic

FGF9 od raka povezana fibroblastov je mogoče posrednik invazije in anti-apoptoze želodca rakavih celic
Abstract
Ozadje
raka povezano fibroblastov (KGZS), ki prebivajo okoli tumorskih celic, so predlagali, da igrajo ključno vlogo pri napredovanju tumorja. Tukaj smo izvedli mikromrež analize primerjati gen profile izražanja med KGZS in ne-rakavih želodca fibroblastov (NGFs) iz pacienta z rakom želodca in ugotovila, da je rast fibroblastov faktor 9
(FGF9
) je nov rastni faktor izraženi pri KGZS. Nato smo pregledali biološke učinke FGF9 med napredovanje raka želodca.
metod
Izražanje FGF9 v KGZS in NGFs, in njihovih izloča proizvode, so bile pregledane Western blot. Učinki FGF9 na letnem pregledu rasti in MKN28 raka želodca celic v smislu širjenja, invazije in anti-apoptoze ocenil WST-1 testom, invazijo komorni testom in FACS oz. Poleg tega je bila znotrajcelično signalizacijo, s katero FGF9 doseže svoj biološko vlogo preučiti in vitro
.
Rezultati
FGF9 je močno izražen v KGZS v primerjavi z NGFs, združljivo s podatki mikromrež kaže, da je bil FGF9 roman rast dejavnik izraženi pri KGZS. Zdravljenje z FGF9 spodbujati invazijo in anti-apoptoze preko aktivacije signalne poti ERK in Akt za AGS in MKN28 celic, medtem ko so ti učinki oslabljen z obdelavo z anti-FGF9 nevtralizirajočih protiteles. Poleg tega je zdravljenje FGF9 bistveno izboljšane izražanje MMP 7 (MMP7) v obeh celičnih linijah.
Sklepi
FGF9 je mogoče posrednika, ki ga KGZS, ki promovira anti-apoptozo in invazivno sposobnost želodčne rakave celice izločajo.
Ključne besede
FGF raka povezana fibroblastov Invasion Anti-apoptoza ERK Akt rak želodca Ozadje
nastanek rakavih poškodb je tesno povezana s svojo edinstveno mikrookolja. Napredovanje je tesno povezana z zmožnostjo rakavih celic, da se zaposlijo in aktivirati okoliških stromalne celice, in jih nato izkoriščajo [1]. Rak, ki obkroža stromalni celice, kot so fibroblasti, endotelijskih celic in imunskih celic, lahko Orkestrirati tumorigeneze in metastaz pomočjo interakcije celica-do-celice in /ali proizvodnjo topnih rastnih faktorjev /citokinov /kemokinov [1-3]. V tem kontekstu so fibroblasti v rakastih poškodb znana kot, povezani z rakom fibroblaste (KGZS) in so prejeli veliko pozornosti v zvezi z njihovo vlogo pri napredovanja tumorja [4,5]. Čeprav KGZS znano, da se v veliki meri razlikujejo od normalnih fibroblastov v ne-neoplastičnih tkiv v smislu njihovega genskega profila mehanizem, s katerim KGZS spodbujajo napredovanje tumorja ni jasen. Zato smo primerjali izražanje genov profile iz KGZS, s poudarkom na rastnih faktorjev /citokinov /kemokinov, s tistimi, ki niso rakavih želodca fibroblastov (NGFs) z uporabo mikromrež testom in nato izoliran fibroblastni rastni faktor 9
(FGF9
) kot nov gen, ki je bila močno izraženi pri KGZS raka želodca.
FGF9, sekretornega proteina družine FGF, se po navedbah izražena v stromalnih celic, vključno fibroblasti [6-8]. Na splošno velja, FGF signalizacijo poteka preko FGF-ja receptorjev (FGFRs) urediti vrsto bioloških obnašanja celic, vključno s proliferacijo, preživetje in gibljivosti [9], in izražanja FGF9, FGFR2c, FGFR3b in FGFR3c je bila odkrita v želodca in debelega črevesa raka [10]. Tako kot drugi FGF družine proteinov, lahko FGF9 igrajo ključno vlogo pri interakciji med rakavimi celicami in v njihovi okolici stromalnih celic, zato je treba omeniti, da je FGF9 močno izražen v KGZS pri bolnikih z rakom želodca. V tej študiji smo pregledani za razlike v izražanju genov med KGZS in NGFs iz bolnika z rakom želodca. Preučili smo vpliv FGF9 na jedrskega orožja, invazijo in anti-apoptozo želodca rakavih celic, poleg tega razjasniti znotrajcelično signalizacijo, s katero FGF9 doseže svoj biološki učinek na želodcu rakavih celic.
metod
Reagenti in celične kulture
Human rekombinantni FGF9 in FGF9 nevtralizirajočih protiteles proti humanemu so bile kupljene pri R & D Systems (Minneapolis, MN, ZDA). Anti-zunajcelični signal regulira protein kinaza (ERK), anti-fosfo-specifična ERK (p-ERK), anti-Akt, anti-fosfo-specifična Akt (p-Akt, Ser473), in anti-β-aktin protitelesa so bila kupili od signalizacijo med celicami tehnologijo (Beverly, MA, ZDA)
želodca rakave celične linije AGS je kultivirani v Ham je F-12 medij (Sigma, Aurora, Ohio, ZDA), z 10% fetalnega govejega seruma (FBS,. Biowest, Nuaille, Francija) v navlaženem inkubatorju pri 37 ° C z atmosferi 5% CO 2. Podobno MKN28 je kultivirali v RPMI 1640 mediju z 10% fetalnega govejega seruma in pet drugih želodčni rak celičnih linij MKN1, MKN 45, MKN74, GCIY in KATOIII smo vzdrževali kot je opisano predhodno [11].
Izolacija in kultura človekovih želodca fibroblasti
človekove raka želodca (slabo diferencirani adenokarcinom) vzorci so bili pridobljeni iz bolnika, ki je prestal želodca na Hyogo College Hospital medicino v 2012. rak povezano fibroblaste (KGZS) so bili pripravljeni iz rakasto dela v želodcu. Non-rakave želodca fibroblaste (NGFs) smo pripravili iz ne-rakavo odseka z atrofičnega gastritisa najmanj 50 mm daleč od tumorja na želodcu. Vzorce tkiva je bilo očistiti maščobe in nekrotičnega tkiva, mleto s skalpeli in sprali v PBS, ki vsebuje antibiotik-antimikotik reagenta (Anti-Anti®, GIBCO). kosi tkiva smo prenesli v 12-tudi mikroplo (Iwaki, Tokio, Japonska) na enem fragmentu /dobro. Celice smo kultivirali v DMEM mediju (Gibco, Grand Island, NY, ZDA) z 10% toplotno inaktiviran FBS pri 37 ° C v atmosferi 5% CO2. V fibroblasti, ki je prvotno rasle v enoplastni so bili zbrani, prenese na drugo posodo in se uporabljajo za poskuse v 10. prehoda. Te študije so bile izvedene z odobritvijo Pregled sveta Hyogo College of Medicine, privolitev je bila pridobljena iz bolnika.
Analizo mikromrež
Uporaba TRIzola reagenta (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), je bila skupna RNA pridobljeni iz treh sklopov KGZS in NGFs kulturi. Označevanje cDNA, hibridizacije, skeniranje in analizo podatkov je bila izvedena v Hokkaido sistema Science Co, Ltd (Sapporo, Japonska). Na kratko, cianinsko-3 (Cy3) označenega Črna je bila pripravljena iz skupno RNA (0,05 ug) z uporabo nizkih vložkih Quick Amp Označevanje Kit (Agilent) v skladu z navodili proizvajalca, ki mu sledi RNAeasy čiščenje stolpcu (QIAGEN, Valencia, CA) . Dye vključitev in Črna pridelek so preverili z NanoDrop ND-1000 spektrometra. Cy3 označene Črna (0,60 ug) je bil razdeljen na 60 ° C za 30 minut v reakcijskem volumnu 25 ul vsebujejo 1x Agilent fragmentacije blažilnik in 2x Agilent blokiranje sredstvo v skladu z navodili proizvajalca. Po zaključku reakcije razdrobljenosti bil 25 ul z 2x Agilent hibridizacijskega pufra dodamo k zmesi razdrobljenost in hibridizirali Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression mikromrežnem (8x60K ver.2.0) za 17 ur pri 65 ° C v vrteči se Agilent hibridizacijskega pečici. Po hibridizaciji so mikromrež izperemo za 1 min pri sobni temperaturi z GE Wash Buffer 1 (Agilent) in 1 minuto pri 37 ° C z GE Wash pufrom 2 (Agilent), nato pa takoj posušimo s kratkotrajnim centrifugiranjem. Ploščice smo pregledane, takoj po pranju na Agilent DNA Mikromrežni Scanner (G2565CA) z eno barvno skeniranje nastavitev za 8x60K polj diapozitive (Scan Area 61 x 21,6 mm, Ločljivost skeniranja 3Pm, Dye kanal za zeleno PMT nastavljena na 100%). V skenirane slike so bili analizirani in normalizirana z Feature Extraction Software 10.7.3.1 (Agilent).
Ekstrakcijo RNA in reverzno transkripcijo-verižna reakcija s polimerazo (RT-PCR)
Total RNA je bila vzeta iz celičnih linij raka želodca uporablja TRIzola reagenta (Invitrogen). Štiri mikrogram celotne RNA je obrnjenimi prepisal z oligo dT (Applied Biosystems, Branchburg, NJ, ZDA) in 200 U nadpisano ™ II reverzne transkriptaze (Invitrogen) v celotnem volumnu 20μl. Za naslednji PCR parov oligonukleotidnih primerjev za človeške FGFRs
smo pripravili kot je opisano predhodno [12]. Human FGFR2c
: 5'-TGGTCGGAGGAGACGTAGAG-3 '(Naprej) in 5'-AAAGTTACATTCCGAATATAGAGAACC-3 "(Reverse); človek FGFR3b
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(Naprej) in 5' -GTGAACGCTCAGCCAAAAG-3 "(Reverse); človek FGFR3c
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(Naprej) in 5'-AAGCGGGAGATCTTGTGC-3 "(Reverse); človek GAPDH
: 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(Naprej) in 5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3 "(Reverse). Eden mikrolitrov RT proizvoda (cDNA) smo pomnožili s PCR v 50-ul reakcijski volumen, ki vsebuje 20 pmol zgornjih nizov primerji, 1,25 U polimeraze Ampli-Taq DNA (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija., ZDA), in končno PCR pufer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCI, 2,5 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitola in 1 mM dNTP. PCR pomnoževanje smo izvedli kot sledi: za FGFRs
, pri 95 ° C za 5 minut enkrat; 40 ciklov pri 95 ° C za 30 sekund, pri 57 ° C za 30 sekund in pri 72 ° C 1 min; Nato pri 72 ° C 7 minut; Za GAPDH
, pri 95 ° C 7 minut enkrat; 40 ciklov pri 95 ° C za 30 sekund, pri 55 ° C za 1 min in pri 72 ° C za 30 sekund; potem pri 72 ° C za 7 minut.
Real-time RT-PCR
Real-time RT-PCR je bila opravljena s pomočjo 7900H Hitro PCR v realnem času System (Applied biosistemske), kot je opisano zgoraj [13]. Naslednja skupina primerji za uporabo v humani matrix metalo-2
(MMP2
), MMP3
, MMP7
, MMP9
in GAPDH
bili pripravljeni (Dodatni datoteka 1: Tabela S1) . Realnem času RT-PCR analize smo izvedli z 200 ng RNK enakovredno cDNA, SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) in 500 nmol /l genov specifičnih primerjev. Kolesarske pogoji PCR bila 50 ° C 15 sekund in 60 ° C za 60 sekund. Intenzivnost fluorescentnim barvilom bila določena, in vsak nivojev ekspresije mRNA je normaliziran GAPDH
ravni mRNA ekspresije.
Testom proliferacije celic
AGS (4 x 10 3) in MKN28 celice (1 x 10 4) smo posejali v kompletnem mediju pri 96-dobro mikroplošče. Medij smo nato nadomestili z enim vsebuje rekombinantni FGF9 (0-10 ng /ml). WST-1 raztopino dodamo po 72 h inkubacije, in plošče inkubiramo pri 37 ° C 1 uro. Plošče so bili analizirani z uporabo ELISA čitalnika plošča pri 450 nm z referenčno valovno dolžino nastavljen na 600 nm.
Celic invazijo testa
smo celice vdor preizkus izvedemo z uporabo BioCoat vdora v Matrigel komore (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) po protokolu proizvajalca. Na kratko, AGS celice (1 x 10 5) ali MKN28 celice (3 x 10 5) smo posejali v vložek za Študiie obložena invazijo komoro (24 vodnjake, 8-im velikosti por), napolnjene s serumom -brezplačen medij, ki vsebuje različne koncentracije FGF9 (0-10 ng /ml). Nato smo celice inkubirali z medijem, ki vsebuje 10% FBS v spodnji komori pri 37 ° C v 5% CO2. Da zavirajo učinke FGF9 je anti-FGF9 protitelo (1 mg /ml) dodali k zgornji komori. Po inkubaciji 27 ur, smo celice nenamenski vdrla odstranimo z vato in celice, ki je vdrla v spodnjo površino membrane so bile določene z etanolom. Vdrla celice nato obarvali s hematoksilinom in šteje pod mikroskopom v petih različnih vidnih polj (povečave, X200).
Apoptoze testa
AGS (2 x 10 5) in MKN28 (2,5 x 10 5) celice smo zasejali v šestih vdolbinami pri rutinski mediju 24 h. Celice smo nato odvzeta seruma in obdelamo z ali brez rekombinantnim FGF9 (1-10 ng /ml) 48 h. Da zavirajo učinke FGF9 je anti-FGF9 protitelo (1 mg /ml) dodali k mediju kulture. Po obdelavi smo zbrali tako spremenljivo in priloženih celice izperemo s PBS in obarvamo z AnnexinV-FITC in propidijevim jodidom (PI) ob uporabi MEBCYTO apoptoze Kit (MBL, Nagoya, Japonska). Obarvajo celice so bili analizirani na FACScalibur tok citometrom (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, ZDA), in podatki, pridobljeni so bili analizirani s pomočjo programa Cellquest (Becton Dickinson, Mountain View, CA, ZDA).
Western blot analiza
Western analize blot so bile izvedene kot prej [14] opisano. Na kratko, po zdravljenju z ali brez reagentom, smo celice lizirali v ekstrakcijo beljakovin pufru, in proteinski ekstrakt (30 mikrogramov) je deljeno z natrijevim dodecil sulfat poliakrilamidnem gelu in prenesli na nitrocelulozo blot membrano. Membrano smo inkubirali s primarnim protitelesom, nato pa s peroksidazo konjugiranih sekundarnega protitelesa. Beljakovine so bile ugotovljene z uporabo okrepljenega kemiluminescenco sistem (Amersham bioznanosti, Buckinghamshire, UK).
Imunohistokemija
skupno 20 želodčni rak tkiva so bili pridobljeni iz vzorcev odstranjenimi kirurško na Hyogo College of Medicine. Osebek tkiva so bile določene v 10% raztopini formalina in vdelali v parafin. Ta študija je odobril revizijski odbor Hyogo College of Medicine, privolitev je bila pridobljena iz vseh bolnikih. Značilnosti bolnikov z rakom želodca smo pokazali v dodatni spisu 2: Tabela S2
Imunohistokemijsko za FGF9 smo izvedli z LSAB + komplet uporabo anti-FGF9 protitelesa (1:40, R &D Systems, Minneapolis, MN, USA). kot je opisano predhodno [15]. Končno so bili odseki inkubirali v 3,3'-diaminobenzide tetrahidroklorid z 0,05% H2O2 3 minute, nato pa jih nasprotno s hematoksilinom Mayer. Za oceno radioinkorporacijo za FGF9 je bilo vsaj pet različnih vidnih polj na invazivno pred želodca lezij raka opazili. Vzorec je bil pozitiven, ko so bili na vidnih poljih pregledanih opazili FGF9 pozitivnih fibroblastic gnezda.
Statistika analiza
so vse vrednosti, izražene kot povprečje ± SD. Podatke smo analizirali z neparni dve zimske t
-test. P
vrednosti manj kot 0,05 so menili, da kaže statistično značilna.
Rezultati
mikromrež analize KGZS v želodcu tkivih rakom
smo izolirali KGZS in NGFs (slika 1a) in primerjali profila genske ekspresije KGZS, s stabilnostjo NGFs uporabo mikromrež testa. Deset reprezentativni geni, ki so povečana pri KGZS, so navedeni v tabeli 1. Med temi geni, smo ciljno FGF9 kot najbolj izražena gena preučiti vlogo te CAF-proizvaja rastni faktor na želodčnih rakavih celic, in v resnici pred začetkom in vitro
raziskave smo potrdili, da CAF celice proizvajajo veliko večjo količino FGF9 beljakovin kot NGF celic (slika 1B). Poleg tega smo potrdili, da je FGF9 močno izražena v fibroblastih v strome iz želodca lezije raka, iz katerega je izoliran CAF (slika 1C). Slika 1 Izražanje FGF9 in njegove receptorje v KGZS in želodčnih rakavih celic. (A) Morfologija želodca KGZS in NGFs. (B) Proizvodnja FGF9 v želodčnih KGZS, NGFs in njihova klimatiziran medij (CM). (C) Izražanje FGF9 v KGZS iz želodca lezije raka. Puščice kaže KGZS. (D) Izražanje FGF receptorjev
odgovoren za FGF9 v želodcu raka celičnih linijah.
Tabela 1 predstavnik genov različno izražene v KGZS iz NGFs
pristopu št
Simbol

ime Gene
Zložite spremembo
Up-urejeno
NM_014333
CADM1
Cell adhezijski molekuli 1, Prepis varianti 1
273,6
CB178477
XLOC_l2_007424
gb

• Diagnostični izziv pljučne tumorja trombotične mikroangiopatije kot predstavitev metastatskega raka želodca: prikaz primera in pregled literature
• Xpert MTB /RIF test se lahko uporablja na arhiviranih želodca aspiracija in povzroča vzorce izpljunka za občutljivo diagnozo pediatrične tuberkuloze