PLOS ONE: den apoptotiska Effekten av HIF-1α Hämning kombination med glukos plus insulinbehandling på Gastric cancer under hypoxiska Conditions

Abstrakt

Gastric cancer växer under en hypoxisk miljö. HIF-1α är känd för att spela en viktig roll i att kontrollera produktionen av reaktiva syreradikaler (ROS) i mitokondrierna under hypoxiska betingelser. Vi tidigare fastställda HIF-1 a-knockdown (KD) celler och kontroll (SC) celler i 58As9 magcancer-cellinjen. I denna studie visade vi att KD-celler, men inte SC celler, inducerad apoptos under förhållanden med hypoxi (1% O _{2) på grund av överproduktion av ROS. En kvantitativ RT-PCR-analys visade att uttryck för tio gener som är involverade i styrmekanismer ROS (inklusive Warburg effekt, mitophagy, elektron transportkedjan [ETC] modifiering och ROS sophantering), reglerades av HIF-1α. Dessutom främjande av glukosupptag av glukos plus insulin (GI) behandling förbättrade apoptotiska effekt, vilket åtföljdes av ytterligare ROS produktion i hypoxiska KD celler. En Western blot-analys visade att den membranösa uttryck av glut1 i KD-celler var förhöjd av glukos och /eller insulinbehandlingar, vilket indikerar att GI-inducerade glukosupptaget medieras av den ökade translokation av glut1 på cellmembranet. Slutligen tillsattes anti-tumöreffekten av HIF-1α knockdown (KD) plus GI utvärderades med användning av en tumör xenograft-modellen, där en hypoxisk miljö naturligt existerar. Som ett resultat, GI behandling kraftigt hämmade tillväxten av de KD tumörer varvid cellapoptos var högt inducerade i jämförelse med kontrollbehandlingen. Däremot var tillväxten av SC tumörer som uttrycker HIF-1α inte påverkas av GI behandling. Sammantaget tyder resultaten på att HIF-1α inhibering plus GI kan vara en idealisk terapi, eftersom apoptos på grund av förstörelsen av ROS homeostas är specifikt induceras i gastric cancer som växer under en hypoxisk miljö, men inte i normal vävnad under aeroba betingelser}

Citation:. Tanaka T, Kitajima Y, Miyake S, Yanagihara K, Hara H, Nishijima-Matsunobu A, et al. (2015) den apoptotiska Effekten av HIF-1α Hämning kombination med glukos plus insulinbehandling på Gastric cancer under hypoxiska betingelser. PLoS ONE 10 (9): e0137257. doi: 10.1371 /journal.pone.0137257

Redaktör: Ester Hammond, University of Oxford, Storbritannien

Mottagna: 30 april 2015, Accepteras: 13 augusti 2015; Publicerad: 4 september 2015

Copyright: © 2015 Tanaka et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

datatillgänglighet: Alla relevanta uppgifter är inom pappers- och dess stödjande information filer

finansiering:.. författarna har inget stöd eller finansiering för att rapportera

konkurrerande intressen. författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Inledning

hypoxisk miljö är betydande i solida tumörer där det accelererar deras maligna beteenden [1-4]. Liksom andra solida tumörer är magcancer känt med tumören [5-7] innebära stora områden av hypoxi. Hypoxiska betingelser inducerar flera biologiska händelser såsom angiogenes, lokal invasion, metastasering, radio- eller chemoresistance och förändrad energiomsättning i många karcinom, vilket leder till en dålig prognos för patienter [2-4].

transkriptionsfaktor hypoxi-inducerbara faktor 1 (HIF-1) är den huvudsakliga förmedlaren av den cellulära anpassning till hypoxi [8-10]. HIF-1 är en heterodimer protein bestående av en konstitutivt uttryckt β-subenheten (HIF-1β) och en hypoxi-inducerbara α (HIF-1α) subenhet [8-10]. HIF-1α subenheten bryts ned genom ubiquitin-proteasom väg enligt normoxi. I kontrast, enligt hypoxi, är HIF-1α stabiliserats och dimeriserar med HIF-1β interagerar med CBP /p300, som därefter binder till hypoxi-svarselementet (HRE) på promotorregionen av hundratals målgener [11-16]. Dessa tidigare rapporter har lett till erkännandet av HIF-1α som en central regulator i patogenesen av fast cancer

reaktiva syreradikaler (ROS), såsom superoxidanjon (O _{2 ^{. - ), väteperoxid (H 2O 2), och hydroxylradikal (HO •) består av radikala och icke-radikala syreföreningar som bildas genom partiell reduktion av syre. Intracellulär ROS genereras främst i mitokondrierna genom oxidativ fosforylering (OXPHOS), en process som utförs av elektrontransportkedjan (ETC) [17]. När ROS väldiga cellulära antioxidantförsvaret sker oxidativ stress. Överdriven oxidativ stress orsakar ROS-medierad skada av nukleinsyror, proteiner och lipider och leder till celldöd [17, 18].}}

HIF-1α har rapporterats att styra ROS produktion under hypoxiska betingelser genom multipla mekanismer bland annat omstrukturering av energiomsättningen från OXPHOS till glykolys, som kallas Warburg effekt [19-23], induktion av mitokondriell selektiv autophagy (betecknad som mitophagy) [24, 25], ETC modifiering av en subenhet switch i cytokrom c oxidas (COX) [26] och ROS renhållare [27]. I metaboliseringsväg av Warburg effekten, HIF-1α först aktiverar transkriptionen av glut1
att öka glukosupptaget i celler. Glukos metaboliseras sedan till pyruvat genom insatser från glykolytiska enzym medlemmar, som är kända mål för HIF-1α [28, 29]. Under aeroba förhållanden, är pyruvat omvandlas till acetyl-CoA (AcCoA) genom pyruvatdehydrogenas (PDH) för inträde i trikarboxylsyra (TCA) cykel. Omvänt, i cancerceller som utsätts för hypoxi, är pyruvat shuntas bort från mitokondrierna, där HIF-1α uppreglerar uttrycket av PDK1 att hämma PDH-aktiviteten. Därefter LDHA omvandlar alternativt pyruvat till laktat och MCT4 transporterar laktat ut ur cellen. Dessa gener regleras också av HIF-1α [16, 30, 31]. Hypoxi inducerar mitophagy att förhindra överdriven ROS-produktionen genom vilken de skadade mitokondrier elimineras via lysosomal nedbrytning [24, 25]. Nyligen genomförda studier har visat att HIF-1α aktiverar transkriptioner av de gener som kodar BNIP3 och BNIP3L, viktiga faktorer i mitophagy processen [32]. En annan studie rapporterade att HIF-1α reglerar COX4 subenheten växling genom att aktivera transkription av ETC-relaterade gener COX4-2 och LON, en mitokondriell proteas som krävs för COX4-1 nedbrytning under hypoxi [26]. Den COX4 subenheten switch rapporterades som ett viktigt steg i ROS homeostas på grund av sin roll i att optimera effektiviteten av andning enligt hypoxi [26]. ROS renhållare MnSOD är känd för att konvertera superoxidradikaler till väteperoxid. En tidigare studie har rapporterat att MnSOD uppregleras i hypoxi, även om denna uppreglering medieras av HIF-1α inte ännu visats [27]. Nyligen annan rapport visade intressant konstaterande att de embryonala fibroblaster (MEF) av hypoxisk HIF-1α-null möss dog på grund av överskott av ROS-produktionen, medan MEF räddades genom behandling med antioxidanten N acetyl-L-cystein (NAC) [ ,,,0],33]. Sammantaget dessa rapporter tyder på att HIF-1α spelar en central roll i att organisera den mitokondriella ROS-produktionen i levande celler under hypoxi.

I denna studie, som syftar vi att etablera en terapeutisk modell visar att hypoxi-inducerad apoptos via överproduktion av ROS kan införas till HIF-1α brist gastric cancerceller. Vi inledningsvis avgöras huruvida hypoxi inducerar celldöd genom den överdrivna ROS-produktionen i HIF-1α knockdown (KD) celler. Därefter riktade vi hypotesen att införandet av höga glukosnivåer genom behandling av KD-celler med insulin kan förstärka den apoptotiska verkan. Slutligen, med hjälp av en tumör xenograft modell föreslog vi att HIF-1α hämning i kombination med glukos plus insulin (GI) behandling kan vara en potentiell behandling för magsäckscancer.

Material och metoder

Cellodling betingelser och reagens

magcancer-cellinjen 58As9 tillhandahölls vänligen av Dr. K. Yanagihara (National cancer Center Hospital East, Chiba, Japan) på december 2009. 58As9 cellinje upprättades ursprungligen från scirrhous gastrisk carcinom-härledda cellinjen HSC-58 [34]. Denna cellinje sedan ytterligare autentiseras den 24 februari ^{th, 2015 av JCRB Cell Bank (Osaka, Japan). En annan magcancer cellinje MKN74 köptes från Cell Bank, RIKEN Bio Resource Center (Tsukuba, Japan). I den aktuella studien använde vi stabila HIF-1α knockdown celler KD och 74-KD, som fastställdes av transfektion av siRNA plasmid RNAi sekvenser i 58As9 och MKN74 celler som beskrivits tidigare [7, 35]. Sekvenserna av siRNA riktade mot HIF-1α och kontroll scrambled siRNA var utformade på följande sätt: HIF-1α siRNA för KD eller 74-KD (5'-CCA CAT TCA CGT ATA TGA T-3 ') och rusning siRNA för SC eller 74- SC (5'-TCT TAA TCG CGT ATA AGG C-3 '). Cellerna odlades i RPMI-1640-medium (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) och 100 ^ g /ml kanamycin (Meiji, Tokyo, Japan ) och inkuberades vid 37 ° C i en fuktad atmosfär. Cellerna odlades under antingen normoxiska förhållanden (20% O _{2 och 5% CO 2 i luft) eller hypoxiska betingelser (1% O 2, 5% CO 2 och 94% N 2) i en hypoxisk kammare (ASTEC, Fukuoka, Japan) och behandlades sedan med NAC (Sigma-Aldrich) och insulin (Wako, Osaka, Japan) vid en slutlig koncentration av 5 mM och 500 ng /ml, respektive. Koncentrationen av den höga glukosmedium framställdes genom tillsats av 45% D - (+) - Glukos-lösning (Sigma-Aldrich) och den slutliga koncentrationen bestämdes till 10 g /L, vilket är 5 gånger högre än i normala RPMI-1640-medium.}}

cellviabilitet assay

cellviabiliteten enligt normoxi eller hypoxi bedömdes genom uteslutning av trypanblått-analyser. För utvärdering av läkemedelsbehandlingseffekter, inklusive NAC, hög glukos och /eller insulin på cellviabiliteten, 1 x 10 ^{5 celler såddes på 6 cm odlingsskålar. Cellerna behandlades med olika läkemedel vid de angivna koncentrationerna och odlades under normoxi eller hypoxi under 24 timmar till 96 timmar. Vid slutet av inkuberingen de flytande och vidhäftande celler uppsamlas och pelleterades genom centrifugering (3000 rpm, 5 min). Cellerna återsuspenderades i 90 | il av det kompletta mediet, blandades med 10 mikroliter av 0,4% lösning av trypanblått och räknades med användning av en hemocytometer under ett mikroskop. Celldödstalet bestämdes som förhållandet mellan antalet döda celler /det totala cellantalet. Alla experiment utfördes i triplikat och självständigt upprepas minst tre gånger.}

Western blot-analys

Hela cellysat från odlade celler och de xenograft-tumörer hos möss framställdes med användning lysbuffert bestående av 150 mmol /L NaCl, 50 mmol /L Tris-HCl (pH 7,6), 0,5% Triton X-100, och en proteasinhibitor cocktailblandning (Roche, Mannheim, Tyskland). Cellysat från den cytosoliska fraktionen och cellmembranfraktionen framställdes med användning av en cytokrom c Releasing Apoptos Assay Kit och en Plasma Membrane Protein Extraction Kit (BioVision Inc., Milpitas, Kalifornien, USA) enligt tillverkarens instruktioner. Western blot-analys utfördes såsom beskrivits tidigare [7]. Portioner innehållande 30 mikrogram av protein separerades elektrofore i 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) och överfördes till en Amersham Hybond-ECL membran (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) i en överföringsbuffert. Efter blockering med 5% hud mjölk under 30 min, inkuberades membranet med primära antikroppar över natten vid 4 ° C. Följande primära antikroppar användes: anti-HIF-1α (1: 1000 utspädning, Abcam, Cambridge, UK), anti-klyvs kaspas 3 (1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-cytokrom c (1 : 500 utspädning, BioVision), anti-glut1 (1: 100,000 utspädning, Abcam), och anti-β-aktin (1: 10000 utspädning; Sigma-Aldrich, Inc.). Efter inkubation med motsvarande sekundära antikroppar, har signalerna utvecklats med hjälp av en Amersham ECL Plus Western blotting Detection System (GE Healthcare).

Upptäckt av intracellulära ROS med flödescytometri

Intracellulär ROS-värden utvärderades med användning av en Total ROS Detection Kit (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, USA) enligt tillverkarens instruktioner. I korthet, KD, SC ades cellerna odlas under betingelser av antingen normoxi eller hypoxi med eller utan läkemedelsbehandlingar (dvs NAC, hög glukos och /eller insulin) under 24 h, 48 h och 72 h. 74-KD och 74-SC odlades också under betingelser med antingen normoxi eller hypoxi under 24, 48, och 72 timmar utan någon läkemedelsbehandling. Cellerna tvättades och åter-suspenderades i ROS upptäckt lösning. ROS fluorescens detekterades genom FACS Calibur flödescytometer (Becton-Dickinson, San José, CA) och analyserades med Cell Quest programmet. Alla experiment utfördes i triplikat. Den genomsnittliga fluorescens ROS produktion bestämdes automatiskt och presenteras som GEO menar.

Total RNA-extraktion och kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA extraherades från cellinjer med hjälp av en Isogen RNA-extraktion kit ( Nippon Gene, Osaka, Japan). Ett mikrogram av RNA omvandlades till cDNA med hjälp av en ReverTra Ace (Toyobo) omvänd transkriptionsreaktion kit. CDNA användes som en mall för PCR. En realtids kvantitativ RT-PCR (RT-qPCR) utfördes med hjälp av ljus Cycler instrumentsystem (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland) med hjälp av en ljus-Cycler-Faststart DNA master SYBR Green I kit (Roche). De tio gener som analyserades med RT-qPCR var följande: glukostransportören 1 ( glut1
), aldolas C ( ALDOC
), pyruvatdehydrogenas kinas 1 ( PDK1
), laktatdehydrogenas A ( LDHA
) och monokarboxylat transportör 4 ( MCT4
), Bcl-2 /adenovirus EIB 19-kDa interagerande protein 3 ( BNIP3
), BINP3 som ( BNIP3L
), mitokondriell mangansuperoxiddismutas ( MnSOD
), en mitokondriell proteas LON Mössor och cytokromoxidas subenhet 4-2 ( Cox4 - 2 Review). Primrarna utformades enligt de rapporterade cDNA-sekvenser (GenBank, Bethesda, MD) (tabell 1). Efter att ha utfört ett denatureringssteg vid 95 ° C under 3 min, PCR-amplifiering utfördes med 50 cykler av 15 s av denaturering vid 95 ° C, 5 s av glödgning vid 60 ° C och 10 s förlängning vid 72 ° C. De kvantitativa värdena normaliserades till den β-aktin ( ACTB
) expression (tabell 1). Alla experiment utfördes i triplikat och självständigt upprepas minst tre gånger.

Glukos upptagningsanalys

glukosupptaget i odlade celler bestämdes med användning av ett 2-deoxiglukos (2DG) Upptag Mätning Kit (COSMO BIO Co. Ltd., Tokyo, Japan). I korthet, cellerna odlas under en serumsvältes tillstånd i 6 h, följt av ytterligare odling under 18 timmar med regelbunden medium kompletterat med 10% FBS. Cellerna inkuberades under 24 h under normoxi eller hypoxi. Därefter behandlades cellerna med eller utan 500 ng /ml insulin för 18 min. Slutligen behandlades cellerna med 2DG under 20 min och utsattes för mätning av 2DG upptagning i enlighet med tillverkarens instruktioner. Alla experiment utfördes i tre exemplar och medelvärdena beräknades.

Djurstudier

Djurprotokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittéer Saga University (protokoll 24-008-0 ) och överensstämde med de anländer riktlinjer för användning av djur i forskning. Kvinnliga fyra veckor gamla atymiska BALB /cA Jcl möss (nu /nu) erhölls från Nihon Crea Co. (Osaka, Japan). Djuren hölls under specifik-patogenfria betingelser. De gavs steril mat och autoklaveras vatten med en 12-h ljus-mörker-cykel. Möss acklimatiserades till miljön under 7 dagar före experimenten. KD eller SC-celler (3 x 10 ^{6) injicerades subkutant i ryggen på mössen (n = 9 för varje cellinje). Tio dagar efter den subkutana ympningen de xenografter av båda cellerna blev påtaglig. Nio möss som bar KD eller SC-xenotransplantat delades sedan upp i tre grupper för behandling med glukos (8 g /kg /dag, Sigma), glukos plus insulin (GI) (en enhet per 3 g glukos /dag, Wako) eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som kontrollbehandling. Var och en av dessa läkemedel administrerades intraperitonealt i tre möss (sex tumörer totalt) var 24 h från dag 1 till dag 11. Under denna period var tumörerna mättes i 2 rät vinkel mot varandra med en tjocklek var fjärde dag. Tumörstorleken ( T
) utvärderades som den maximala snittet området och bestäms genom följande formel: T
= π /4 x en
× b
, där en
är den kortare axeln (mm) och b
är längre axeln (mm). Mössen avlivades 12 dagar efter läkemedelsbehandlingar och tumörerna skördades för efterföljande experiment.}

klyvs kaspas 3 immunohistokemi och bedömning av apoptos In vivo

frysta tumörer inbäddade med Tissue-Tek oktober Förening. Dessa block skars i 4-um tjocka sektioner. För antigenåtervinning, var objektglasen uppvärmdes i Tris-EDTA-buffert (pH 9,0) i en mikrovågsugn (500 watt) i 5 min. Sektionerna inkuberades sedan med anti-klyvs kaspas 3 (1: 200, Cell Signa Technology) under 2 h vid rumstemperatur, och DAKO Envision + System (Dako Cytomation, Glostrup, Danmark) användes som den sekundära antikroppen. De signaler visualiserades med diaminobensidin-tetrahydroklorid (0,02%). För bedömning av apoptos, klyvs kaspas 3-positiva celler med bruna färgade kärnor räknades i fem områden vid 400x förstoring och medelvärdet beräknades. Den immunohistokemiska uttryck klyvs kaspas 3 var blint granskas och bedömas av en certifierad patolog (Dr. AN).

Statistisk analys

Data analyserades med en ANOVA med hjälp av Prism 5 programpaketet ( GraphPad Software, La Jolla, CA). För jämförelse mellan två grupper, var skillnaderna i medelvärden utvärderades genom Students t-
test och Mann-Whitney U
test. För jämförelse mellan tre eller flera grupper, var Bonferroni post hoc test utförs för en en-vägs ANOVA. Ett värde på p < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant. Alla data uttrycks som medel ± SEM.

Resultat

HIF-1α knockdown inducerad apoptotisk celldöd i hypoxi i 58As9 gastric cancerceller

HIF-1α uttryck var bedömas stabil HIF-1α knockdown (KD) celler och SC (som kontroll cellinje) celler. En Western blot-analys visade att HIF-1α-uttryck helt utslagen fastställs i KD-celler efter 8 timmar under hypoxi jämfört med SC-celler (fig 1A). Cell dödligheten uppskattades efter 24 timmar till 96 timmar under normoxi och hypoxi. Dödligheten var högre i KD-celler än i SC celler under normoxi för 24 till 96 timmar, men skillnaderna var inte statistiskt signifikant (Fig 1B). Däremot var celldödstalen i KD-celler kraftigt ökade i hypoxi och betydligt högre än den som observerades i SC-celler vid 72 och 96 timmar (fig 1c). Western blot analys visade att kluvna caspase 3 samt cytosoliskt cytokrom c var förhöjda i KD-celler, men inte i SC celler under hypoxi under 8 timmar (Fig 1D och 1E). Hypoxi celldöd bekräftades också i andra HIF-1α knockdown gastric cancerceller 74-KD (S1 FIG). Dessa resultat visade att hypoxi kraftigt apoptos i HIF-1α knockdown cellinje KD.

rensning ROS återförs den apoptotiska fenotypen observerats i HIF-1α knockdown celler

Den intracellulära ROS nivån uppskattades och jämfört bland KD och SC-celler. ROS nivå ökade på ett tidsberoende sätt i KD cellerna under hypoxi, medan nivån svagt förhöjda i SC-celler (Fig 2A). ROS nivå i KD-celler var signifikant högre vid hypoxi under 24 till 72 timmar än att i SC-celler (fig 2A). ROS nivåer bedömdes också i 74-SC-celler och 74-KD-celler (S2 FIG). ROS nivåerna skilde sig inte mellan de 74-SC och 74-KD celler under normoxi (S2A FIG). Men under hypoxi, ROS nivåerna var signifikant högre i de 74-KD-celler än i de 74-SC celler vid 48 till 72 timmar (S2B FIG). NAC, en antioxidant, minskade signifikant ROS nivå i KD celler under hypoxi under 48 till 72 timmar (Fig 2B). För att bedöma huruvida ROS produktion inducerar hypoxi-inducerad celldöd i KD-celler, cell dödligheten med eller utan NAC utvärderats i KD celler under normoxi och hypoxi. NAC behandling påverkade inte graden av celldöd i KD celler under normoxi (Fig 2C). Däremot NAC behandling minskade signifikant celldöd i KD celler under hypoxi under 48 till 96 timmar (Fig 2D).

HIF-1α knockdown minskade hypoxisk induktion av olika involverade i kontrollen av ROS produktion gener

för att undersöka hypoxi-inducerad ROS ackumulering i HIF-1α knockdown celler, mRNA uttryck av tio gener som är involverade i ROS styrmekanismen ( glut1
, ALDOC
, PDK1
, LDHA
, MCT4
, BNIP3
, BNIP3L
, LON
, COX4-2 Mössor och MnSOD
) analyserades med en RT-qPCR. Hypoxisk induktion av genuttryck utvärderades genom vecket induktion (FI). FIS i tio generna var betydligt lägre i KD-celler än i SC-celler (Fig 3). Dessutom, när begränsad till hypoxiska förhållanden, var de expressionsnivåer av alla tio gener signifikant lägre i de KD-celler än de SC-celler. Dessa resultat visade att HIF-1α knockdown minskade markant hypoxi-inducerad expression av de tio gener. Å andra sidan, i enlighet med normoxi, uttrycket av PDK1 och BNIP3L var signifikant lägre i de KD-celler än i SC-celler. Omvänt, var påtagligt högre i KD celler uttrycksnivåer LON och COX4-2 i jämförelse med SC cellerna.

glukos och insulin behandlingar förbättrade den apoptotiska celldöd i KD celler under hypoxi

Vi undersökte därefter huruvida främjande av glukosupptaget påverkar hypoxi-inducerad apoptos i KD-celler. Cellviabiliteten bedömdes i KD och SC-celler efter behandling med kontroll (PBS), hög glukos, insulin eller hög glukos plus insulin (GI). Hypoxi celldöd uppskattades av FI. Celldödshastighet vid hypoxi jämfördes mellan kontrollbehandlingen och de andra behandlingar i båda cellinjerna (Fig 4). I SC-celler, observerades inga signifikanta skillnader i FI och cell dödligheten i hypoxi observerats bland någon av behandlingarna (Fig 4A). I KD celler, FI signifikant ökade med hypoxi i alla behandlingar. Framför allt gav GI behandling högsta FI bland alla behandlingar (Fig 4B). Celldödshastighet vid hypoxi var signifikant högre i de GI-behandlade celler än i kontrollbehandlade celler (Figur 4B). För att undersöka om de behandlingar påverkade ROS produktion var ROS nivå analyseras i KD-celler. I jämförelse med normoxiska förhållanden, var ROS nivån signifikant förhöjd i KD-celler under hypoxiska betingelser (Fig 4C). Under hypoxi, var ROS nivån i KD-celler signifikant ökas genom hög glukoshalt, insulin och GI behandling jämfört med kontrollbehandling. Den högsta ROS nivån positivt observerats i GI-behandlade KD-celler (Fig 4C).

Bedömning av glukosupptag efter insulinbehandling

glukosupptaget förmåga analyserades i en 2DG inkorporering studie . I SC och KD celler under normoxi var 2DG inkorporeringen signifikant förhöjd av 2DG behandling jämfört med obehandlade celler. Den 2DG inkorporeringen ökades ytterligare genom ytterligare insulinbehandling i båda cellerna (figur 5A). I jämförelse med normoxi, hypoxi stimulerade mer starkt 2DG upptagning i SC-celler, med eller utan insulin (Fig 5B). Liknande resultat observerades i KD celler under hypoxi (fig 5B). Emellertid kommer under hypoxi, var mindre 2DG införlivas i KD-celler än i SC-celler, med eller utan ytterligare insulin behandling (fig 5B). För att bedöma mekanismen för insulinberoende glukosupptag, var den membranösa expression av glut1 analyseras i KD cellerna under normoxi och hypoxi. Enligt normoxi ades den membranösa glut1 uttrycket förhöjda med hög glukoshalt och /eller insulinbehandling i jämförelse med den med ingen behandling (fig 5C). Jämfört med den som observerades i normoxi under hypoxi, var membran glut1 uttryck förhöjd i alla behandlingar. Dessutom var expressionen ökade med hög glukoshalt och /eller insulinbehandling, jämfört med den av ingen behandling (fig 5C). I synnerhet var det membran glut1 uttryck starkast ökade med hög glukos och insulin (GI) behandling i hypoxiska KD-celler (Fig 5C). Å andra sidan, ett uttryck för en annan GLUT familj, GLUT3, svagt observerades i de KD-celler, och detta fynd ändrades inte mellan dessa olika behandlingar (data visas ej). I denna studie var GLUT2 och GLUT4 inte uttrycks i KD cellerna.

HIF-1α knockdown plus GI behandling tryckte starkt tillväxten av tumörxenotransplantat hos nakna möss

Slutligen, vi bestämde in vivo
effekten av GI behandling KD och SC tumörxenotransplantat. Fig 6A visar den experimentella utformningen av xenograft musmodell. Tio dagar efter den subkutana ympning av SC eller KD celler, xenotransplantat odlas på ryggen på nakna möss. Vid denna punkt, bekräftade en Western blot-analys av HIF-1α uttryck i SC tumörer men inte i KD tumörer (Fig 6B). Därefter tre droger, bestående av PBS, glukos eller GI, intraperitonealt injicerades i nakna möss med en SC eller KD tumör (dagligen från dag 1 till dag 11). De representativa bilder av de tumörbärande möss som behandlades med PBS (SC-PBS och KD-PBS), glukos (SC-glukos och KD-glukos) eller GI (SC-GI och KD-GI) är visade i fig 6C . De KD-Glukos och KD-GI tumörer föreföll vara mindre än de andra tumörer. Fig 6D visade tillväxtkurvan för de 6 tumörer. Storlekarna på KD-Glukos och KD-GI tumörerna var signifikant mindre än KD-PBS tumör på dag 12. KD-GI tumör var den minsta. Å andra sidan, i SC möss, fanns det ingen signifikant skillnad i storlek av SC-PBS, SC-glukos och SC-GI tumörer (Fig 6D). En immunhistokemisk analys av klyvs kaspas 3 utfördes för att utvärdera apoptos inducerad av glukos eller GI behandling. Den positiva uttryck klyvs caspase3 var ofta observerats i KD-glukos och KD-GI tumörer (Fig 6E). Emellertid är alla de KD tumörer uppvisade en viss grad av kluvna kaspas 3 (fig 6F). Däremot fanns det ingen signifikant skillnad i uttryck av den kluvna caspase 3 bland SC-PBS, SC-glukos och SC-GI tumörer. I KD tumörer positiva uttryck för kluvna caspase3 var signifikant högre i KD-PBS tumör än i SC-PBS tumör. Dessutom ett uttryck för kluvna caspase3 var signifikant högre i KD-glukos eller KD-GI tumörer än i KD-PBS tumör. Det högsta uttrycket observerades i KD-GI tumör.

Diskussion

I den aktuella studien har HIF-1α knockdown celler som används för att undersöka om dödlig ROS produktion kan induceras i hypoxi. Resultaten visade att apoptotisk celldöd inducerades i KD-celler, men inte i de kontroll SC celler under hypoxi. Samtidigt ROS ackumuleras i knockdown cellinje enligt varaktigheten av hypoxi. Hypoxia- celldöd och ROS ackumulering observerades också i de olika HIF-1α knockdown 74-KD celler, men inte i kontroll 74-SC celler. Dessutom reducerade NAC behandlingen hastigheten för hypoxi-inducerad celldöd i KD-celler. Dessa resultat indikerar förekomst av hypoxi-inducerad apoptos på grund av alltför ROS ackumulering i KD-celler och stödde en tidigare studie att HIF-1 a knockout MEFs dog på grund av överdriven ROS-produktionen [33].

ROS genereras främst i mitokondrierna av ETC [17, 19]. Det har rapporterats att de mitokondriella ROS ökar under hypoxiska förhållanden [17, 19]. Om hypoxi kvarstår, induktion av HIF-1α leder till adaptiva mekanismer för att minska ROS och återupprätta redox homeostas via uppreglering av relevanta gener [19]. Vi undersökte därför om HIF-1α knockdown påverkat mRNA-expression av tio gener som är involverade i kontrollen av ROS-produktionen enligt hypoxi ( glut1
, ALDOC
, PDK1
LDHA Köpa och MCT4
rör Warburg effekt; BNIP3 Mössor och BNIP3L
avseende mitophagy; LON Köpa och COX4-2
avseende ETC och MnSOD
en ROS renhållare). De integrerade analyser av RT-qPCR serien visade att hypoxi-inducerad expression av alla tio gener signifikant undertryckt i KD celler, medan, enligt normoxi, mRNA uttryck för LON och COX4-2 var signifikant högre i KD celler än i SC cellerna. Dessa resultat indikerade att den letala ackumulering av ROS enligt hypoxi i HIF-1α knockdown-celler skulle kunna vara på grund av flera störningar i styrmekanismen ROS. Därför kan cancerterapi targeting HIF-1α vara effektiv i den hypoxiska regionen inom gastric cancervävnad. Mekanismen bakom den uppreglerad mRNA-expression av LON och COX4-2 i KD cellerna under normoxi kunde inte klargöras.

Enligt ovanstående resultat, hypotes vi att främjandet av glukosupptaget kan accelerera hypoxi-inducerad apoptos genom ytterligare ROS produktion i HIF-1α knockdown KD celler. Som väntat, GI behandlingen förbättrade celldöden i hypoxiska KD-celler, som åtföljdes av ökad ROS-produktionen. I glukosupptag studien ökade insulin 2DG upptagning i både SC och KD celler. I jämförelse med den som observerats i enlighet med normoxi, ökad hypoxi den 2DG upptagning i SC och KD-celler behandlade med eller utan insulin. Upptaget ökades kraftigare i SC än KD-celler, vilket tyder på en skillnad på grund av den dämpade glut1 induktion i hypoxisk KD cellerna. Å andra sidan, en Western blot-analys visade att den membranösa glut1 uttryck ökade med hög glukoshalt och /eller insulinbehandlingar, jämfört med kontrollbehandling i normoxiska och hypoxiska KD celler. I synnerhet GI behandling starkast ökade membran glut1 uttryck i hypoxiska KD celler. En tidigare studie rapporterade att insulin främjar glukostransport genom att stimulera translokation av GLUT4 från intracellulära förvarings vesiklar till plasmamembranet i skelettmuskelceller eller adipocyter [36, 37].

• PLoS ONE: Copy Number Vinster vid 8q24 och 20q11-Q13 i Gastric cancer är vanligare hos Intestinal-Type än Diffus-Type
• PLOS ONE: Serum HER2 är en potentiell surrogat för Tissue HER2-status i Gastric Cancer: en systematisk genomgång och meta-analys