Kateholamina up-uravnava MMP-7 izražanje z aktiviranjem AP-1 in stat3 v želodčni cancer

Katekolaminski up-uravnava MMP-7 izražanje z aktiviranjem AP-1 in stat3 na raka želodca
Abstract
ozadju
stresa, anksioznosti in depresija lahko povzroči kompleksne fiziološke in nevroendokrinih spremembe, ki so posledica povečane ravni stresa, povezanih hormonov kateholaminov, ki lahko predstavljajo primarni mehanizem, s katerim gen fiziološki dejavniki vpliv izraz v tumorjih. V tej študiji smo raziskali učinke stimulacije kateholamina na MMP-7 izražanja v želodčnih rakavih celic in pojasnjen molekularne mehanizme up-regulacijo ravni MMP-7 pri ketoholamin skozi adrenergičnega signalne poti.
Rezultati
Povečana MMP-7 izraz je bila opredeljena na ravni mRNA in koncentracije proteina v želodčnih rakave celice v odziv na stimulacijo izoproterenol. β2-AR antigonist učinkovito odpravljeno-izoproterenol inducirane MMP-7 izraz. Aktivacija stat3 in AP-1 je vidno povzročena s stimulacijo izoproterenol in AP-1 prikaže večjo učinkovitost kot stat3 in-izoproterenol inducirane MMP-7 izražanja. Mutageneza treh stat3 vezavnih mest v MMP-7 promotor ni zatiranju transaktivacije za MMP-7 promotorja in utišanje stat3 izraz ni bilo učinkovito pri preprečevanju-izoproterenol inducirane MMP-7 izraz. Vendar, izoproterenol-inducirane MMP-7 promotor aktivnosti so popolnoma izgine, ko je mesto AP-1 mutirana. Stat3 in c-Jun lahko fizično interakcijo in se veže na mestu AP-1, implicating, da je prepletanje obeh transkripcijskih faktorjev na spletni strani AP-1 pristojen za-izoproterenol stimulirane MMP-7 izražanja v želodcu rakavih celic. Izraz MMP-7 v želodčnih tkivih rakavih bilo ugotovljeno, da je na mestu, kjer je pretirano izražena β2 AR in ravni MMP-7 in P2-AR bila najvišja v metastatskem locus raka želodca.
Zaključki
Up-regulacijo MMP-7 izražanja skozi β2-AR-posredovane signalne poti sodeluje pri invaziji in metastaz raka želodca.
Ozadje
raka želodca je druga najpogostejša najpogostejši vzrok raka povezanih smrti, s približno 700 000 smrti vsako leto [1, 2]. Eden od pomembnih dejavnikov pri patogenezi raka želodca je kronična infekcija s Helicobacter pylori
[3]. Vendar pa je večina okuženih posameznikov ne razvijejo malignost in izid okužbe je odvisna od gostitelja, okolja in drugih dejavnikov [4]. Vedno več je dokazov, ki podpirajo vlogo psihološki stres v želodčni pojava raka in razvoju [5]. Številne epidemiološke študije so pokazale, da lahko psihološki ali vedenjski dejavniki pospešujejo napredovanje raka želodca [6, 7]. Vendar pa natančen mehanizem, s katerim psihološki stres deluje želodca napredovanje raka, je jasno.
Stres sproži odziv hipotalamus-hipofiza-nadledvična žleza (HPA), zaradi česar je poostren kateholamina [8, 9]. Številne študije so pokazale, da je stimulacija ketoholamin ovira bio-vedenja tumorskih celic neposredno, predvsem z p2-adrenergičnih receptorjev (β2-AR) pogojenega signalno pot [10-14]. Nedavne ugotovitve kažejo na potencialne mehanizma za napredovanje raka jajčnikov, nazofarinksa in trebušne slinavke raka kažejo, da lahko kateholamina modulira izražanje matrične metaloproteinaze (MMP) -2 in MMP-9, ki ga strome in tumorskih celic [15-17]. To postavlja zanimivo vprašanje, ki je lahko psihološki stres igra pomembno vlogo pri razvoju in napredovanju raka želodca s spreminjanjem izražanje MMP z β2-AR posredovane signalne poti.
Nabrali linije dokazov kažejo, da je MMP-7 vključenih v invazija in metastaze raka želodca [18-24]. MMP-7 je najmanjši znani član MMP družine in ima največjo zunajcelični matriks (ECM) -degradative aktivnost proti različnih ECM komponentami, vključno elastina, želatino, kolagena tipa IV, fibronektin, vitronektin, laminin, entaktin agrekana in proteoglikanov je med MMP [25, 26]. Prav tako je mogoče sprožiti aktiviranje z MMP kaskade [27]. Edinstvena značilnost MMP-7 je njen omejeni izraz pretežno v epitelnih celic žleznega tkiva, vključno z običajnim dojke, jeter, trebušne slinavke, prostate in peribronchial žlez [28].
Ugotovljeno je bilo, da je MMP-7 prekomerno v invazivno raka prebavil, kot so požiralnika [29], v želodcu [30], trebušne slinavke [31, 32], debelega črevesa in [33-35], jetra [36] in drugi organi. Nivo izražanja MMP-7 je značilno povezana s transformacijo tumorskih celic, fenotipe agresivnega raka in stopnji tumorskega napredovanja [37], zlasti tumorjev v prebavnem traktu. Prevelike količine MMP-7 je pogosto opredeljena v predrakavih želodčne lezij in najbolj želodca karcinomov [18-21, 24, 38]. Pozitivna korelacija ravni MMP-7 s tumorsko invazijo želodčni steni, bezgavk metastaze, peritonealna razširjanje in preživetje bolnikov z rakom želodca so dokumentirali v več študijah [23]. MMP-7 je bila priznana kot pomemben posrednik napredovanja raka in obravnava kot samostojno prognostični označevalec primarnim rakom želodca. Vendar pa so možne molekularne mehanizme MMP-7 prekomerno pri raku želodca so še vedno v veliki meri neraziskana.
V tej študiji smo preučevali učinke stimulacije kateholamina na MMP-7 izražanja v želodcu raka celičnih linijah in pojasnjen molekularne mehanizme na regulacijo navzgor ravni MMP-7, ki ga ketoholamin preko adrenergične signalne poti.
Rezultati
stimulacijo izoproterenol up-uravnava izražanje MMP-7
Pokazalo se je, da je izraz MMP-9 v jajčnikov rak je znatno povečala v tumorskih povezanih makrofagov pri bolnikih s povišanimi depresivnih simptomov [15] in ketoholamin potencira LPS inducirane ekspresije MMP v humanih monocitih [39]. Da bi raziskali, ali Katekolaminski povezuje z izražanjem MMP-7 v želodčnih rakavih celic, smo najprej pregledali učinke β-AR agonisti izoproterenol na transkripcijo MMP-7 gena v želodcu raka celičnih linijah HGC-27 in MGC-803 . Doze ketoholamin uporabljene v tej študiji so bili izbrani, da odražajo fizioloških pogojev tega hormona v tumorjih [40, 41]. Semi-kvantitativno in PCR v realnem času analize so pokazale, da je bil MMP-7 izraz na transkripcijski ravni v želodcu raka celičnih linijah nizka. Ko so celice izpostavljene 10 mikrometrov z izoproterenol v mediju brez seruma za 12 ur, je bilo MMP-7 mRNA nivoji v obeh celičnih linijah izredno povečal (sl. 1A in 1B). Da bi ugotovili, ali povečana stopnja MMP-7 mRNA vodi do podobnega povečanja proizvodnje beljakovin, MMP-7 izražanja v HGC-27 in MGC-803 celic smo analizirali s Western blot. Kot je prikazano na sliki. 1C, stimulacija izoproterenol povzročilo znatno up-regulacijo MMP-7 izražanja v HGC-27 in MGC-803 celic. β2-AR, ki posreduje večina učinkov kateholaminov je bilo opredeljeno v dojkah in jajčnikih rakavih celic [11, 13]. Da bi pojasnili vlogo β2-AR-posredovano signalizacijo v MMP-7 izražanja, smo uporabili antagonistično propranolol z β-AR in selektivni antagonist β2-AR ICI-118551 za testiranje, če se lahko zaviral učinek izoproterenol na MMP-7 izražanja. Naši podatki so pokazali, da je zdravljenje s propranololom in ICI-118,551 učinkovito blokirana-izoproterenol spodbudila MMP-7 izražanja (sl. 1D, zgornji plošči). Nato smo pregledali, ali je β2-AR, izražen v želodcu rakavih celic. Podatki so pokazali, da je bila ekspresija P2-AR zaznati v treh želodčnih linij rakavih celic, vključno HGC 27, MGC-803 in MKN-45 (sl. 1D, nižji plošče). Ti podatki kažejo, da izoproterenol stimulira nastajanje MMP-7 v želodčnih raka celičnih linijah in da je navzgor regulacija MMP-7 izražanja izoproterenol je predvsem sprožil β2-AR posredovanega signalizacijo. Slika 1 Izoproterenola stimulacija navzgor regulira izražanje MMP-7. A in B, HGC-27 in MGC-803 celice smo inkubirali preko noči v mediju brez seruma in nato obdelamo z 2 ali 10 pM izoproterenol oz. Ekspresijo MMP-7 mRNA smo analizirali z RT-PCR (A) in PCR v realnem času (B). C, smo HGC-27 celice stimulirali z 0, 1 ali 2 uM izoproterenol in MGC-803 celicah s 0, 5 in 10 uM izoproterenol po serumu lakote. Ekspresijo MMP-7 proteina smo analizirali z Western blot. D so MGC-803 celice obdelamo s 10 pM propranolol ali 1 uM ICI-118,551 za 1 uro in nato pri 10 uM izoproterenol. MMP-7 izraz smo analizirali z Western blot (zgornji plošče); izraz P2-AR v MGC-803, MKN-45 in HGC 27 celic je bila odkrita z Western blot (nižja plošče).
izoproterenol up-uravnava MMP-7 promotor aktivnost in aktivira stat3 in AP-1
če želite raziskati molekularne mehanizme, s katerimi kateholamina up-uravnava MMP-7 izraz, moramo najprej ugotoviti, če lahko stimulacija izoproterenol neposredno vplivajo na MMP-7 promotor aktivnost. zgrajeni smo plazmida pMMP-7 vsebuje luciferazno reporterski gen s 340 bp MMP-7 fragmenta promotorja (-296 - 44), ki jo poganja (slika 2A).. MGC-803 celice smo transfektirali z pMMP-7 in učinek izoproterenol na MMP-7 promotorsko aktivnost je bila ocenjena s luciferazne teste. Kot je prikazano na sliki. 2B, po izoproterenol stimulacije za 1 uro, da luciferazne aktivnosti začela naraščati in postopoma okrepiti. V 6 urah po izpostavljenosti, MMP-7 promoter dejavnosti je pokazala več kot dvakratno povečanje v primerjavi z nestimuliranih kontrolnih celic, kar kaže, da izoproterenol stimulacijo lahko neposredno inducira transaktivacije za MMP-7 promotorja. Slika 2 Izoproterenola navzgor regulira MMP-7 promotorsko aktivnost in aktivira stat3 in AP-1. A Shematski prikaz plazmida pMMP-7 vsebuje luciferazno reporterski gen s 340 bp MMP-7 fragmenta promotorja poganja. SBE, stat3 mestu; ABE, AP-1 mesto. B, MGC-803 celice so sodelovali transfekciji s pMMP-7 in PRL-TK. Po transfekciji 48 urah smo celice inkubirali v mediju brez seruma za dodatno 24 h in potem stimulirali z 10 pM izoproterenol za 0, 1, 2, 3, 6 ali 9 ur oz. MMP-7 promoter dejavnosti ocenil luciferazne teste. C in D so bile MGC-803 celice obdelamo s 10 pM propranolol za 1 uro in nato pri 10 uM izoproterenol za 0, 15, 30, 60, 120 ali 180 min oz. Fosforilacijo stat3 in c-Jun smo analizirali z Western blot z anti-fosforjevega-stat3 in anti-fosfor-c-Jun kunčjih poliklonskih protiteles. ISO, izoproterenol.
V naši prejšnji raziskavi [42, 43] smo prepoznali AP-1 vezavno mesto na položaju -67 do -61 in tri vezavna mesta na položajih stat3 -137 do -122, -168 do -159 in -255 do -245 v MMP-7 promotorja (sl. 2A). Prav Pokazali smo, da AP-1 in stat3 vezan na AP-1 in enem od stat3 (-137 do -122) straneh pozitivno regulacijo MMP-7 transkripcijo. Nedavna študija je pokazala, da ima kateholamina potencial za aktiviranje stat3. Da razišče, ali kateholamina spodbuja MMP-7 prepis preko aktivacije stat3 in AP-1, smo analizirali fosforilacijo stat3 in c-jun. Fig. 2C je pokazala, da izoproterenol povzročil fosforilacijo stat3 po min stimulaciji 30, ko je dosegel vrh pri 2 h. Čeprav je aktiviranje c-Jun počasi začela pri 60 min je bila največja fosforilacije doseže 2 uri ter (sl. 2D). To je pomenil, da je stimulacija izoproterenol proizvaja β2-AR-posredovano signal, ki sproži aktivacijo stat3 in AP-1.
Stat3 element MMP-7 promotorja ni potrebno in stat3 ni dovolj za-izoproterenol inducirane MMP-7 izražanja
da bi ugotovili, ali so stat3 elementi, funkcionalna in-izoproterenol inducirane MMP-7 genskega prepisovanja, smo najprej lotili mutageneze treh stat3 mestih po mutira temeljnega sekvence stat3 strani, ki temeljijo na pMMP-7 (sl. 3A) in izdelana plazmida pMMP-7mS. Plazmid smo transfektirali v MGC-803 celicah. Po transfekciji 48 urah smo celice inkubirali v mediju brez seruma preko noči, nato pa stimulirali z 10 mikrometrov z izoproterenol 6 h. Opazili smo presenetljivo, da je mutacija vseh treh stat3 vezavnih mest ni pomembno vplivala na transaktivacije MMP-7 promotorja. Kot je prikazano na sliki. 3B, luciferazne aktivnosti so se postopoma povečuje in se približal vrhunec na 6 ur po izpostavljenosti. Rezultat je bil zelo podoben tistemu opazili v celicah, transfektiranih s divjega tipa MMP-7 promotorja. Za identifikacijo vlogo stat3 v tem primeru, so HGC-27 in MGC-803 celic transfekciji s pGeneSuppressor izražanje shRNA ciljanje stat3 in HGC-27 /stat3-sh in MGC-803 /stat3-sh celice sedež. Fig. 3C je pokazala, da je bila ekspresija stat3 učinkovito zatreti v obeh celicah. V skladu z zgoraj navedenimi podatki,-izoproterenol inducirane MMP-7 promoter dejavnosti zdelo ne bo bistveno oslabljena v MGC-803 /stat3-sh celice (sl. 3D). Poleg tega,-izoproterenol inducirane MMP-7 izraz na ravni mRNA in koncentracije proteina ni bila pomembneje vplivala dušenje zvoka stat3 izražanja, kot kaže RT-PCR, PCR v realnem času in Western blot (sl. 3E, F in 3G). Rezultati kažejo, da je stat3 element MMP-7 promotorja ni potrebna stat3 ne zadošča, izoproterenol inducirane MMP-7 izražanja. Slika 3 stat3 element MMP-7 promotorja ni potrebna stat3 ne zadošča, izoproterenol inducirane MMP-7 izražanja. A, shematski prikaz plazmida pMMP-7mS vsebuje tri mutiral stat3 mesta na položajih -255 do -245, -168 do -159 in -137 do -122. B, MGC-803 celice smo sočasno transfektirali z pMMP-7mS in PRL-TK, sestradana, nato pa stimulirali z 10 pM izoproterenol za 0, 1, 2, 3, 6 ali 9 ur oz. MMP-7 promoter dejavnosti ocenil luciferazne teste. C, HGC-27 in MGC-803 celice stabilno transfekciji s pGeneSuppressor izražanje stat3 shRNA. Izraz stat3 smo analizirali z Western blot v HGC-27 /stat3-sh in MGC-803 /stat3-sh celice. D so MMP-7 promotor aktivnosti testiramo na MGC-803 /stat3-sh celice po stimulaciji s 10 pM izoproterenol za 0, 1, 2, 3, 6 ali 9 ur oz. E preko G, HGC-27 /stat3-sh in MGC-803 /stat3-sh celice smo stimulirali z 2 LM ali 10 iM izoproterenol oz. Izraz MMP-7 je bila analizirana z RT-PCR (E), PCR v realnem času (F) in Western blot (G).
AP-1 igra ključno vlogo pri-izoproterenol inducirane MMP-7 izražanja
Zgornji podatki so bili nepričakovani, saj lahko stat3 aktivira stimulacijo izoproterenol. Poleg tega v naši prejšnji študiji [42, 43], smo dokazali, da stat3 in AP-1 sodelovalo pri urejanju Her2 signalizacijo posredovanega MMP-7 ekspresijo v celice raka dojke. Nato smo poskušali raziskati, ali AP-1 vplivi izoproterenol-inducirane MMP-7 izraz. MGC-803 celice smo transfektirali s plazmidom pMMP-7mA vsebuje mutirano AP-1 mesto na položaju -67 do -61 v MMP-7 promotor in luciferazni aktivnosti, merjeno (sl. 4A). Presenetljivo je bilo, izoproterenol inducirane MMP-7 promotor aktivnosti popolnoma izgine v vseh časovnih točkah (sl. 4b), kar kaže, da je mesto AP-1 bistvenega pomena, izoproterenol inducirane MMP-7 izražanja. Slika 4 AP-1 igra ključno vlogo pri-izoproterenol inducirane MMP-7 izražanja. A Shematski prikaz plazmida pMMP-7mA vsebuje mutirano AP-1 mesto na položaju -67 do -61. B, MGC-803 celice smo sočasno transfektirali z pMMP-7mA in PRL-TK, sestradana in nato stimulirali z 10 pM izoproterenol za 0, 1, 2, 3, 6 ali 9 ur oz. MMP-7 promoter dejavnosti ocenil luciferazne teste. C, MGC-803 celic co-transfekciji s TAM67, pMMP-7 in PRL-TK so bile povzročene z 10 uM izoproterenol. MMP-7 promotor aktivnosti smo analizirali s luciferazne teste. D, MGC-803 celice stabilno izraža shRNA ciljanje c-jun (MGC-803 /c-Jun-sh) so bile ustanovljene in c-Jun izraz je bila analizirana z Western blot. E so MMP-7 promotor aktivnosti testiramo na MGC-803 /c-Jun-sh celice po stimulaciji s 10 pM izoproterenol za 0, 1, 2, 3, 6 ali 9 ur oz. F je bil MMP-7 izraz analizirani v MGC-803 /c-Jun-sh celic, po stimulaciji z 0, 2 ali 10 iM izoproterenol oz. G, so plazmidi izražajo c-jun in STAT3C transfektirali v MGC-803 /c-Jun-sh celic oz. MMP-7 promoter dejavnosti smo analizirali s luciferazne teste.
Za potrditev-izoproterenol inducirane MMP-7 izraz je pod nadzorom AP-1, smo nato preučila, ali se lahko transaktivacije MMP-7 promotorja, ki izoproterenol povzroča zavira prevladujoč negativno c-jun mutant TAM67, ki nima c-jun 5'-transaktivirati domene, vendar ima funkcionalno c-jun levcin zadrgo in domena DNA veže. Po prehodni transfekciji s TAM67 v MGC-803 celic, so-izoproterenol inducirano transaktivacije MMP-7 promotorja analiziramo s luciferazne teste. Kot je prikazano na sliki. 4C, izraz prevladujočega negativnega c-jun pokazal vidno zaviralno vpliva na MMP-7 promotorja dejavnosti. Nadalje preverili odločilno vlogo AP-1, smo testirali ali blokiranje endogeno izražena c-Jun lahko inhibira ekspresijo MMP-7. Celice MGC-803 /c-Jun-sh bile določene (sl. 4D) in MMP-7 promotor aktivnosti analizirajo luciferazne teste. Podatki na sliki. 4E je pokazala, da so bile aktivnosti MMP-7 promotorja presenetljivo zmanjša za knock-down v c-Jun izražanja. Western blot analiza je pokazala tudi, da je bila, isoprotereol inducirane MMP-7 izraz izrazito znižala v MGC-803 /c-Jun-sh celic, ker je precej velika količina MMP-7 beljakovin je bila odkrita v starševske celice po stimulaciji izoproterenol (sl. 4F). Predvsem je prekomerno eksogenega c-jun dramatično obnovljena MMP-7 promotor dejavnosti MGC-803 /c-Jun-sh celic, vendar konstitutivno aktivirana stat3 mutant STAT3C le minimalno aktivirano MMP-7 promotor, ko je c-Jun izraz utišani (Slika . 4G). Ti podatki pokazali, da AP-1 prevladujejo-izoproterenol inducirane MMP-7 izraz.
C-Jun in stat3 sinergistično urediti MMP-7 izraz v odgovor na izoproterenol stimulacijo
sodelovanje stat3 in c-Jun pri urejanju različnih poročali so gen transkripcije. Naši prejšnji študiji kaže, da je aktivacija MMP-9 promotorja odvisna interakciji stat3 in AP-1 [44]. Kot je navedeno zgoraj, stimulacija izoproterenol inducirano aktivacijo stat3 in AP-1 istočasno. razmišljal smo, da lahko stat3 in AP-1 sinergijsko sodelujejo pri regulaciji-izoproterenol stimulirane MMP-7 izražanja. Je bilo navedeno, da AP-1 sodeluje z stat3 v interlevkin 6-inducirano transaktivacije odzivni element IL-6 v odsotnosti neposrednega AP-1 DNA vezavo [45]. Nas morali preizkusiti morebitno kooperativno vezave AP-1 /stat3 lokacije AP-1.
Da bi ugotovili, ali da stat3 in AP-1 lahko zaposli na mestu AP-1, MMP-7 promotorja in vivo so MGC-803 celice stimulirali z 10 mikrometrov od izoproterenol za 0, 2,5 ali 4 ure, oz. Kromatinske DNA /proteinske komplekse jedrske bili pripravljeni in vezavo stat3 in c-Jun na mestu AP-1 analiziramo s čipom testih. PCR produkt izbran za pomnoževanje razteza od območja na -76 do 165 oskrbovanju z AP-1 mesto v MMP-7 promotorja. Imunoprecipitacije z anti-stat3 in anti-c-Jun protitelesa sledi PCR dobimo pričakovano 241 bp pas iz obarjalna po stimulaciji izoproterenol 2,5 h. Intenzivnost teh pasovih so oslabljena po 4 ure. V nasprotju s tem v nestimuliranih kontrolnih celicah ni vezavo stat3 na tej spletni strani je bil opazen in vezavo c-Jun komaj zaznavne. Ne bend smo pomnožili s imuno uporabo zajec IgG (sl. 5A). Podatki so potrdili realnem času PCR (sl. 5B). Ti podatki so pokazali, da združenje stat3 in c-Jun z MMP-7 promotorjem in vivo
je specifičen in izoproterenol stimulacija povzroča vezava stat3 /c-Jun za AP-1 elementu. Slika 5 c-Jun in stat3 sinergistično urediti MMP-7 izraz. A in B, so bili MGC-803 celice stimulirali z 10 mikrometrov z izoproterenol za 0, 2,5 ali 4 h oz. Kromatinske DNA /pripravimo komplekse jedrskih beljakovine. Vezava stat3 in c-Jun na mestu AP-1 je analizira imuno z anti-stat3 in anti-AP-1 protitelesa sledijo PCR (A) in PCR v realnem času (B). C, smo MGC-803 celice obdelamo s 10 pM izoproterenol za 0 ali 2,5 h oz. Jedrska izvleček je bil pripravljen s jedrskih citosolu Extraction Kit. β-tubulin in AP-2α smo analizirali z Western blot preučiti ločitev citoplazme in jedrskih beljakovin. C, citosolnih proteinov; N, jedrske beljakovine. D 200 pg jedrskih ekstraktov smo inkubirali pri 4 ° C za 4 ure pri biotiniliranih oligonukleotidi, ki vsebujejo AP-1 konsenzno sekvenco prej vezano na Dynabeads M-280, v prisotnosti ali odsotnosti enega, pet ali 15-kratno količino dvojno -stranded oligonukleotidov tekmovalci. Inkubacija nuklearnih proteinov z dvojno vijačnih oligonukleotidov, ki vsebujejo mutirano AP-1 stran (Mut oligo) ali nespecifični dvojno vijačnih oligonukleotidov (NS oligo) smo uporabili kot kontrolo. Proteinskih /DNA komplekse smo ločili s Dynal magnetom in izpostavimo SDS-PAGE. Stat3 in c-Jun so odkrili Western blot z anti-stat3 in anti-c-Jun protiteles. E in F, MGC-803 celice smo sočasno transficirali s plazmidi pMMP-7mA in pCDNA3.1 /c-Jun, ali smo testirali STAT3C in luciferazne aktivnosti.
Za nadaljnjo karakterizacijo interakcijo stat3 /c-Jun z AP-1 mesto, smo izvedli DNK afiniteto padavin testom. Potem ko so bile MGC-803 celice zdravijo z izoproterenol 2,5 h, smo pripravili jedrski ekstrakt in njegova kakovost je bila ocenjena (sl. 5c). Biotinilirane oligonukleotide, ki ustrezajo -74 do -52 območju MMP-7 promotorja inkubiramo z 200 ug jedrskih ekstraktov za spustnih testih s. Je streptavidinom obloženo magnetne kroglice so bili uporabljeni za obori biotinom označeno dvojno vijačnico oligonukleotidov in s tem povezanih vezavo DNK proteinov. Vezavo nuklearnih proteinov do biotiniliranih oligonukleotidov smo analizirali v prisotnosti enega, pet ali 15-kratno količino dvojno vijačni oligonukleotid konkurentov, ki vsebujejo AP-1 konsenzne sekvence. Inkubacija nuklearnih proteinov z dvojno vijačnih oligonukleotidov, ki vsebujejo mutirano AP-1 mesto ali nespecifičnih dvojne vijačnice oligonukleotidov smo uporabili kot kontrolo. Nastale Kompleksi DNK-protein so bili rešena s SDS-PAGE, čemur sledi Western blot z anti-c-jun in anti-stat3 protiteles. Združenje obeh transkripcijskih faktorjev z oligonukleotidov, ki vsebujejo AP-1 kompromisne sekvence bilo jasno zaznati v jedrskih izvlečke iz-izoproterenol stimulirane celice, ne pa tudi iz nestimuliranih celicah. Konkurenca petnajst kratno količino tekmovalcev povsem odpravljena tvorbo biotiniliranih DNK /proteinskih kompleksov (sl. 5d). Ne veže c-jun in stat3 enem bila odkrita oligonukleotidi vsebujejo mutirano AP-1 mesto ali nespecifični oligonukleotide (sl. 5D). Ta poskus daje vitro dokaze za potrditev stat3 in c-Jun, pod stimulacije kateholamina, lahko fizično interakcijo in se veže na mestu AP-1 doseči transaktivacije z MMP-7 gena v želodcu rakavih celic.
Pokazali smo, da izoproterenol inducirano MMP-7 aktivacija promotor ni bil moten, mutagenezo osrednjih zaporedjih vseh treh stat3 mestih, kar kaže, da se stat3 elementi ne smejo delovati v-izoproterenol inducirane MMP-7 genskega prepisovanja v želodčnih rakavih celic. Da bi še dodatno preveriti vlogo AP-1 element, plazmid pMMP-7mA bil co-transfektirali v MGC-803 celic z obeh pCDNA3.1 /c-jun ali STAT3C oz. Zanimivo je, da mutacija AP-1 vezavno mesto temeljito blokira aktivacijo MMP-7 promotorjem v transfektiranih celicah prekomerno ekspresijo bodisi c-Jun ali STAT3C (sl. 5e in 5F), kar kaže, da je mesto AP-1 pomemben regulatorni element in sinergijski ureditev-izoproterenol inducirane MMP-7 izražanja, ki ga stat3 in AP-1 sklicuje na ta element.
β2-AR in MMP-7 so colocalized v želodčnih tkivih raka
čezmerno MMP-7 je bila pogosto na invazivno pred rakom človeške želodčne in je neposredno povezana s prognozo pri bolnikih z rakom želodca. Za študij korelacijo ravni β2-AR z MMP-7 izražanja v človeškega raka želodca, smo zbrali pet vzorcev želodca raka tkiva in analizirali izražanje P2-AR in MMP-7 z imunohistokemičnim označevanja. Zanimivo je močan izraz P2-AR in MMP-7 pojavil na istem območju tumorskih tkiv (sl. 6a), kar kaže na intimno razmerje med MMP-7 in P2-AR. Da bi še dodatno raziskati vlogo MMP-7 in p2-AR v metastaz raka želodca, smo analizirali izražanje MMP-7 in P-ARS v rakastih, primestnih rakavih in metastatskih tkiv iz pacienta z rakom želodca. Kot je prikazano na sliki. 6B, izraz β1-AR, P2-AR in MMP-7 na ravni proteina je bila v rakavo tkivo višja kot v periferni rakasto tkivo. Vendar pa je najvišji izraz jih najdemo v metastatskem tkivu. Poleg tega je bil MMP-7 mRNA prekomerno tudi v metastaznih tkivih (Sl. 6C). Ti podatki močno kažejo na tesno povezavo med MMP-7, β2-AR in metastaze raka želodca. Slika 6 β2 AR in MMP-7 so bili izraženi pri želodčnih tkivih raka. A smo zbrali pet vzorcev rak želodca tkiva. Izraz P2-AR in MMP-7 je bila analizirana z imunohistokemijo. B izraz MMP-7 je β1 AR in β2 AR v rakastih, perifernih-rakavih in metastaznih tkiv analiziramo z Western blot. C, raven MMP-7 mRNA v rakastih, peri-rakavih in metastatskih tkiv je bila analizirana z realnem času PCR.
Razprava
te študije, ki temelji na predpostavki, da je lahko psihosocialni stres predisponirajoči dejavnik pri raku želodca. Stres, anksioznost in depresija lahko povzroči kompleksne fiziološke in nevroendokrinih spremembe, ki vplivajo na več sistemov, vključno s prebavili. Bolniki z rakom imajo pogosto znatne čustvene stiske. Združenje fiziološki stres pri zvišanju izločanja želodčne kisline in želodcu že dolgo opazili [46, 47]. Ugotovljeno je bilo, da lahko kronični stres poslabša želodčne razjede. V nedavni raziskavi, ki temelji-populacija vpisanih 2014 predmetov, je bil poudarek velja za najmočnejši dejavnik tveganja za raka želodca [48]. Ugotovitve iz eksperimentalnih študij kažejo, da lahko povečana aktivnost simpatičnega živčnega sistema predstavljajo osnovni mehanizem, s katerim gen fiziološki dejavniki vpliv izraz v tumorjih [49]. Do sedaj je bila večina proučevali mehanizme, ki povezujejo stres in raka napredovanje povezanih posrednih učinkov z imunskim [8]. V nekaj zadnjih študijah so stres, povezane beljakovine in poti neposredno povezana z vedenjsko spremembo malignih celic [10-17]. Vendar pa je premalo podatkov razme- jujejo molekularne mehanizme, ki sodelujejo.
V tej študiji smo ugotovili povečano MMP-7 ekspresijo v želodcu raka celičnih linijah kot odziv na stimulacijo s stresom povezane hormona ketoholamin. Ocenjuje se, da bi lahko koncentracija ketoholamin v mikrookolje tumorja več kot 100-krat višja kot v normalnih tkivih in kroži plazmo. MMP-7 je edinstven v svojem omejenem izražanja v tumorskih celicah, kar kaže, da je MMP-7 ekspresijo v tumorjem povezanega način. bistveno Opazili smo, da izoproterenol stimulacijo reguliran MMP-7 izraz na ravni mRNA in ravni beljakovin v želodcu rakavih celic. β2-AR antigonist učinkovito odpravljeno-izoproterenol inducirane MMP-7 izraz regulacijo navzgor, kar kaže, da je vpletena v proces β2-AR-posredovano pot.
MMP-7 izraz je strogo nadzorovan na nivoju transkripcije. Naši prejšnji študija je pokazala, da je bila heregulin-β-inducirane MMP-7 izraz ureja HER2 posredovano stat3 in aktivacije AP-1 v celičnih linijah človeškega raka dojke [42, 43]. Smo ugotovili tudi funkcionalne AP-1 in stat3 veznih mest v prvem 350 bp začetnem mestu transkripcije v humani MMP-7 promotorja [42, 43]. Druga študija je pokazala, da lahko FGF-2 neposredno upregulate MMP-7 izražanje genov v človeških tumornih celic in umbilikalnih venskih endotelnih celic skozi AP-1 in stat3 [50]. Kopičijo dokazi močno podpira, da stat3 služi kot osrednji regulativni vozlišče, na katerem konvergirajo več poti onkogeni signalne [51]. Aberrant aktiviranje stat3 je bilo dokazano, da igrajo ključno vlogo pri razvoju želodčnega raka [52, 53]. Nedavna študija in naši podatki odkrili pridružitvi catacholamine z aktivacijo stat3 v jajčnikov in dojk rakavih celic [12, 13]. V tej študiji smo dokazali, da je stimulacija izoproterenol vidno inducirano aktivacijo stat3 v želodčnih rakavih celicah, implicating tega kateholamina lahko pospeši maligno napredovanje raka želodca. Naše neobjavljeni podatki prav tako pokazali, da izoproterenol stimulira ekspresijo MMP-2 in MMP-9 pri želodčnih rakavih celicah predvsem preko aktiviranja stat3. Vendar pa v tej študiji, smo ugotovili, da AP-1 prikazan večjo učinkovitost kot stat3 v-izoproterenol inducirane MMP-7 gena transkripcijo in stat3 elementi so nefunkcionalne, kot utišanje stat3 ekspresije ni bilo učinkovito pri preprečevanju, izoproterenol inducirane MMP- 7 izražanja in mutageneza treh stat3 vezavnih mest ni zatiranju transaktivacije z MMP-7 promotorjem v odgovor na indukcijo izoproterenol. V nasprotju mesto AP-1 in c-Jun ureja ta proces. Zanimivo je, da smo stat3 in c-Jun ugotovljeno, da se veže na enotnem AP-1 mesto v MMP-7 promotorja hkrati implicating da je prepletanje obeh transkripcijskih faktorjev na enem vezavnega mesta odgovorna za-izoproterenol stimulirane MMP-7 izražanja raka želodca celice. No.

Sequences

P1
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACC-3'
P2
5'-CCCAAGCTTTGCCGTCCAGAGACAATTG-3'
P3
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACCTATGAGAGCAGTCATTTGACGCTGGCAAAA-3'
P4
5'-CATTGTGTGCTCCCTGCCACTAACGATGTAATACTT-3'
P5
5'-TTGTCTTTCAAAGGATT-3'
P6
5'-TACTTCCTCGTCCTAGCCAATGCAAAATAACACATAC-3'
P7
5' 3'
P8
5'-GAAAACACTCAAACGAGTGACCTATTTCCACAT-3'
P9
5'-TTTCTTTTTAGAGTCTACAG-3'
P10
5'-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3'
P11
5'-GTGAGCATCTCCTCCGAGAC-3'
P12
5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'
P13
5'-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'
P14
5'-ACACATACTTTCAAAGTTCTGTAGACTCT-3'
P15
5'-ACGGTGAGTCGCATAGCT-3'

• Proteomskimi sprememba gastic adenokarcinomov iz japonskih bolnikih
• Bolnik z rakom želodca s peritonealno karcinomatozo se zdravijo z intraperitonealno kemoterapijo, ki je preživel več kot 5 let prejemali ponavljajoče laparoskopsko preglede: prikaz primera