PLOS ONE: HIF-1α inducerar multiläkemedelsresistens i Gastric cancerceller genom att inducera MIR-27a

Abstrakt

Denna studie syftade till att bestämma korrelationen mellan HIF-1α och MIR-27a uttryck och för att utvärdera effekten av inhibering av HIF-1α uttryck på Mir-27a uttryck och läkemedelsresistens i magcancer ( GC). I den föreliggande studien har realtid-PCR och Western blöt utförs för att detektera uttrycket av HIF-1α i GC vävnader och cellinjer. Då var OCUM-2MD3 /L-OH-celler transfekterade med HIF-1α-siRNA, ett MIR-27a härma eller pcDNA-HIF-1α, och cellöverlevnad bestämdes via MTT-analysen. Uttrycket av HIF-1α, miR-27a, och MDR-relaterade gener mättes via realtid-PCR och Western blöt. Chip och dubbla luciferasaktivitet utfördes för att utvärdera transkriptionsreglering av HIF-1α och MIR-27a. Resultaten visade att transfektion med HIF-1α-siRNA minskade markant nivåerna av miR-27a, vilket resulterar i dramatiskt förbättrad inhibering av spridningen graden av OCUM-2MD3 /L-OH-celler. Jämfört med icke-transfekterade celler, var överlevnadsgraden signifikant reducerad i cellerna transfekterade med HIF-1α-siRNA efter behandling med L-OHP. Cell överlevnaden signifikant ökat i OCUM-2MD3 /L-OH-celler transfekterade med Mir-27a härma, medan HIF-1α uttryck resulterade inte i någon tydlig förändring i cellöverlevnad. Resultaten av den dubbla luciferasaktivitet analys visade att HIF-1α förbättrar den transkriptionella aktiviteten av miR27a promotorn i celler transfekterade med en reporterplasmid innehållande uppströmspromotorregionen av miR27a tillsammans med pcDNA-HIF-1α. ChIP-analys antydde att HIF-1α direkt binder till promotorregionen av miR27a. Inhibering av HIF-1α eller miR27a expression minskade MDR1 /P-gp, LRP, och Bcl-2-expression i OCUM-2MD3 /L-OHP-celler. Således fann vi att HIF-1α är nära förknippad med MDR i GC och att HIF-1α kan undertrycka MDR1 /P-gp, LRP och Bcl-2-uttryck genom att hämma MIR-27a uttryck

Citation. Zhao Q, Li Y, Tan Bb, Fläkt Lq, Yang Pg, Tian Y (2015) HIF-1α inducerar multiläkemedelsresistens i Gastric cancerceller genom att inducera MIR-27a. PLoS ONE 10 (8): e0132746. doi: 10.1371 /journal.pone.0132746

Redaktör: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, USA

emottagen: 5 januari 2015; Accepteras: 17 juni 2015, Publicerad: 20 augusti 2015

Copyright: © 2015 Zhao et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

datatillgänglighet: Alla relevanta uppgifter är inom pappers- och dess stödjande information filer

Finansiering:. Detta arbete stöddes av följande bidrag:. provins~~POS=TRUNC Natural Science Foundation i Hebei-provinsen (nr H2013206311 till Qun Zhao) katalog

konkurrerande intressen. författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Gastric cancer (GC) är bland de vanligaste maligniteter, orsakar allvarlig skada över hela världen [1, 2] Efter år av tekniska framsteg inom diagnostik och behandling av GC, har dess förekomst och dödlighet minskade i hela världen men förblir hög i asiatiska länder [3, 4]. För närvarande är gastric resektion den enda tillgängliga metoden för att bota GC. Emellertid är det svårt att uppnå en fullständig härdning trots kirurgiskt avlägsnande av tumören, eftersom de flesta patienter lider av avancerad GC vid diagnos [5, 6]. Därför spelar kemoterapi en mycket viktig roll i den omfattande behandlingen av GC. Även kemoterapi utvecklats kraftigt med avseende på behandling av avancerad GC, [7, 8] prognosen för GC fortfarande otillräcklig, med en 5-års överlevnad på mindre än 30% [9]. Denna prognos är i första hand på grund av den multidrogresistens (MDR) i GC-celler. MDR i GC leder ofta till misslyckande kemoterapi [10-12]. Därför finns det ett akut behov av att utveckla nya lovande terapeutiska strategier för att effektivt minska MDR i GC.

Syrebrist är utbredd i solida tumörer och är associerad med en mängd olika biologiska funktioner. För närvarande, hypoxi-inducerbara faktor (HIF) -1α anses vara nära förknippad med hypoxi. HIF-1α uttrycks starkt i ett antal olika maligna tumörer [13, 14] och fungerar som en väsentlig faktor för att reglera anpassning av tumörceller för hypoxi [15]. HIF-1α har föreslagits vara nära förknippad med GC MDR [16, 17]. Det är dock oklart vilken väg förmedlar roll HIF-1α i GC MDR.

Under de senaste åren, roll mikroRNA (miRNA) i cancer har blivit en allmänt undersökt Mekanismen bakom tumör initiering och behandling. MIR-27a, en medlem av miRNA familjen, har visat sig påverka MDR GC [18]. Dessutom är ett uttryck för MIR-27a ökat i en hypoxisk miljö [19]. Dessa fynd tyder på att HIF-1α kan reglera uttrycket av MIR-27a och påverkar GC MDR. De särskilda regleringsmekanismer har ännu inte klarlagts. Föreliggande studie visade att uttrycket av HIF-1α och miR-27a var signifikant uppreglerade i GC vävnader och cellinjer, särskilt i resistenta cellinjer.

Transfektion med en specifik små störande RNA för att blockera endogen HIF -1α resulterade i en minskning av mIR-27a uttryck och lindring av MDR i GC-cellinjer. Dessa nya rön tyder på att hämning av HIF-1α uttryck undertrycker transkriptionen av MDR-relaterade gener MDR1 /P-gp, LRP, och Bcl-2 för att dämpa MDR av GC-celler genom att undertrycka MIR-27a uttryck.

Material och metoder

1,1 Material

Gastric cellinje OCUM-2MD3 var från professor Masakazu Yashiro i Japan Oita läkarmottagning [20]. Den stabila läkemedelsresistent cellinje OCUM-2MD3 /L-OHP2 erhölls via odling och urval av vår forskargrupp. GSE-1 cellinje köptes från Cell Resource Center på Shanghai institut för biologiska vetenskaper av Chinese Academy of Sciences. RPMI 1640-odlingsmedium och trypsin köptes från Gibco Company; Trizol reagens och Lipofectamine 2000 transfektion reagens köptes från Invitrogen. De omvända transkriptions kit och fluorescens kvantitativ PCR-reagens erhölls från Promega Corporation. PCR-primers och små störande RNA syntetiserades av Shanghai Biological Engineering Company. Protein utvinning kit erhölls från Beyotime Company, Kina. Primära antikroppar mot HIF-1α, MDR1 /P-gp, GST-π, LRP, Bcl-2, TS eller GAPDH inköptes från Santa Cruz. MTT erhölls från Sigma. Vår studie godkändes av den etiska kommittén i den fjärde Anslutna sjukhuset i Hebei Medical University.

1,2 Klinisk provberedning

Alla 65 patienter med GC valdes efter gastric resektion och patologisk bekräftelse i fjärde sjukhus Hebei Medical University, inklusive 42 män och 23 kvinnor i åldern 60,5 ± 8,1 år som inte fått preoperativ strålbehandling eller kemoterapi. Cancer och para-karcinomvävnader (ca 1,0 cm x 0,5 cm x 0,5 cm) togs från varje patient, och proverna snabbt fryses i flytande kväve och överfördes därefter till -80 ℃ bevarande. Alla deltagare undertecknade informerat samtycke.

1,3 Cellodling och transfektion

OCUM-2MD3, OCUM-2MD3 /L-OH och GSE-1-cellinjer odlades i RPMI 1640-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin och 100 mg /ml streptomycin. Noterbart var mediet i OCUM-2MD3 /L-OH-celler behandlade med L-OH vid en koncentration av 75 ng /ml för att behålla sin läkemedelsresistens fenotyp, en vecka före operation för att avbryta behandlingen. Cellerna odlades i en fuktig 5% CO _{2 atmosfär vid 37 ° C}

Tre HIF-1α-siRNA sekvenserna utformades med hjälp av BLOCK-IT RNAi Designer (sekvens 1. GAGGAAACUUCUGGAUGCUGGUGAUtt; sekvens 2: GGAUGCUGGUGAUUUGGAUAUUGAAtt; sekvens 3: CAGGACAGUACAGGAUGCUUGCCAAtt), vilka var och glödgades med deras komplementära sekvensen och transfekterades respektive i OCUM-2 MD3 /L-OH GC-celler. En icke-specifik siRNA-sekvensen (NS-siRNA: GAGUGGGUCUGGGUCUUCCCGUAGAtt) användes som en negativ kontroll. Den miR27a mimetiska sekvensen var 5'-UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC-3 '. Human fullängds HIF-1α coden sekvens subklonades i pcDNA3.1 vektor. pGL3-miR27a-luc, var pcDNA-HIF-1α, pGL3-Basic och pRL-TK plasmider konstruerade och bevaras i vårt laboratorium.

GC-celler ympades i 6-brunnsplattor under 24 timmar före transfektion på en densitet av 4 x 10 ^{5 celler /ml. De plasmidvektorer, siRNA eller miR27a härmare transfekterades in de GC-celler eller läkemedelsresistenta celler med användning av transfektionsreagens lipofektamin enligt tillverkarens instruktioner. Därefter tvättades cellerna med serumfritt RPMI 1640 som saknar antibiotika. Transfektionseffektiviteten mättes 24 timmar senare, följt av de efterföljande experimenten.}

1,4 MTT-analys

GC vävnader och normala para-karcinom vävnaden homogeniserades för att framställa enstaka cellsuspensioner genom filtrering genom en 300 -mesh koppargaller. De GC-celler digere med användning av 0,02% EDTA-0,25% trypsin ympades vid en densitet av 5 x 10 ^{4 celler /ml i 96-brunnsplattor. När cellerna nått ca 60% sammanflödet, var HIF-1α-siRNA transfekterade eller ett kemoterapeutiskt läkemedel (150 mikrogram /ml L-OH) påfördes. Varje grupp bestod av sex brunnar. Då, 20 pl av 5 mg /ml MTT tillsattes under 4 h före slutet av experimentet. Cellerna odlades under 4 h, och sedan byttes odlingsmediet kastades. Därefter tillsattes 150}

• PLOS ONE: multi Resistance Related Long icke-kodande RNA Expression Profil Analyser av Gastric Cancer
• PLOS ONE: Gällande B-cellsfunktion hämmas av rökning och fetma i H. pylori-infekterade patienter och är korrelerad med ökad risk för Gastric Cancer