PLOS ONE: kliniska betydelsen av MIR-137 uttryck hos patienter med magcancer Efter Radical Gastrectomy

Abstrakt

dysreglering av MIR-137 spelar viktiga roller i onkogenes och utvecklingen av olika typer av cancer, men dess roll i prognosen av gastric cancerpatienter förblir okänd. Denna studie var utformad för att undersöka uttrycket och prognostiska betydelsen av MIR-137 i mag cancerpatienter efter radikal gastrektomi. Kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) utfördes för att utvärdera uttrycket av MIR-137 i humana gastriska cancercellinjer och vävnader hos patienter med magcancer. Resultat bedömdes för association med kliniska faktorer och total överlevnad med hjälp av Kaplan-Meier-analys. Prognostiska värden för MIR-137 uttryck och kliniska resultat utvärderades av Cox regressionsanalys. Resultaten uppvisade att uttrycksnivån för MIR-137 minskades i humana gastriska cancercellinjer och vävnader, och ned-regleras uttrycket av MIR-137 var associerat med tumörcelldifferentiering, N skede och TNM stadium. Minskad miR-137 uttryck i magcancer vävnader positivt korrelerad med dålig överlevnad av patienter med ventrikelcancer. Ytterligare multivariat Cox regressionsanalys föreslog att MIR-137 uttryck var en oberoende prognostisk indikator för magcancer med undantag för TNM stadium. Tillämpning av prognostiska värdet av MIR-137 uttryck för TNM stadium III gruppen visade en bättre riskstratifiering för total överlevnad. Sammanfattningsvis, förstärkt resultaten den kritiska roll för nedregleras miR-137 uttryck i magcancer och föreslog att MIR-137 uttryck kan vara en prognostisk indikator för denna sjukdom. Dessutom kan dessa patienter med TNM stadium III magcancer och låg MIR-137 uttryck behöver mer aggressiv postoperativ behandling och närmare uppföljning

Citation. Gu Q, Zhang J, Hu H, Tan Ye, Shi S, Nian Y (2015) kliniska betydelsen av MIR-137 uttryck i patienter med magsäckscancer efter Radical Gastrectomy. PLoS ONE 10 (11): e0142377. doi: 10.1371 /journal.pone.0142377

Redaktör: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN

emottagen: 14 augusti 2015; Accepteras: 21 oktober, 2015; Publicerad: 6 november 2015

Copyright: © 2015 Gu et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

datatillgänglighet: Alla relevanta uppgifter är inom pappers-

finansiering:.. författarna har inget stöd eller finansiering för att rapportera

konkurrerande intressen. författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Kina är ett av de länder som har den högsta förekomsten av magsäckscancer och står för mer än 40% av alla nya fall i hela världen [1,2]. Trots aggressiv terapi tenderar prognosen för avancerad magsäckscancer i Kina att vara dyster [3,4]. För närvarande är tumör nod-metastas (TNM) stadieindelning systemet för UICC /amerikanska kommittén för cancer (UICC /AJCC) den viktigaste prognostiska faktorn för magcancer [5]. Men eftersom det inte finns heterogenitet på molekylär nivå av magcancer, räcker det inte att bara förlita sig på TNM scenen för att förutsäga prognosen för magcancer [6]. Därför, identifiering av molekylära markörer som är prediktiva för magcancer aggressivitet och prognosen för patienten som komplement till TNM stadium har potential att förbättra förmågan att behandla patienter och kan ge kliniskt relevanta insikter av betydelse i sjukdomsbehandling. Dessutom väljer de patienter som kan dra störst från precisionsbehandling är tänkt som det bästa sättet att sänka dödligheten i magcancer förutom kirurgi.

MicroRNAs (miRNA) är små endogena 19-25 nukleotider icke-kodande RNA som reglerar genuttryck post transkription genom basparning med 3'-otranslaterade regionen (3'-UTR) av mål budbärar-RNA (mRNA), som resulterar i mRNA nedbrytning eller hämning av translation [7]. I många humana cancerformer, kan miRNA fungera såsom onkogener eller tumörsuppressorgener för att undertrycka translation eller inducera mRNA nedbrytning beroende på naturen av sina mål [8]. Tidigare studier har visat att uttrycket av MIR-137 är nedregleras och betraktas som en prognostisk markör i olika typer av cancer, inklusive lungcancer [9], kolorektal cancer [10], äggstockscancer [11], multipelt myelom [12] , gastrointestinal stromal tumör [13], glioblastom [14], och skivepitelcancer i huvud och hals [15]. Det har nyligen visat att MIR-137 uttryck minskade signifikant i magcancer vävnader, och undertryckandet var samtidigt med svårighetsgraden av sjukliga förändringar, vilket tyder på potentiella tumörsuppressor roll miR-137 i magcancer [16]. Emellertid har en omfattande analys av uttryck av MIR-137 i korrelerad till prognosen av gastric cancerpatienter inte utförts och inväntar ytterligare belysning.

Huvudmålet för denna forskning är att utvärdera förhållandet mellan uttrycket av miR -137 och total överlevnad av gastric cancerpatienter i ett försök att identifiera prognostiska betydelsen av mIR-137 uttryck. Resultaten från denna studie utställning som uttrycksnivån för MIR-137 var nedreglering i magcancer celler och vävnader, och MIR-137 uttryck var en oberoende prognostisk indikator för magcancer.

Material och metoder

Etik uttalande

Denna studie har granskats och godkänts av Institutional Review Board i den andra Anslutna sjukhuset i Xi'an Jiaotong University och The Anslutna sjukhuset i Yan'an University (Shanxi-provinsen, Kina). Alla deltagarna i studien, eller deras vårdnadshavare, förutsatt informerat skriftligt samtycke före studieregistrering.

Cellodling

Immortaliserade normala humana gastrisk epitelceller linje GES-1 och fem humana magcancer-cellinjer, inklusive MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC-803, och AGS, erhölls direkt från Shanghai Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Alla dessa celler odlades rutinmässigt och bibehölls i RPMI-1640 (Gibco) kulturmedium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (Invitrogen) vid 37 ° C i en fuktad cellinkubator med en atmosfär av 5% CO _2.

kliniska prover

Färska magsäcks vävnader och intilliggande normala vävnader samlades från två oberoende uppsättningar omfattande 154 patienter med magcancer. Alla patienter som ingick i studien var genomgick radikal gastrektomi (R0 resektion enligt UICC /AJCC och D2 lymfkörtlar). Prover av träningsmängden (n = 67) erhölls mellan januari 2005 och december 2009 från den andra Anslutna sjukhuset i Xi'an Jiaotong University (Shanxi-provinsen, Kina), och exemplar av validerings set (n = 87) erhölls mellan januari 2008 och december 2010 från Anslutna sjukhuset i Yan'an University (Shanxi-provinsen, Kina). Prover var snabbfrystes i flytande kväve fram till användning. Prover på nytt av två patologer självständigt, och i vilket skede av magsäckscancer klassificeras enligt TNM scensystemet i UICC /AJCC [5]. Patienter exkluderades om de tidigare hade utsatts för någon målinriktad terapi, strålbehandling, kemoterapi och /eller interventionsterapi för magcancer.

QRT-PCR

Totalt RNA innehållande miRNA extraherades från odlade celler eller vävnader med användning miRNeasy Mini Kit (Qiagen). cDNA syntetiserades med användning av miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen) genom att följa tillverkarens instruktioner. Omvänd transkription genomfördes med användning av 50 ng total-RNA med en primer som är specifik för MIR-137, tillsammans med SYBR Green mikroRNA omvänd transkription kit. miRNA kvantifierades med användning av SYBR Green miRNA QRT-PCR-analys enligt tillverkarens protokoll (Applied Biosystems). Den QRT-PCR-reaktionen utfördes på en 7500 Snabb realtidssystem (Applied Biosystems). Alla kvantitativa RT-PCR utfördes i triplikat. Data analyserades med användning av en automatiserad baslinjen. Tröskelcykeln (Ct) definierades som den fraktionella cykelantalet vid vilket fluorescensskridit det givna tröskelvärdet. De data som erhållits från QRT-PCR analyserades med ΔΔCt metoden (2 ^{ΔΔCt). PCR-primrarna uppsättningar som används här för MIR-137 designades enligt följande: miR-137 framåtriktad primer: 5'-GCGCGC TTATTGCTTAAGAATAC-3 ', och omvänd primer: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. U6 användes som en intern kontroll och amplifierades med framåtriktad primer: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 ', och omvänd primer: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'.}

Statistisk analys

Statistisk analys var utförs med hjälp av GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA) och SPSS 19.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Den totala överlevnaden definierades som tiden mellan den första dagen av diagnos och datum för cancerrelaterad död eller den sista uppföljningsbesök. Pearson χ ^{2 eller Fishers exakta test användes för att analysera förhållandet mellan MIR-137 uttryck och kliniskt patologiska faktorer. Kumulativa överlevnaden beräknades av Kaplan-Meier-metoden och skillnaderna mellan undergrupperna undersöktes av log-rank test. Siffror i riskzonen beräknades för början av varje tidsperiod. Den prognostiska värdet av MIR-137 uttryck bestämdes genom univariat och multivariat analys. Alla P-värden var dubbelsidigt, och P < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant}

Resultat

Expression analys av MIR-137 i humana gastriska cancerceller

För. att fastställa expressionsnivån av mIR-137 i humana gastriska cancerceller, vi först utvärderas miR-137-expression genom QRT-PCR i immortaliserade normalt humant gastriskt epitelcellinje GES-en och fem humana gastriska cancercellinjer, inklusive MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC-803, och AGS. Som visas i figur 1 A, mänskliga gastric cancerceller uttryckte betydligt lägre nivåer av MIR-137 än GES-1. Tillsammans står dessa observationer tyder på att MIR-137 uttryck minskas i gastric cancerceller jämfört med odödlig normal human gastrisk epitelceller, och minskade miR-137 uttryck kan vara relaterade till onkogenes av magcancer.

Samband mellan mIR-137 uttryck och clinicopathologic faktorer

uttrycksnivåer av mIR-137 var vidare mäts för att analysera deras relation med clinicopathologic faktorer. Patienterna delades in i högt och lågt uttryck grupp enligt förhållandet mellan deras normala /cancer vävnads median expressionsnivåer av MIR-137 enligt resultaten av QRT-PCR (cut-off-förhållande = 1,5). Och enligt kriteriet, ca 56,72% (Utbildning set, 38 av 67) och 49,43% (Validering set, 43 av 87) tumörer bedömdes som låg miR-137 uttryck. Såsom visas i tabell 1, var expressionen av MIR-137 signifikant associerade med tumörcelldifferentiering (P = 0,009 och P = 0,002, respektive), N steg (P = 0,019 och P < 0,001, respektive), och TNM steg (P = 0,007 och P = 0,007 respektive) i de två oberoende uppsättningar. Dessutom, i övningsuppsättningen, miR-137-uttryck också signifikant relaterade till T-steget (P = 0,002). I övrigt ser procent av patienter med låg MIR-137 uttryck ökade tillsammans med sjukdomsprogression från TNM stadium I-III i de två oberoende uppsättningar (Fig 1B och 1C).

Prognostic värde av MIR-137 uttryck hos patienter med magcancer

för att ytterligare undersöka det prognostiska värdet av mIR-137 uttryck i gastric cancerpatienter, jämförde vi total överlevnad enligt mIR-137 uttryck, och Kaplan-Meier överlevnadsanalys utfördes. Som visas i figur 2, patienter med låg MIR-137 uttryck visade signifikant kortare överlevnad än de höga som i de två oberoende uppsättningar (P < 0,001 och P < 0,001, respektive), vilket indikerade en viktig påverkan miR-137 uttryck på kliniska resultat i gastric cancerpatienter. Dessutom analyserar univariat för total överlevnad i denna studie uppvisade att låg MIR-137 uttryck är en betydande negativ prognostisk prediktor för patienter med magcancer i träningsmängden (hazard ratio [HR], 6,30; 95% CI, 2,17-18,27; P = 0,001) och validering set (HR, 3,74; 95% CI, 1,81-7,73; P < 0,001). Dessutom, tumörcellsdifferentiering (P = 0,023 och P = 0,048, respektive), T-steget (P = 0,002 och P = 0,012, respektive), N steg (P = 0,004 och P = 0,001, respektive), TNM steg (P < 0,001 och P < 0,001, respektive) alla också påverkas avsevärt överlevnaden av magcancer (tabell 2). Dessutom var Cox multivariata regressionsanalyser utförs för att härleda oberoende uppskattningar Risker relaterade till överlevnad. Som framgår av följande tabell 3, TNM stadium och MIR-137 uttryck båda betraktas som självständiga och betydande prognostiska parametrar i två oberoende uppsättningar (Training set: TNM stadium: HR, 12,83, 95% CI, 3,48 till 47,30, P < 0,001; mIR-137 uttryck: HR, 6,80; 95% CI, 2,06-22,48, P = 0,002; Validering set: TNM stadium: HR, 5,21; 95% CI, 2,04-13,31, P = 0,001; mIR-137 uttryck: HR, 2,41; 95% CI, 1,13-5,11,. P = 0,023 respektive) katalog

Stratifierat analys på TNM scenen

för att bestämma huruvida mIR-137 uttryck kan skikta patienter med olika TNM stadium stratum, gjorde vi skiktade analyser av gastric patienter med TNM stadium i + II och TNM stadium III cancer och utvärderat prognostiska värdet av mIR-137 uttryck i två oberoende uppsättningar respektive. Som anges i tabell 4, bara gastric patienter med TNM stadium III kan stratifieras av MIR-137 uttryck betydligt, prognosen för TNM stadium III gastric patienter med högt MIR-137 uttryck Cancer var betydligt bättre än de med låg MIR-137 uttryck i de två oberoende uppsättningar (Utbildning set: P = 0,006, validering set: P = 0,016 respektive, Fig 3).

Diskussion

Kina är fortfarande ett av de länder som har högst incidens av magcancer även om det i många industriländer har minskat under de senaste årtiondena och framskridet stadium sjukdomen redan är närvarande i den stora majoriteten av patienterna [1,2,4]. För närvarande är TNM av UICC /AJCC den viktigaste prognostiska faktorn för magcancer [5]. Men eftersom det inte finns heterogenitet på molekylär nivå av magcancer, räcker det inte att bara förlita sig på TNM scenen för att förutsäga prognosen för magcancer [6,17]. Därför, identifiering av molekylära markörer som är prediktiva för magcancer aggressivitet och prognosen för patienten som komplement till TNM stadium har potential att förbättra förmågan att hantera patienter och kan ge viktiga kliniskt relevanta insikter sjukdomsbehandling. Dessutom väljer de patienter som skulle kunna dra störst från precisionsbehandling och riktade behandlingar är tänkt som det bästa sättet att minska dödligheten i magcancer. Forskning kring förhållandet mellan miRNA och magcancer har gradvis fått uppmärksamhet från forskare inom allmän kirurgi fältet och denna forskning har blivit ett viktigt forskningsområde under senare år [7]. I den aktuella studien, utvärderade vi uttrycksnivån för MIR-137 i humana gastriska cancercellinjer med kvantitativ realtids-PCR, uppvisade resultat som mänskliga gastric cancerceller, inklusive MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC- 803, och AGS, uttryckte betydligt lägre nivåer av mIR-137 än GES-1, som är en odödlig normal human gastrisk epitelceller linje. Detta resultat visade att onormal miR-137 uttryck kan ställas i relation till onkogenes av gastric cancer. Men klargöra den underliggande mekanismen av dysreglering av MIR-137 i magcancer celler och vävnader väntar ytterligare utredning.

Samma med andra miRNA, har det rapporterats att MIR-137 nära korrelerade med bildandet och utvecklingen av humana cancerformer [8,18]. Som viktiga komponenter i genreglering i många humana cancerceller, kan MIR-137 reglerar olika gener och påverka sina funktioner i många cellulära vägar. Celltillväxt och migration av bröstcancer kan undertryckas av MIR-137 genom att undertrycka östrogenrelaterade receptor a (Erra) [19]. Medan, i kolorektala cancerceller, ektopisk miR-137 expression också kan gripa cellcykeln, undertrycka celltillväxt, och inhiberar cellinvasion genom inriktning celldelning kontrollprotein 42 homologen (Cdc42) [20]. Nyligen Wu et al. indikerade att Mir-137 fungerade som tumörsuppressor på gastric cancerceller genom att rikta EKT2 och ytterligare påverkar Bad och GSK-3β, och potentiellt involverade i tumörbildning och metastas av magcancer [16]. Zheng och hans kollegor visade att ektopisk expression av MIR-137 var tillräckligt för att inhibera gastrisk cancercellproliferation [21]. Dessutom Steponaitiene R et al. uppvisade att MIR-137-metylering är en frekvent händelse i gastrointestinal cancer som förekommer i början av stegvis under gastric cancer och omvänt korrelerar med global metylering [22]. De ovan nämnda studier bekräftade att miR-137 spelar en roll som liknar tumörhämmande miRNA. Men alla dessa undersökningar huvudsakligen utförs i magsäckens cancercellinjer, har förhållandet mellan expressionsnivån av MIR-137 och de kliniska karakteristiska faktorerna för patienter med magcancer inte fastställts. I det aktuella forskningen, utvärderade vi sambandet mellan uttrycket av MIR-137 och prognos av patienter med magsäckscancer efter radikal gastrektomi, och fann att MIR-137 uttryck var en oberoende prognostisk faktor för den totala överlevnaden av dessa patienter utöver TNM stadium och prognosen för patienter med låg mIR-137 uttryck var betydligt sämre än de med hög. Såvitt vi vet är detta den första studien att identifiera MIR-137 uttryck som en självständig dålig prognostisk faktor för total överlevnad av patienter med ventrikelcancer efter radikal gastrektomi. Baserat på detta villkor, med tillämpning av prognostiska värdet av MIR-137 uttryck för TNM stadium III gruppen visade en bättre riskstratifiering för total överlevnad hos patienter med långt framskriden magcancer. Dock bör potentiella byte av klinisk praxis valideras i en randomiserad kontrollerad studie i framtiden.

Hittills eftersom miRNAs representerar en ny hotspot cancerforskning, det finns ett ökat intresse i förhållande till de miRNA svar miljöexponeringar och livsstil, inklusive social status, levnadsförhållanden och levnadsvanor, såsom rökning och alkoholkonsumtion. Stánitz E et al. visade att MIR-21 och MIR-143 var upp-reglerade, och MIR-34a var nedregleras i prover av magcancer i västvärlden [23]. Mot bakgrund av dessa villkor, om MIR-137 underexpression observeras också i magcancer prover från patienter från västländerna måste utvärderas i framtiden. Dessutom kan magcancer av samma histopatologi från olika geografiska regionens befolkning visar differential miRNAs och proteinuttrycksmönster, som kan bli följden av förekomsten av olika riskfaktorer för cancer.

Det finns flera begränsningar av denna studie. För det första är denna studie begränsas av den retrospektiva karaktär analys och urvals fördomar kan inte helt elimineras även om vi samlat data från en prospektivt underhållen databas. För det andra var det heterogenitet i de tröskelvärden som används för att bestämma cutoff Mir-137 uttryck i denna forskning. Medianvärdena mest konsekvent, men en mängd olika tröskelvärden har rapporterats. För det tredje är det inte inkluderade data från sjukdomsfri överlevnad i denna studie. Det finns många faktorer, såsom uppföljningsundersökningar och postoperativ behandling, kan påverka sjukdomsfri överlevnad. Och sjukdomsfria data överlevnad bör samlas i framtiden undersökningar. Slutligen antalet patienter ingick i denna studie är relativt liten. Stora prospektiva randomiserade kontrollerade kliniska studier behövs för att identifiera prognostiska värdet av MIR-137 uttryck hos patienter med magcancer.

I Sammanfattningsvis visar resultaten av denna studie visar att MIR-137 är en lovande markör för att förutsäga den totala överlevnaden hos patienter med magcancer efter radikal gastrektomi. Dessutom kan dessa TNM stadium III gastric patienter med låg MIR-137 uttryck cancer behöver mer aggressiv postoperativ behandling och närmare uppföljning.

• PLOS ONE: Betydelsen av serum pepsinogener som biomarkör för Gastric Cancer och atrofisk gastrit Screening: en systematisk genomgång och meta-Analysis
• PLOS ONE: Avreglerad Expression av SRC, Lyn och CKB kinaser av DNA-metylering och dess potentiella roll i Gastric Cancer invasiv och Metastasis