ZIC1 modulira distribucij celičnega cikla in migracijo celic z regulacijo sonic hedgehog, PI
3K in MAPK signalnih poti v raka želodca
Abstract
Ozadje
ZIC1, ključni transkripcijski faktor z cinkov prst področjih, je so vpleteni v proces nevronske razvoja. Smo že pokazali, da lahko ZIC1 deluje kot supresorski tumorju raka prebavil. Vendar pa je molekularni mehanizem osnovni sodelovanje ZIC1 v napredovanja tumorja ostaja neznan.
Metode
vlogi ZIC1 na celično proliferacijo in migracijo je bila preučena. Ureditev sonic hedgehog (Pst), fosfoinozitidnih 3-kinaze (PI 3K) in mitogen aktivira protein kinaza (MAPK) signalne poti po zunajmaternične izražanje ZIC1 v želodcu rakavih celic so bile ocenjene.
Rezultati
čezmernim ZIC1 prispeva k inhibicije migracije celične proliferacije in distribucijo celičnega cikla raka želodca. Modulacija G1 /S kontrolno točko, ki ga ZIC1 je predvsem posredovano preko regulacije ciklin-odvisne kinaze (p21 Waf1 /Cip1, P27 Kip1 in ciklin D1). Poleg tega lahko ZIC1 inaktivirajo raven phospholated Akt in Erk1 /2, in transkripcijsko urediti Sonic ježa (Pst) signalizacijo, kar je povzročilo, da regulira izražanje p21 Waf1 /Cip1 in ciklin D1. Končno smo sistemsko opredeliti ZIC1 nadaljnjim ciljev v analizi cDNA mikromrež in pokazala, da so 132 geni navzdol regulirano in 66 geni so up-urejena po transfekciji s ZIC1 v želodcu rakavih celic. Te kandidatke geni igrajo ključne vloge v celično proliferacijo, celično cikla in celično gibljivost.
Sklepi
čezmernim ZIC1 rezultatov v inaktivacijo Pst, PI 3K in MAPK signalnih poti, kot tudi ureditev večih nadaljnjim ciljev ki so bistvenega pomena za razvoj in napredovanje raka želodca. ZIC1 služi kot potencialnega terapevtskega cilja za raka želodca.
Ključne besede
ZIC1 Sonic ježa Cell cikla tumorja dušenje Ozadje
ZIC1, eno od petih Žic družinskih genih, ki je vključen v različnih razvojnih procesov, vključno Neurogeneza in myogenesis [1, 2]. V zadnjem času, ZIC1 so dokazali, da sodelujejo pri napredovanju človeških tumorjev, vključno z meduloblastoma, endometrijskih rakov, mezenhimskih novotvorbe in liposarkomom raka [3-6]. Smo prej pokazali, da je ZIC1 gen močno navzdol reguliranih v želodčni rak tkiva in celičnih linij v primerjavi s tistimi običajnih želodca tkiv. Poleg tega ZIC1 potencialno služi kot tumorski supresorski z inhibicijo proliferacije celic v želodčnih in debelega rakavih celic [7, 8]. Kot pomemben transkripcijski faktor, ZIC1 je bistvenega pomena za ureditev ježa signalizacijo (hh), kostni morfogenetski protein (BMP), in Notch signalne poti v živčnem razvoj [2, 9]. Vendar pa je malo znanega o tem, kako ZIC1 regulira signalne poti in z njimi povezane nadaljnjim cilje v napredovanje raka.
Raka želodca je drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka svetu [10, 11]. Hh signalizacijo je eden od ključnih onkogenih poti signalizacije, vključenih v želodčnem karcinogeneze [12, 13]. Sonic ježa (Pst), član družine sesalcev HH [14], je bilo dokazano, da se tako povečana pri želodčnih tkiva raka, ki ga v situ hibridizacije testu in bistvenega pomena za napredovanje raka želodca [13, 15]. Hh signalizacija pot se aktivira s SHH vezavo z zakrpane (Ptch) - gladka (SMO) membranski receptor kompleks [16]. Aktivacija Pst spodbuja želodčne diferenciacijo rakavih celic in razmnoževanje. Ugotovljeno je bilo, da bi ZIC1 zmanjša izražanje PTCH1
in Pst
genov v živčnem tkivu med razvojem forebrain [17]. V nasprotju s tem je dokazano, da je Pst zatira izražanje ZIC1 pri razvoju nevralne cevi [18]. Kljub temu pa je vpliv ZIC1 na signalne poti HH raka želodca ostaja neznan.
ZIC1 ureja tudi številne cilje, vključno s ciklin D1, P27, Wnt1 in Wnt7a v razvoj živčevja v Xenopus ectodermal tkiva in mutiranih modelov miši [9, 19, 20]. Mi smo še posebej zanima regulatorjev celičnega cikla, pomembnih za raka celično proliferacijo in diferenciacijo. Smo prej pokazali, da čezmerno ZIC1 more spremeniti G1 /S prehoda v želodcu rakavih celic [8]. Več mehanizmi ciklin odvisnih kinaz (CDK), so vključeni v regulacijo G1 /S kontrolno točko v človeških raka [21]. Pri prehodu iz G1 v S fazo, ciklin D, ki predstavlja aktivni komplekse z CDK4 je reguliran z rakom želodca [22, 23]. Izguba ciklin odvisnih inhibitorji kinaz, kot p21 Waf1 /Cip1 in P27 Kip 1 spodbujajo CDK2 dejavnost in urejanje G1 /S prehoda [12, 24]. Nedavne študije so pokazale, da je mutant ZIC1 ali sila čezmernim ZIC1 uravnava izražanje p27 Kip 1 pri miših cerebelarne tkiv in liposarkom celic [3, 20]. Zanimivo je, da signalizacija pot Pst negativno uravnava p21 Waf1 /Cip1 in ciklin D1 v GLI1 odvisnega način [16, 25]. Vendar, ali lahko ZIC1 medsebojnega s SHH poti pri urejanju izplačil celičnega ciklusa ni določen. Pojasnitev te signalne mreže lahko zagotovi nadaljnji vpogled v vlogo ZIC1 raka želodca.
V naši tej raziskavi smo dokazati, da čezmernim ZIC1 zavira migracije želodčni rak celic in invazijo, kot tudi spreminja razdelitve na celico cikla. ZIC1 lahko transkripcijsko upocasnjujejo na Pst signalizacijo in zatreti raven phospholated Akt in ERK, kar vodi k ureditvi regulatorja celičnega cikla kinaz p21 Waf1 /Cip1, P27 Kip1 in ciklin D1 v želodčnih rakavih celic. Identificirali smo tudi več nadaljnjim ciljev pomembno ZIC1 v želodcu rakavih celic z analizo cDNA mikromrež.
Rezultati
ZIC1 zavira proliferacijo, migracijo in invazijo želodčnih rakavih celic PODJETJA
Za določitev vpliva ZIC1 na proliferacijo celic, smo izvedli analiza viabilnost celic, ki jih MTS testih v želodcu rakavih celic. Želodčne rakave celične linije (AGS, MKN28, BGC823 in SGC7901) so transfekciji s pCDNA3.1-ZIC1 ali pCDNA3.1 prazen vektor. Učinkovitost transfekciji je bila potrjena z RT-PCR in Western Blot zaporedju (slika 1A). Rezultati so pokazali, da je bilo število živih celic močno zavirajo zunajmaternične ekspresijo ZIC1 pri opazovanju s 5 dni v BGC823 celic (slika 1B). Ukinitev proliferacije celic s ZIC1 je ujemal s naših prejšnjih opazovanj v AGS in MKN28 raka želodca celic, kot tudi rakave celice kolona [7, 8]. Slika 1 ZIC1 zavira proliferacijo in migracijo na raka želodca. (A) želodca rakave celične linije (AGS, MKN28, BGC823 in SGC7901) je bilo stabilno transfekciji s pCDNA3.1-ZIC1 ali pCDNA3.1 prazen vektor. Je ekspresijski nivoji ZIC1 mRNA in proteina smo izvedli z RT-PCR (zgornji diagram) in Western blot (nizek diagram). GAPDH in β-aktina so bili uporabljeni kot notranjih kontrol. (B) viabilnost Celica rak celične linije želodca (BGC823) smo določili z MTS testom celične proliferacije. Zvezdica označuje statistično značilnost (** p < 0. 01). (C) migracije celic smo ocenili s spremenjeno Boyden transwell komore teste po inkubaciji 16 ur. Celice, ki prešli na dnu membrane, smo obarvali z DAPI. (D) je število vidnih migracijskih celic (povprečje ± S.D) je bila ocenjena s štetjem pet naključnih polj visoke moči (× 400 povečavo). Te poskuse smo izvedli v treh izvodih. Reprezentativne Podatki so prikazani. Zvezdica označuje statistično značilnost (*** p < 0,001).
Poleg tega smo ugotovili vlogo ZIC1 v celični migraciji in invazije na raka želodca. Cell migracije in invazijo teste smo izvedli v transwell migracije in Študiie obložene invazija testa s sistemi oz. Opazili smo, da ponovno izražanje ZIC1 bistveno zatreti migracijo celic v AGS, BGC823 in SGC7901 želodčnega raka celičnih linijah (P; 0,001) (slika 1C, D). Poleg tega ponovno izraz ZIC1 prikaže bistveno nižjo aktivnost celični invaziji v primerjavi s temi praznimi vektorske transfektanti v AGS celic (p < 0,05) (Dodatni datotek 1: Slika S1). Ti podatki kažejo, da ektopična ekspresija ZIC1 zavira migracije želodčni rak celic in invazijo.
ZIC1 spremeni porazdelitve celičnega cikla in uravnava izražanje ciklin-odvisne kinaze v želodcu rakavih celic
Za nadaljnje razumevanje mehanizme, ki podpirajo inhibicijo proliferacija celic s prekomerno ZIC1, smo ocenili razdelitve celičnega cikla v želodcu rakavih celic. V letnem pregledu rasti (42,74%) in SGC7901 (54,03%) celičnih linij po čezmerni ZIC1 opazili smo večji delež celic v G1 fazi. Vendar pa je v celicah, transfektiranih s kontrolnim vektorjem, je delež znižal tako v letnem pregledu rasti (32,66%) in SGC7901 (47.00%) in delež celic v S fazi je relativno večje (slika 2A). To je dobro sprejet, da je p21 (znan tudi kot p21 Waf1 /Cip1) in P27 (znan tudi kot p27 KIP1), dve glavni zaviralci ciklin-odvisne kinaze so potrebni za prenehanje v času vstopa v fazo S [26]. Aktivacija ciklin D1, pa je v glavnem odgovorna za urejanje G1-S fazni prehod v [23]. Pokazali smo, da je stopnja izražanje ciklina D1 proteina zmanjša, medtem ko so p21 in P27 izrazito inducirane pri rakavih celicah želodčne transfektiranih s pCDNA3.1-ZIC1 v primerjavi s tistim pCDNA3.1 praznih vektorskih transfektanti (slika 2b). Prav tako smo ocenili distribucij na celično apoptozo v pCDNA3.1-ZIC1 ali pCDNA3.1 vektorske transfektanti v AGS in MKN28 celic, vendar niso opazili nobenih očitnih razlik celične apoptoze (Dodatne datoteke 2: Slika S2). Zato ti rezultati potrjujejo, da prekomerna ZIC1 spremeni distribucij celičnega cikla z regulacijo ciklina odvisnih kinaz p21, p27 kot tudi ciklin D1 v želodcu rakavih celic. Slika 2 ZIC1 spremeni distribucij celičnega cikla z uredbo p21, p27 in ciklin D1 v želodcu rakavih celic. distribucij Cell cikel (A) so odkrili s pretočno citometrijo analizo AGS in SGC7901 celic po prehodni transfekciji s pCDNA3.1-ZIC1 ali pCDNA3.1 prazen vektor za 24 ur. (B) Za ekspresijski nivoji p21, p27 in ciklin D1 smo določili z Western blot. β-aktina je bila odkrita kot kontrolo obremenitve. Denzitometrija vrednosti so izražene kot kratno spremembo v primerjavi z vrednostmi pCDNA3.1 vektorskih nadzora normalizirale do 1. (c) izražanjem phospholated Akt in Erk1 /2, kakor tudi celotne Akt in Erk1 /2 so pregledal Western blot.
MAPK in PI 3K poti igrajo bistveno vlogo pri regulaciji kinaz celičnega cikla. Smo ocenili izražanje glavnih nadaljnjim efektor teh dveh poteh, Erk1 /2 in Akt, po stalni uvedbi pCDNA3.1-ZIC1 za AGS, MKN28, BGC823 in SGC7901 želodčne rakave celice (Slika 1A). Ugotovili smo, da so bile stopnje fosforilacijo Erk1 /2 in Akt dramatično zatreti s prekomerno ZIC1 v vseh zgoraj celičnih linijah testiranih (slika 2C). Ti rezultati kažejo, da se ureditev distribucije celic cylce s ZIC1 lahko posredovana skozi PI 3K in MAPK poti in njihovega navzdol ciklin-odvisne kinaze p21, p27 in ciklin D1 raka želodca.
ZIC1 zavira izražanje sonic ježa (Pst) v želodčnih rakavih celic
je molekularna karakterizacija pokazale, da ZIC1
cink-prstov domen in bi lahko izničili z GLI1 z vezavo na GC bogate sekvenc [2]. GLI1 je cilj povečanja dolvodno od jež (hh) signalnih poti, ki je bistvenega pomena za razvoj želodčnega raka in napredovanja [9, 27]. Domnevali smo, da se Hh signalizacijo pot lahko sodelujejo v uredbi ZIC1 želodčnega raka celic cikla in migracije celic. Za rešitev tega vprašanja, smo pregledali izražanje Sonic jež (SHH), ki je ključni član HH družine, v želodcu rakavih celic po čezmerni ZIC1. Ugotovili smo, da ponovno izraz ZIC1 učinkovito zmanjšuje Pst izraz v BGC823 in SGC7901 celičnih linij, ki jih zahodni blot analizo (slika 3A). Poleg tega je analiza RT-PCR je pokazala, da je stopnja prepis Pst tudi občutno navzdol reguliranih v rakavih celicah želodca transfekciji s ZIC1 glede na praznih vektorske transfektanti (p < 0,01) (slika 3B) (Dodatni datoteka 3: Slika S3). . Skupaj, naši rezultati kažejo, da lahko ZIC1 transkripcijsko uravnavajo izražanje Pst v želodčnih rakavih celic. Slika 3 ZIC1 inhibira ekspresijo Sonic hedgehog (Shh). (A) Izraz Pst beljakovin so analizirali z Western blot v BGC823 in SGC7901 celice stabilno transfekciji s pCDNA3.1-ZIC1 ali pCDNA3.1 prazen vektor. (B) raven izražanje Pst mRNA smo določili s sprotnim kvantitativno analizo RT-PCR. Relativni nivo izražanja je bila izražena kot kratno spremembo (povprečje ± SEM) v primerjavi z pCDNA3.1 praznim vektorjem normalizirane na 1.
Hedgehog (Hh) signalno pot, ki je vključen v uredbo ZIC1 celične cikla in migracije celic pri raku želodca celice
za določitev vpliva Pst na porazdelitev celic cikla, smo skušali preučiti učinke farmakološkim zaviralec HH signalizacijo na izražanje p21 in ciklin D1. AGS, BGC823 in SGC7901 želodčni rak celične linije smo obdelali z cyclopamine (10 uM), ki je steroidno alkaloid, ki sodeluje neposredno z SMO da inhibira HH signalizacije [28], ali nadzor DMSO 24 h. Opazili smo, da je nivo izražanja p21 močno navzgor regulirana, medtem ciklin D1 navzdol regulirano potem ko so tumorske celice obdelamo s cyclopamine (slika 4A). Pomembno je omeniti, da blokira signalno pot SHH z dajanjem cyclopamine ne vpliva na raven izražanja ZIC1 mRNA v BGC823 in SGC7901 celice po RT-PCR teste (slika 4b). Odsotnega ali nizko izražanje ZIC1 mRNA v želodčnih rakavih celic je predvsem meditiral s promotorja metilacije DNA, kot smo že prej opisali [8]. Slika 4 Hh signalizacijo pot sodeluje pri izražanju p21, ciklina D1 in regulacijo migracije celic. AGS, BGC823 in SGC7901 želodca rakave celice smo obdelali z cyclopamine (10 uM), ki je steroidno alkaloid, ki sodeluje neposredno z SMO da inhibira HH signalizacijo ali nadzor DMSO 24 h. (A) Raven izraz za p21 in ciklin D1 smo določili z Western Blot v letnem pregledu rasti, BGC823 in SGC7901 celic. (B) Raven izraz ZIC1 mRNA so proučevali z konvencionalne RT-PCR. (C) migracije celic smo ocenili s spremenjeno Boyden transwell komore testov. Celice, ki prešli na dnu membrane, smo obarvali z DAPI. (D) Povprečno število vidnih migracijskih celic (srednja vrednost ± S.D) je bila izračunana v petih naključno izbranih področjih visoke moči (x 400). Zvezdica označuje statistično značilnost (*** p < 0,001).
Smo ocenili tudi posledice Pst signalizacije o migraciji želodčni rak celic. Kot je prikazano na sliki 4, C in D, AGS, BGC823 in SGC7901 celičnih linijah raka želodca pokazale znatno zmanjšanje celične migracije po dajanju z cyclopamine (10 uM) za 24 ur (p < 0,01). Kolektivno, ti rezultati kažejo, da lahko ZICI modulirajo regulatorji v celico cikla in migracijo celic s SHH signalizacijo v želodcu rakavih celic.
Izražanje genov profil spremeni za zunajmaternične izražanja ZIC1
Sistematično določiti na nižji stopnji ciljev ZIC1, smo izvedli affymatrix oligonukleotid mikromrež v MKN28 želodčne rakavih celic z ali brez pCDNA3.1-ZIC1. Uporaba presečnim > 1,5-krat za statistično značilno, mikromrežni pokazala, da so 132 geni navzdol urejeno, medtem ko 66 geni so up-urejena z eksogeno izražanje ZIC1 (reprezentativnih genov je prikazano na sliki 5A). Mnogi geni, so poročali, da igrajo ključne vloge v celično proliferacijo, celično cikla in migracije celic glede na genske funkcionalne analize (http:.. //Www genecards org) (slika 5B). Na primer, dve ključni regulatorji celičnega cikla TP53INPI
in CDKN2B
se ugotovi, da je treba deregulirati v MKN28 celicah tranfected z pCDNA3.1-ZIC1. Naši rezultati kažejo, da ZIC1 potencialno ureja več na nižji stopnji genov, ki sodelujejo pri želodčnem tumorigeneze. Slika 5 sprememb v izražanju genov profil po zunajmaternične izražanje ZIC1. (A) Z izrazom profili genov v pCDNA3.1-ZIC1 ali praznih pCDNA3.1 vektorski stabilnih transfektanti smo analizirali s cDNA mikromrež v MKN28 celicah. Reprezentativne geni so prikazane na desni strani toplotnem zemljevidu slike z uporabo cut-off > 1,5 ali < -1,5 Krat kot pomembno razliko ,. (B) genov, ki sodelujejo v celičnem ciklusu, celično proliferacijo in migracijo celic po genov funkcionalne analize (http:.. //Www genecards org) so predstavljeni. Relativna sprememba krat je izražena z razmerjem pCDNA3.1-ZIC1 v primerjavi s kontrolo pCDNA3.1. (C) sistemsko razumevanje poti za ZIC1 ureditve signalizacije in ciljni geni za razvoj in napredovanje raka želodca.
Razprava
vse več dokazov, je pokazala, da je ZIC1 sodeluje pri napredovanju več tumorjev [3-8] . Zdi se, da je ZIC1 odklonsko izražena v nekaterih vrstah raka in diferencialnega funkcij kot zaviralnih ali onkogenih gena. Na primer, so poročali ZIC1 izraz nizka ali odsoten v prebavilih in pljučnega raka celičnih linijah, in je bilo zatreti gastrointestinalno rakavih celic proliferacijo [7, 8, 29]. V nasprotju s tem je bilo ugotovljeno, čezmernim ZIC1 v liposarkoma spodbujajo celično proliferacijo in invazijo [3]. Mi in drugi so pokazali, da se lahko epigenetske modulacije, vključno z metilacijo DNA in histon preoblikovanja in genskih mutacij prispevajo k njeni razlika ekspresijskih vzorcev pri rakih [3, 4, 7, 8]. Jasno postaja, da kot cinkov prst transkripcijskega faktorja, lahko ZIC1 modulirajo več nadaljnjim genov v živčnem tkivu, kolorektalnega raka in liposarkomom celic [2, 3, 7, 9]. Vendar pa je malo znanega o mehanizmu osnovni ZIC1 funkcije v razvoj in napredovanje raka želodca. Je poudarila glavne poti in prodajnih ciljev, ki jih ZIC1 urejena lahko olajša razumevanje svoje vloge v tumorigeneze. Tukaj smo pokazali, da je čezmerno ZIC1 posledico znatno inhibicijo preživetja celic in oslabitev migracije celic. ZIC1 zavira signalnih poti na Pst, PI3K in MAPK, ki so ključnega pomena za ureditev izplačil celičnega cikla in migracije celic raka želodca. Poleg tega ZIC1 zavira celično cikla regulativne kinaz, p21, p27 in ciklin D1, kar je pripeljalo do G1 /S celičnega ciklusa tranzit v želodčnih rakavih celic. ZIC1 zavira signalno pot SHH, ki je ključnega pomena za ureditev izplačil celičnega cikla in migracije celic raka želodca.
MAPK in PI 3K poti igrajo ključne vloge v celično proliferacijo, diferenciacijo in napredovanje v različnih človekovih raka [30]. Nedavno je bilo tudi poročali, da so aktiviranje obeh poti bistvena za induciranje vstop celičnega cikla [30, 31]. Med tem procesom, ciklin odvisno zaviralci kinaze p21, P27 in ciklin D /E sodelujejo pri urejanju p53 inducirane ustavitev celičnega cikla [24, 32]. Aktiviranje MAPK in njene prodajnem kinaze-ERK ne more povzročiti le indukcijo ciklina D1 in skozi G1 /S kontrolne točke, ampak tudi kopičenje p21, ki zavira ciklin E /CDK2 komplekse blokirati vstop S-fazo [30] . PI 3K /Akt pot lahko inaktivirajo GSK3-beta in FOXO transkripcijske faktorje, s čimer zavira ciklin D1, medtem ko povzroči p27 in p21 pri regulaciji vstopa celičnega cikla [31]. Pokazali smo, da ponovno izražanje ZIC1 učinkovito inaktivirajo fosforilirano Akt in Erk1 /2 v AGS, MKN28, BGC823 in SGC7901 želodčni rak celičnih linij. V zvezi s tem je bil aktiviran p21 inhibitor CDK1, medtem ciklin D1 inaktiviramo po prekomerno ZIC1 v želodcu rakavih celic. Čeprav je treba rezultate treba potrditi v prihodnjih študijah so naši miroarray podatki so pokazali, da so drugi ključni elementi regulatorjev celičnega ciklusa kinaze vključno TP53INPI
in CDKN2B
, deregulacije s prisilno izražanje ZIC1 v posameznem MKN28 želodčne celice raka linijo (slika 5 A in B). Zato predlagamo, da ZIC1 ureja G1 /S prehoda predvsem skozi PI 3K in MAPK poti in celic cikla regulator kinaz nižji stopnji v želodcu rakavih celic.
Še ena pomembna ugotovitev v naši te študije je, da ZIC1 transkripcijsko ureja Sonic jež (Pst) signalizacijo v želodčnih rakavih celic. Poleg svoje osrednje vloge o ureditvi morfogenezo želodčne žlez v človeškem želodcu, je Pst signalizacijo sodeluje tudi pri patogenezi raka želodca [16, 33]. Tiho je pogosto aktivira v naprednih želodčnih adenokarcinomov in povezana z agresivnostjo tumorja [13, 15, 33]. Prejšnje študije so pokazale, da Pst signalizacijo spodbuja gibljivost in invazivnosti želodčnih rakavih celic skozi TGF-beta-ALK5-Smad3 poti [34]. Pssst signalizacijo lahko tudi regulira izražanje p21 in ciklin D1 v Gli-odvisne poti [16, 25]. Opazili smo, da je zaviranje Pst signalizacijo uprava z cyclopamine zavira AGS, BGC823 in SGC7901 želodčne migracije rakavih celic in uravnava izražanje p21 in ciklin D1 (slika 4). Ti rezultati so skladni s prej opisanih študijah [25, 34]. Tako smo razkrili, da ZIC1 igra pomembno vlogo v želodcu napredovanje raka z uredbo signalne poti ššš.
ZIC1 lahko določijo ciljne gene, tako zaporedje, posebne in neodvisne načine [9]. ZIC1 bi lahko urejal transkripcijski izražanje ciljev, vključno s ciklin D1, p27, Wnt1 in Wnt7a, in modulirajo zarezo in BMP poti v živčnem razvoj [2, 9]. ZIC1 bi lahko izničili gli z vezavo na GC bogate sekvenc, in zatreti izražanje Gli veže zaporedju usmerjena reporter genov [9, 35]. Identificirali smo več Žic potencial ciljnih genov v želodcu rakavih celic z analizo mikromrež. Ti cilji so tesno povezani s celičnem ciklusu, celično proliferacijo in migracijo (slika 5b). Povezava med Žic in spodnjem toku ciljev bi lahko bil namig za razumevanje potencialne perspektivo Žic beljakovin v napredovanje raka želodca.
Sklepe
kratko, predlagamo model, ki predstavlja poti, preko katerih ZIC1 prispeva k rakom želodca napredovanje (slika 5C). Čezmernim rezultatov ZIC1 v zatiranje Hedgehog (hh) signalizacijo in njenih nadaljnjim ciljev, vključno s p21, p27 in ciklin D1. Kot faktor cinkov prst transkripcijskega, ZIC1 tudi lahko modulira transkripcijsko izražanje tarčnih genov neposredno vezavo na sekvenc GC-bogati [2], s čimer deluje kot tumorski supresorski z inhibicijo celične proliferacije, celični migraciji in invazije raka želodca.
Metode
so celične kulture in zdravljenje
človeškem želodcu raka celičnih linijah (AGS, MKN28, BGC823 in SGC7901), pridobljeni iz Riken genske banke (Japonska) in American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, ZDA ). Vse celične linije smo kultivirali v RPMI 1640 medija (Invitrogen, CA, ZDA), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (FBS) in inkubirali pri 5% CO 2, 37 ° C in 95% vlagi. Želodčni rak celične linije (AGS, BGC823 in SGC7901) smo obdelali z 10 mikrometrov z cyclopamine (Sigma, St. Louis, MO, ZDA) v DMSO 24 ur. Ekvivalentna koncentracija nosilca (DMSO) smo uporabili kot kontrolo.
Celic transfekciji
bili AGS, MKN28, BGC823 in SGC7901 celice kultiviramo 24 ur v 6-vdolbinicami in transfektirali z pCDNA 3,1-ZIC1 ali pCDNA 3.1 prazen vektor uporabo Fugene HD (Roche), v skladu z navodili proizvajalca. Po 48 urah so se transfektanti stalno izbrana v RPMI 1640 medija, ki vsebuje G418 (200-400 pg /ml) (Merck, Nemčija) za 14 dni.
RT-PCR in kvantitativnega PCR v realnem času analize
Total RNA ( 1 mikrogramov) ekstrahiramo s TRIzola reagenta (Invitrogen) naslednje navodili proizvajalca reverzno transkripcijo v cDNA z M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit (Takara, Japonska). Ravni prepis ZIC1 in Tiho so bili določeni z običajnim RT-PCR z Takara Taq polimerazo (Takara, Japonska) ali kvantitativni PCR v realnem času (QRT-PCR), s SYBR Green Master Mix Kit (Takara, Japonska) v ABI 7500 sistem PCR. Primerji, ki se uporabljajo za ZIC1 bili F: 5'-AAACTGGTTAACCACATCCGC in R: 5'-CTCAAACTCGCACTTGAAGG. Tiho sta F: 5'-GTAAGGACAAGTTGAACGCTTTG in R: 5'-GATATGTGCCTTGGACTCGTAGTA. Gliceraldehid-3, smo phosohate dehidrogenaza (GAPDH) uporablja kot notranje kontrole. Ravni prepisovali so izražene kot 2 -ΔΔCt vrednosti in relativne spremembe izraz krat normaliziran GAPDH.
Sposobnost preživetja celic testa
je sposobnost preživetja celic odkrite z nonradioactive proliferacije celic s 3- (4,5- dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenil) -2 H-tetrazolijevega (MTS) reagentov (Promega, Madison, ZDA). Stabilno transficirane celice zasadimo v 96-vrtino (celic 2000 /jamico) 6 h, 24 h, 72 h in 120 h. Absorbanco smo izmerili pri 490 nm po 1 h inkubaciji z CellTiter 96 Vodna One Solution reagenta.
Cell-cikel in analiza apoptoza celic
distribucij Cell cikla so zaznana s pretočno citometrijo analize. Transfektiranih s pCDNA3.1-ZIC1 ali pCDNA3.1 prazen vektor smo zbrali in sprali s PBS. Cellular DNA smo obarvali z celični cikel Raztopino za obarvanje, ki vsebuje propidijevim jodidom (PI) pri 4 ° C v temi. Celični ciklus smo določili ob uporabi FACS Calibur in analizirali s programsko opremo ModFitLT (Phoenix, ZDA).
Celično apoptozo smo izvedli z uporabo FITC aneksinom V apoptoze Detection Kit II (BD Pharmingen) s pretočno citometrijo analizo. Prehodno transficirane celice smo suspendirali v aneksinom V vezavnem pufru. Nato dodamo FITC aneksin V. in PI rešitve v zaporedju. Po inkubaciji za 15 minut, FACSCAN so obarvane celice analiziralo tok citometrija (Becton Dickinson, ZDA).
Cell migracije in invazijo testi
Cell migracije je bila ocenjena z modificiranim Boyden transwell komore testa (vrtanje, ZDA). Na kratko, smo kultivirali celic v mediju brez seruma 24 ur in 5 x 10 4 celice zasadimo na zgornjo komoro v 300! Li mediju, ki vsebuje 5% FBS. Po 16 urah inkubacije, so bile brez migracijski celic v zgornji komori previdno odstranimo z vato. Preselili Celice smo obarvali z DAPI Raztopina za obarvanje. Številke celic so bili naključno štejejo v petih področjih (× 400 povečavo).
Cell invazija je bila izvedena v Millipore 24 tudi prevlečeni z BD Matrigel. Po stradanja v mediju brez seruma za 24 ur, 1 x 10 5 celice zasadimo na zgornjo komoro pri 300 p.L mediju, ki vsebuje 5% FBS, medtem ko je spodnja komora napolni z 600 p.L gojišča z 15% FBS. Potem ko je bila inkubirana pri 30 h, smo membrane inkubirali s celic Stain raztopino (Millorpore, ZDA). Zmes barvilo speremo s ekstrakcijskega pufra in prenese v 96-vrtino za kolorimetrično merjenje pri 560 nm.
Western analizo blot
bile Skupaj beljakovin, pridobljen iz celic z uporabo radio-imuno test liznega pufra dopolnjen z zaviralcem proteaze. Lizati je bilo rešenih na 6-12% SDS-PAGE minigels in prenese na PVDF membrano (Millipore, Bedford, MA). Membrane so bili blokirani v 5% mleka z TBST in inkubirali pri 4 ° C čez noč z naslednjih protiteles: ZIC1 (1: 500; Abcam), fosfo-Akt (1: 1000; Cell signalizacija), Akt (1: 500; Abcam), fosfo-Erk1 /2 (1: 1000; Cell signalizacija), Erk1 /2 (1: 1000; Cell signalizacija), p21 Waf1 /Cip1 (1: 1000; Cell signalizacija), P27 Kip1 (1: 500; Epitomics), ciklin D1 (1: 1000; Cell signalizacija) in Pst (1: 1000; Cell signalizacija). V skladu s tem so bili sekundarni protitelesa skupaj s hrenovo peroxidise (HRP) vizualizira uporabo kemiluminscenco z Las-4000 Imaging sistema (Fujifilm, Japonska). Relativne gostote proteinov smo kvantificirali s slike J. programsko opremo in normalizirajo na beta-aktin. (1: 2500, Multisciences Biotech)
cDNA mikromrežnem analizi
Celotno RNA smo izolirali iz MKN28 celice stabilno transficirane z pCDNA3.1 -ZIC1 ali pCDNA3.1 prazen vektor in je bil reverzno prepisana na cDNA. Označeni vzorci hibridiziramo z Agilent celoten človeški genom, ki vsebuje več kot 41.000 sonde (http:.....? //Www NCBI NLM nih gov /geo /izraz /acc cgi acc = GSE38924). Podatki o mikromrež smo analizirali z Agilent za kopiranje programske opreme. Izbrali smo kratno spremembo ≥ 1,5 ali ≤ -1,5 kot pomembna razlika je bila opravljena.
Statistična analiza
testa t
Študentske za primerjavo dveh neodvisnih podatkov, Chi-square ali Fisher natančen preizkus, medtem ko je bila uporabljena za analizirati kategorični spremenljivk. Presek p < 0.05 je bila uporabljena za statistične pomembnosti.
Opombe
Jing Zhong, Shujie Chen prav tako prispevali k temu delu.
Izjave
Potrditev
Projekt je bil podprt s National Natural Science Foundation Kitajske (30900676, 81071961), National Temeljni raziskovalni program Kitajske (973 Program) (2012CB945004) ter znanost in tehnologijo Ključni projekt province Zhejiang na Kitajskem (2009 C03012-3). Avtorji se zahvaljujejo prof Tianhua Zhou in prof Lei Guo za koristne predloge in razprave; . In Thomas R. Austin za kritični pregled in urejanje rokopisa
Electronic dodatnega materiala
12885_2011_3201_MOESM1_ESM.tiff Dodatna datoteka 1: Slika S1. GAPDH smo uporabili kot notranje kontrole.
Odpornost proti antibiotikom se podvoji v samo dveh desetletjih
Neil Bell imenovan za glavnega razvojnega direktorja Avacta Life Sciences
Uporaba FLUOstar Omega za preučevanje novih črevesnih bakterij, ki lahko vplivajo na naše zdravje
Bakteriofagi lahko zdravijo E. coli, ne da bi poškodovali črevesje,
Ali se lahko protivirusne spojine, pridobljene iz mikroalg, borijo proti SARS-CoV-2 in drugim virusom?
Mikrobiom semenčic, odkrit s sekvenciranjem RNA
Študija povezuje porabo fermentirane zelenjave z nizko smrtnostjo zaradi COVID-19
Zanimiva nova študija raziskovalcev v Evropi kaže, da bo umrljivost zaradi koronavirusa 2019 (COVID-19) verjetno nižja v državah, kjer je prehrana bogata s fermentirano zelenjavo. Študija:Po
Težave z rastjo pri nedonošenčkih, povezane s spremenjenimi črevesnimi bakterijami
Nedonošenčki, ki ne rastejo po pričakovanjih ali uspevajo, imajo lahko težave z razvojem svojega mikrobioma, kaže nova študija. Skupina raziskovalcev iz otroške bolnišnice Ann &Robert H. Lurie v Chi
Perfectus Biomed bo razstavljal na konferenci IPS v Liverpoolu
Ekipa Perfectus Biomed bo ta mesec razstavljala na konferenci Društva za preprečevanje okužb (IPS) v Liverpoolu. Konferenca bo potekala v dvorani Arena in Convention Center v Liverpoolu od 22. do 24.