PLOS ONE: MicroRNA-338 hämmar tillväxt, invasion och metastas av gastric cancer genom att rikta NRP1 Expression

Abstrakt

NRP1 som multifunktionella icke-tyrosin-kinas receptorer spelar avgörande roller i tumörprogression. MicroRNAs (miRNA) är en viktig klass av genomträngande gener som är inblandade i en mängd olika biologiska funktioner, särskilt cancer. Det är fortfarande oklart om miRNA kan reglera uttrycket av NRP1. Målet med denna studie var att identifiera miRNA som kan hämma tillväxten, invasionen och metastasering av magcancer genom att rikta NRP1 uttryck. Vi fann att MIR-338 uttryck reducerades i gastric cancercellinjer och magcancer vävnader. Dessutom fann vi att MIR-338 hämmade magcancer cell migration, invasion, spridning och främjas apoptos genom att rikta NRP1 uttryck. Som en uppströms regulator av NRP1, riktar miR-338 direkt NRP1. Den påtvingade uttrycket av MIR-338 hämmade fosforylering av ERK1 /2, P38 MAPK och Akt; var dock uttrycket av fosforylerad ERK1 /2, P38 MAPK och Akt återställas genom överuttryck av NRP1. I AGS celler infekterade med MIR-338 eller transfekterade med SiNRP1 var proteinnivåer fibronektin, vimentin, N-cadherin och SNIGEL minskat, men uttrycket av E-cadherin ökades. Uttrycket av mesenkymala markörer i MIR-338-uttryckande celler återställdes till normala nivåer av återställande av NRP1 uttryck. In vivo
, MIR-338 minskade tumörtillväxt och undertryckte D-MVA genom att rikta NRP1. Därför drar vi slutsatsen att miR-338 fungerar som en roman tumörsuppressorgen i magcancer. MIR-338 kan minska migrations, invasiva, proliferativa och apoptotiska beteenden, liksom magcancer EMT, genom att dämpa uttrycket av NRP1

Citation. Peng Y, Liu YM, Li LC, Wang LL, Wu XL (2014) MicroRNA-338 hämmar tillväxt, invasion och metastas av gastric cancer genom att rikta NRP1 Expression. PLoS ONE 9 (4): e94422. doi: 10.1371 /journal.pone.0094422

Redaktör: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, Taiwan

emottagen: 18 oktober 2013; Accepteras: 16 mars 2014. Publicerad: 15 april 2014

Copyright: © 2014 Peng, et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av projekt för vetenskap och teknik kommittén i Shapingba distriktet Chongqing (201302). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Neuropilins, inklusive neuropilin1 (NRP1) och neuropilin2 (NRP2), är multifunktionella icke-tyrosin-kinas-receptorer som först identifieras baserat på deras kritiska roller i utvecklings nervsystemet [1]. Nrp1 och NRP2 har 44% homologi och delar många strukturella och biologiska egenskaper. NRP1 existerar främst i bloodvesselendothelia och NRP2 återfinns huvudsakligen i lymfkärlen [2], [3]. Efterföljande undersökningar identifierades NRP-1 som en receptor för vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) -A isoform VEGF-165 i både endotelceller och vissa tumörceller [4], [5]. Forskning har visat att NRP1 uppregleras i flera tumörtyper och uttrycks i olika tumör vasculatures [3], [6], vilket tyder på att NRP1 spelar en avgörande roll i tumörprogression. Tidig forskning visade att NRP1 kan påverka tillväxten av tumörer som en coreceptor av VEGFR [5]. Forskare senare fann att NRP1 skulle kunna öka tumorangiogenesis, påskynda tumörtillväxt och bromsa tumör apoptos utan VEGFR [7]. NRP1 kan vara en co-receptor av andra tillväxtfaktorer, som belyser varför VEGF kan signalera genom neuropilins i frånvaro av VEGFR-1 eller VEGFR-2 [8], [9]. Som en coreceptor av TβRI /TβRII kan NRP1 bromsa tumör apoptos och påskynda tumörtillväxt via både Canonical och icke-kanoniska signalering [10]. NRP1, som en co-receptor av PDGFR /cmet, kan öka tumorangiogenesis via P38MAPK och ERK signaler [11].

Som uppströms belägna regulatoriska gener av NRP1, transkriptionsfaktorema SP1 /3 och AP1 kan reglera uttrycket av NRP1 [ ,,,0],12]. Viss forskning har visat att butyrat trycker uttrycket av neuropilin I i kolorektala cellinjer genom hämning av Sp1 trans [13].

MicroRNAs (miRNA) är icke-kodande RNA-molekyler ca 21-23 nukleotider i längd som reglera genuttrycket på post-transkriptionell nivå [14], [15], [16]. miRNA uttryck profilering analyser har avslöjat en global nedreglering av mogna miRNA nivåer i primära humana tumörer i förhållande till normal vävnad [17], [18]. Således kan miRNA fungera som tumörsuppressorer eller onkogener och oreglerad miRNA uttryck kan bidra till tumörcellmetastaser. Det är fortfarande oklart om miRNA kan reglera uttrycket av NRP1; Därför syftade vi att avgöra målet miRNAs av NRP1. Ytterligare funktioner NRP1 kan upptäckas genom att studera mål miRNA av NRP1.

Material och metoder

Human vävnadsprover och cellinjer

Denna studie utnyttjade färska vävnader, däribland 41 humana magcancer prover och 24 prover av intilliggande normala slemhinnevävnader härrör från 41 patienter som genomgick kirurgi vid andra Anslutna sjukhuset i Chongqing Medical University mellan 2012 och 2013. studien genomfördes i enlighet med "Biomedical forskning på människor etisk granskning (preliminärt) "reglering av hälsoministeriet och Helsingforsdeklarationen om etiska principer för biomedicinsk forskning med människor inblandade. Alla prover erhölls med informerat samtycke från patienterna och experimenten har godkänts av Institutional Review Board i andra Anslutna sjukhuset i Chongqing Medical University. Alla deltagare lämnade skriftliga informerat samtycke att delta i denna studie

SGC-7901, HGC-27, AGS, MKN-45 och N87 cellinjer erhölls från American Type Culture Collection (ATCC;. Manassas, VA , USA), och GES-1 cellinje köptes från Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Cellinjerna odlades i RPMI1640 (Hyclone, Logan Utah USA) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och inkuberades vid 37 ° C med 5% CO2.

Primers, RNA-isolering och miRNA Detection

primers för mIR-338-3p och U6 producerades med användning av miScript Primer Assay kit (Qiagen Dusseldorf Tyskland). Sekvenserna för miRNA används i denna studie var följande: MIR-338-3p: UCCAGCAUC- AGUGAUUUUGUUG och U6: CGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGUGAA- GCGUUCCAUAUUUUU. De omvända primrarna användes också i den omvända transkriptionssteget. Totalt miRNA extraherades från odlade celler och humana vävnadsprover som använder RNAiso för små RNA (Takara Bio, Otsu, Japan) enligt tillverkarens anvisningar. Poly-A-svansar tillsattes till miR-338 och U6 med miRNA Reaction Buffer Mix (TaKaRa Bio), och sedan cDNA syntetiserades från 5 ng av totalt RNA med användning av miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix (TaKaRa Bio). Realtids-PCR utfördes i en CFX96 realtids-PCR Detection System (Bio-Rad) med SYBR Förblandning Ex Taq II (TaKaRa Bio). PCR-betingelserna var 95 ° C under 30 s, följt av 40 cykler av 95 ° C under 5 s och 60 ° C under 30 s. Data normaliserades mot U6 snRNA. Efter amplifiering, gjordes en smältkurvanalys utförs för att bekräfta specificiteten av produkterna.

pcDNA expressionsplasmider och Plasmid Transfektion

ORF-sekvensen för NRP1 amplifierades från genomiskt DNA isolerat från AGS cell linje, och ORF-regionen av NRP1-cDNA subklonades sedan in i GV230 vektorn (GeneChem Corporation, Shanghai, Kina) .Den plasmid transfekterades in i AGS och MKN45-celler med användning av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Twenty-fyra timmar efter transfektion, den celler användes för en räddningsexperiment. AGS-celler som var stabilt transfekterade med NRP1 valdes med användning av 2 ug /ul puromycin (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Frankrike) 48 timmar efter transfektion.

miRNA Gene Kloning och ektopisk uttryck

humant miR-338-genen PCR-amplifierades från normalt genomiskt DNA och klonades in i en lentivirusvektor. De lentivirus genererades genom samtransfektion av HEK293T celler med plasmider pGC-LV, pHelper 1.0 och pHelper 2,0 med användning av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Virus skördades 48 h efter transfektion, och de infektioner utfördes i närvaro av 2 mg /ml polybren (GeneChem Corporation). Kontroll miRNA viruse köptes från GeneChem Corporation (Shanghai, Kina). AGS-celler som stabilt infekterade med MIR-338 valdes ut med hjälp av två ug /ul puromycin (Invitrogen) 48 timmar efter infektionen.

Gene Expression knockdown av RNA-interferens

NRP1 uttryck av AGS celler tystades genom transfektion följande riktade siRNA-sekvenser (Sangon Biotech, Shanghai, Kina) med Lipofectamine 2000 (Invitrogen);
: agatcgacgttagctccaa;: aacacctagtggagtgata;: CAATCACGTGCAGGCTCAA (där inte anges var siRNAanvänds). Kontroll siRNA (sic) genererades genom att införa 4 bassubstitutioner i NRP1 målsekvensen (GATAGGTCATGACTGCCC). Fyrtioåtta timmar efter transfektion, var NRP1 uttryck undersöktes genom immunoblotting.

Luciferase Reporter Assay

En PsicheckTM-2 Dual-Luciferase miRNA mål expressionsvektor användes för 3'UTR luciferas analyser (Sangon Biotech, Shanghai, Kina). Målet onkogen av miRNA-338 valdes på grundval av online mikroRNA måldatabas http://www.microrna.org/microrna/home.do. Primersekvenserna för vildtyp 3'UTR var följande: framåt: 5'CCGCTCGAG CAAAGGAC- GGAAGTGGAAGG -3 'och reverse 5'-ATTTGCGGCCGC GGAGTTCACAAGCACGAGG- TT-3'. Eftersom det finns två bindningsställen i NRP1 3'UTR, utformade vi två primersekvenser för mutant 3'UTR. För en mutant 3'UTR, primersekvenserna var följande: framåt: 5'GAAT- AATCAGGCATCTTTGTTGAGACCAAGTATGATT-3 'och omvänd: 5'GGTCTCAACAAAG- ATGCCTGATTATTCAAATGAAACC-3'. För den andra mutanten 3'UTR, primersekvenserna var följande: framåt: 5'GCGAAATCCAAGGCATCTTCACCAAGCGTATTCCGTGT-3 'och omvänd: 5'GCTTGGTGAAGATGCCTTGGATTTCGCTCAGTTTCC-3'. För luciferasanalysen ades Lipofectamine 2000 användes för att samtransfektera MKN45-celler med den HSA-miR-338 och PsicheckTM-2 Dual-Luciferase miRNA mål-expressionsvektorer innehållande vildtyp eller mutanta målsekvenser. Eldfluga luciferas-aktivitet mättes med användning av Dual Luciferase Assay (Promega, Madison, WI, USA) 18 timmar efter transfektion och resultaten normaliserades mot Renilla luciferas. Varje reporterplasmid transfekterades minst tre gånger (på olika dagar), och varje prov analyserades i triplikat.

cellviabilitet och Clonability Assays

De transfekterade cellerna såddes i 96-brunnsplattor vid en densitet av 1 x 10 ^{4 celler /brunn. En MTT-lösning (20 ul av 5 mg /ml MTT) tillsattes till kulturerna (till en total volym av 200 ul) och inkuberades under 4 hatt 37 ° C. Efter avlägsnande av odlingsmediet, var de kvarvarande kristallerna upplöstes i DMSO, och absorbansen vid 570 nm mättes. För kolonibildningsanalys såddes celler vid en låg densitet (1000 celler /platta) och fick växa tills synliga kolonier uppträdde. Cellerna färgades sedan med Giemsa, och kolonierna räknades.}

migration och invasionsanalyser

För de transwell migrationsanalyser, 10 × 10 ^{4-celler ströks ut i den övre kammaren med en icke-belagd membran (24-brunnars infogning; 8 mm porstorlek; BD Biosciences). För invasionsanalyser, 2 × 10 5 celler ströks i den övre kammaren med en Matrigel-belagda membran (24 brunnar insats, 8 mm porstorlek, BD Biosciences). För båda analyserna, ströks cellerna ut i ett serumfritt medium och ett medium kompletterat med 10% serum användes som en chemoattractant i den nedre kammaren. Cellerna inkuberades under 16 h vid 37 ° C och 5% CO2 i en vävnadsodlingsinkubator. Efter 16 h, avlägsnades de icke-migrerade /icke-invaderande celler avlägsnades från de övre sidorna av de transwell membranfilterinsatser med användning av bomullspinne kompresser. De migrerade /invaderade celler på de undre sidorna av skären färgades med Giemsa, och cellerna räknades.}

Antikroppar

Antikroppar mot fibronektin, vimentin, N-cadherin, E-cadherin, SNIGEL och GAPDH inköptes från Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Fosfor-ERK1 /2, fosfor-Akt, och fosfor-P38MAPK köptes från Abcam (Cambridge, Storbritannien), och totalt ERK1 /2, Akt, och P38MAPK var från BD Biosciences (USA). En antikropp mot NRP1 köptes från R &D Systems (Minneapolis, MN, USA) och HRP (pepparrotsperoxidas) -konjugerad get-anti-mus-IgG och HRP-konjugerad get-anti-kanin-IgG köptes från Santa Cruz Biotechnology

Immunoblotting

Totalt protein extraherades från de transfekterade cellerna med användning av RIPA-lysbuffert (Beyotime, Kina) i enlighet med tillverkarens instruktioner. Efter de helcells-proteinextrakt kvantifierades med användning av BCA-proteinanalys, var ekvivalenta mängder av cellysat lösas genom 10% SDS-polyakrylamidgelelektrofores och överfördes på ett polyvinylidenfluoridmembran, som därefter blockerades i 5% fettfri mjölk i TBST under 1 timme vid 4 ° C. Blottarna inkuberades därefter med primära antikroppar. Efter inkubering med HRP-konjugerade sekundära antikroppar, var proteinbanden visualiserades med användning av en förbättrad kemiluminiscens reagens (Millipore, Billerica, MA, USA). Följande spädantikropps användes: anti-fibronektin, 1:200; anti-vimentin, anti-E-cadherin och anti-N-cadherin, 1:1200; anti-SNIGEL och anti-GAPDH, 1:500; anti-fosfo-ERK1 /2, anti-fosfo-Akt, och anti-fosfo-P38MAPK, 1:2000; anti-NRP1, 1:600; anti-totalt ERK1 /2, anti-Akt, och anti-P38MAPK, 1:500; och HRP-konjugerad IgG, 1:7000.

xenograft-experiment

Man atymiska nakna möss 6 till 8 veckor gamla erhölls från djurexperimentella Center i Chongqing Medical University och acklimatiserades under 2 veckor. Studien genomfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna från Guide för skötsel och användning av försöksdjur i Chongqing Medical University. Protokollet godkändes av utskottet för etik djurförsök i Chongqing Medical University. Alla operationer utfördes under natriumpentobarbital anestesi, och alla ansträngningar gjordes för att minimera lidandet. Lika många AGS-celler (10 ^{6) med forcerad expression av MIR-338 eller forts-miR, med eller utan NRP1 restaurering, suspenderades i 100}

• PLOS ONE: Förhållandet mellan P53 Status och svar på kemoterapi hos patienter med magcancer: A Meta-Analysis
• PLOS ONE: Uttryck av EGF-familjen i Gastric Cancer: nedreglering av HER4 och dess Aktivera ligand NRG4