PLOS ONE: Resveratrol hämmar tillväxten av ventrikelcancer genom Induktion G1 fas Gripande och åldras i en SIRT1 beroende Manner

Abstrakt

Resveratrol, en naturligt förekommande polyfenolisk förening, har rapporterats utöva anticanceraktivitet genom att påverka olika molekylära mål. I denna studie undersökte vi effekterna och de bakomliggande mekanismerna för resveratrol på magcancer. Vi fann att resveratrol hämmade proliferationen av gastriska cancerceller på ett dos-beroende sätt. Vid koncentrationen 25 och 50 | iM, resveratrol hämmade cellernas livskraft och minskat klonogena potentialen hos gastriska cancerceller. Resveratrol behandling arrested gastriska cancerceller i G1-fasen och ledde till senescens i stället för apoptos. Regulatorer av cellcykeln och åldras vägar, inklusive cyklin D1, cyklin-beroende kinas (CDK4 och 6), p21 och P16, var oreglerad av resveratrol behandling. Den inhibitoriska effekten av resveratrol på magcancer har också kontrollerat In vivo
med hjälp av en nakna möss xenograft modell. Resveratrol (40 mg /kg /d) utövade hämmande aktiviteter på magcancer utveckling och avsevärt minskade fraktioner av Ki67-positiva celler i tumörprover från nakna möss. Efter resveratrol behandling, induktion av åldrande och förändringarna i uttrycket av regulatorerna är involverade i cellcykeln och åldras vägar liknade vad vi observerade In vitro
. Men utarmning av Sirtuin (Sirt) en omvänd de ovan beskrivna effekterna av resveratrol både In vitro Mössor och In vivo
. Våra data tyder på att resveratrol hämmar magcancer i ett SIRT1 beroende sätt och lämna detaljerade bevis för möjligheten att tillämpa resveratrol i gastric cancerprevention och behandling

Citation. Yang Q, Wang B, Zang W, Wang X , Liu Z, Li W, et al. (2013) Resveratrol hämmar tillväxten av ventrikelcancer genom Induktion G1 fas Gripande och åldras i en SIRT1 beroende sätt. PLoS ONE 8 (11): e70627. doi: 10.1371 /journal.pone.0070627

Redaktör: Dominique Heymann, Faculté de médecine de Nantes, Frankrike

Mottagna: 20 mars 2013, Accepteras: 19 juni 2013; Publicerad: 21 november 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (nr 81.101.869, 81.100.103, 81.171.536 och 81.000.868), National Basic Research Program of China (973 Program, nr 2012CB911202), och oberoende Innovation Foundation Shandong University (2012TS108) .Det finansiärer hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

konkurrerande intressen:.. författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Gastric cancer (GC) är den fjärde vanligaste cancerformen och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad dödlighet i världen. Enligt en global uppskattning, var totalt 989,600 nya GC fall diagnostiseras och minst 738,000 patienter dog av sjukdomen i 2008, står för 10% av det totala antalet dödsfall i cancer [1]. Även förekomsten av GC har minskat globalt, är det fortfarande hög i utvecklingsländerna, särskilt i Kina [1], [2]. Tidigare studier har visat att det intima sambandet mellan kronisk gastrit orsakas av Helicobacter pylori
infektion och utveckling av GC [3]. Dessutom har värd genetiska, miljömässiga, kost- och andra faktorer varit inblandad i mag onkogen process [1]. Eftersom det är fortfarande svårt att göra en tidig diagnos för GC, de flesta av patienterna diagnostiseras i avancerade stadier. Trots förbättringen av konventionell behandling för avancerad GC, inklusive kirurgi, kemoterapi och strålbehandling, längd eller livskvalitet hos patienter med avancerad GC är fortfarande dålig [2], [4]. Därför finns ett brådskande behov att utforska nya förebyggande läkemedel eller terapeutiska mål av GC.

Konsumtionen av färska frukter och grönsaker bidrar till en minskad förekomst av cancer, inklusive GC [2], [5]. Kliniska tillämpningar antyder också att vissa bioaktiva dietary molekyler har förmågan att inhibera flera onkogena steg [5] - [7]. Resveratrol (Res, 3,5,4'-Trihydroxystilbene) är en naturligt förekommande polyfenolisk förening närvarande i nästan 70 växtarter, inklusive huden av röda druvor, jordnötter, bär och andra [6] - [8]. Res rapporterades först att utöva antitumöraktiviteter i 1997 [8]. Senare rapporter har visat att Res ger hämmande effekt på olika typer av cancer, såsom koloncancer, bröstcancer och lymfom, och påverkar olika molekylära mål [9] - [11]. Sirtuin en (SIRT1), en klass III nikotinamidadenindinukleotid nukleotid (NAD ^{+) - beroende histon /protein-deacetylas, har rapporterats vara en viktig mål för Res i flera tumörmodeller [9], [10]. Men vissa uppgifter visar strider resultat tyder på att Res utövar chemoprotective effekter oberoende av SIRT1 [11]. De hämmande effekterna av Res på GC och den bakomliggande mekanismen är inte väl studerat.}

I den aktuella studien, visade vi att Res hämmade proliferation av GC-celler In vitro
. Res behandling inducerad cellcykelstopp vid G1-fasen och ledde till cellulärt åldrande. Dessa effekter av Res var återgått genom utarmning av SIRT1. De hämmande SIRT1 beroende verksamhet Res GC-celler också kontrollerat In vivo
. Sammantaget våra resultat tyder på att Res utövar SIRT1 beroende hämmande effekter på GC och föreslår en terapeutisk roll för Res i GC.

Material och metoder

Etik Statement

All djurstudier har godkänts av den etiska kommittén i Shandong University School of Medicine (nr 001 år 2011 för djuretik godkännande) och alla ansträngningar gjordes för att minimera lidandet.

cellinjer, odlingsbetingelser och Res behandling

Human GC cellinjer AGS (erhållna från Cell Resource Center, Shanghai Institute of biokemi och cellbiologi vid Chinese Academy of Sciences), BGC-823 och SGC-7901 (köpt från Kina Center for Type Culture Collection, Wuhan, Kina) användes i denna studie. Cellerna odlades i F12 (AGS) eller RPMI 1640 (BGC-823 och SGC-7901) innehållande 10% FCS, 100 enheter /ml penicillin och 2 mmol /L L-glutamin vid 37 ° C i en fuktig atmosfär innehållande 5% CO _{2. Hög renhet Res köptes från Sigma (St. Louis, MO, USA), upplöstes i DMSO och tillsattes till odlingsmediet vid den angivna koncentrationen. Alla experiment utfördes 24 h efter Res tillskott, om inte annat anges.}

Små Interference RNA Transfektion

Kemiskt modifierade små störande RNA (siRNA) som riktar SIRT1 och kontroll siRNA köptes från GenePharma (Shanghai , Kina). Sekvensen för den SIRT1 siRNA var 5'-CCAUCUCUCUGUCACAAAUTT-3 '. Cellerna inkuberades över natten och transfekterades sedan med siRNA med hjälp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) enligt tillverkarens protokoll. Fyrtioåtta timmar efter siRNA transfektion, behandlades cellerna med 50 | iM Res under 24 timmar innan ytterligare studier.

Cell Viability Assay

Proliferation bedömdes med användning av Cell Titer 96 ® Vattenhaltiga One Solution cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI, USA). Kortfattat, 2 x 10 ^{3-celler såddes i en 96-brunnars platta och fick växa under 24 h. Tjugofyra timmar senare, 20 | j, l MTS (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-karboxi-metoxifenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium) tillsattes till varje väl. Efter inkubation under 3 h vid 37 ° C, mättes absorbansen vid 490 nm registrerades på en Varioskan Flash Multiplate Reader (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Cellviabilitet beräknades med följande formel: relativ cellviabilitet = (genomsnittlig absorbans för behandlad grupp - genomsnittlig absorbans för blank) /(genomsnittlig absorbans för kontroll grupp- genomsnittliga absorbansen för blank). Analyser utfördes i triplikat och upprepades tre gånger.}

kolonibildningsanalys

Celler såddes i sex-brunnars plattor (300 eller 500 celler per brunn) och inkuberades under 10 dagar tills kolonierna var tillräckligt stor för att vara tydligt urskiljas. Cellerna fixerades med metanol och färgades med kristallviolett och antalet kolonier med mer än 50 celler räknades manuellt. Experiment utfördes i triplikat och upprepades tre gånger.

Cell Cycle Analysis

Celler skördades, fixerades med förkyld 70% etanol vid 4 ° C över natten och färgades sedan med propidiumjodid (Beyotime , Jiangsu, Kina) innehållande RNas A vid 37 ° C under 30 minuter i mörker. Cellcykelfördelning bestämdes med användning av en flödescytometer (BD Biosciences, San José, CA, USA) och data analyserades med multicycle programvara (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA, USA). Experiment utfördes oberoende tre gånger.

Apoptos analys

Upptäckt och kvantifiering av apoptos utfördes genom märkning av DNA-strängbrott med hjälp av en in situ Cell Death Detection Kit, TMR röd (Roche Applied Science, Basel, Schweiz). Celler eller paraffinsektioner av xenotransplantat märktes med TUNEL enligt tillverkarens instruktioner. För celler, behandling med 0,2 mM H _{2O 2 för 12 timmar fungerade som positiv kontroll. För paraffinsnitt, var positiva kontroller köptes från Millipore (Billerica, MA, USA). Kärnorna motfärgades med DAPI (Beyotime) och bilderna eller sektioner avbildades genom ett fluorescensmikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) med användning av cellsens Dimension programvara. Experiment utfördes oberoende av varandra tre gånger.}

β-galaktosidas Färgning

Åldrande bedömdes med användning av en Åldrande β-galaktosidas Staining Kit (Beyotime). I korthet innebar detta celler eller frysta sektioner av xenotransplantat fasta och inkuberades därefter med nyframställd β-galaktosidas (β-Gal) färglösningen vid 37 ° C över natten. Experiment utfördes oberoende tre gånger.

Stabila Lentivirala-kort hårnål RNA (shRNA) GC celler

Lentivirala vektorer innehållande kontroll eller SIRT1 shRNA konstruerades av GenePharma och används för att transfektera BGC-823 celler. Effektiv knockdown av SIRT1 verifierades genom Western blöt. För stabil transduktion, kontroll-lentivirus-infekterade eller SIRT1 shRNA-lentivirus-infekterade BGC-823-celler odlades i komplett medium som medföljer 2 | ig /ml puromycin under fyra veckor och betraktas som LV-C och LV-S, respektive.

nakna möss xenograftmodell

Kvinna atymiska BALB /c nakna möss (6~8 veckor) köptes från Peking University (Beijing, Kina) och hölls under specifika patogenfria förhållanden på Key laboratoriet för Cardiovascular ombyggnad och Function Research, Qilu sjukhus, Shandong University. Mössen delades slumpmässigt in i fyra grupper (8 möss för varje grupp): grupp I och II, BGC-823-celler (1 x 10 ^{6 celler per injektion i 0,1 ml PBS) injicerades subkutant in i flankregionen av nakna möss; grupp III, LV-C (BGC-823 celler) injicerades; och grupp IV, LV-S (BGC-823 celler) injicerades. Efter implantation, den nakna möss från grupperna II, var III och IV behandlades med Res (40 mg kg -1 i 0,1 ml vegetabilisk olja, administreras genom sondmatning en gång dagligen). Den subkutana tumörstorleken mättes med ett skjutmått, och tumörvolymerna beräknades med formeln (längd) x (bredd 2) /2. Mössen avlivades fyra veckor senare. Tumörerna skördades och bearbetades för Western blöt och immun studier.}

Real Time-kvantitativ PCR (RT-QPCR) Review

Totalt RNA i celler isolerades med användning av TRIzol reagens (Invitrogen) och omvandlas till cDNA med användning av PrimeScript ™ RT reagenskit (Takara, Tokyo, Japan). RT-QPCR utfördes för gener, inklusive cyklin D1, cyklinberoende kinas 4 (CDK4), p21 och β-aktin såsom tidigare beskrivits [12]. Sekvenserna av de amplifieringsprimers är listade i tabell S1. MRNA uttryck av cykhn-D 1, CDK4 och p21 normaliserades till p-aktin i förhållande till kontrollen med hjälp av 2 ^{-ΔΔCt metod. Varje experiment upprepades tre gånger.}

Western Blöt

Totalt protein från cellerna eller de tumörprover extraherades med RIPA lyseringsbuffert (Beyotime) såsom beskrivits [12]. Proteinkoncentrationen bestämdes med användning av BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Membranet sonderades med antikroppar mot SIRT1 (Abcam, Cambridge, MA, USA), bcl-2, bax, kaspas-3, cyklin D1, CDK4 och 6 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), P16 och p21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Den sekundära antikroppen som användes var en pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerad anti-kanin eller mus-antikropp. Proteinbanden visualiserades med användning av ett ECL-systemet (Pierce). β-aktin (Cell Signaling) fungerade som en laddningskontroll.

Immunohistokemi

tumörprover från nakna möss avparaffinerades, uppblött och antigen hämtas. Sektionerna inkuberades med en antikropp mot Ki67 (1:500, Abcam) över natten vid 4 ° C. HRP-konjugerad anti-kanin-IgG och DAB färgning användes för att visualisera Ki67 antikroppen. Glasen slutligen motfärgades med hematoxylin. Objektglasen med bild genom en Olympus ljusmikroskop (Tokyo, Japan) med användning av cellsens Dimension programvara. De Ki67-positiva celler räknades manuellt och procent av Ki67-positiva celler bedömdes per fält. Fem separata fält räknades för varje avsnitt.

Statistiska analyser

Data uttrycktes som medelvärdet ± SD. De statistiska analyserna utfördes med hjälp av statistiska paket för samhällsvetenskap (SPSS, version 16.0, Chicago, IL, USA) genom envägs ANOVA med Tukeys post-hoc-test. P-värden som är mindre än 0,05 ansågs statistiskt signifikant.

Resultat

Res Hämmar livskraft GC-celler i en SIRT1 beroende sätt

Tre GC cellinjer (AGS, BGC-823 och SGC-7901) undersöktes i våra experiment. Odling av cellerna i vehikel (0,1% DMSO) påverkade inte cellviabilitet (data ej visade). Men när de behandlas med olika koncentrationer av Res under 24 timmar, celltillväxt var dosberoende hämmas vid 25, 50, 100 och 200 iM Res (Figur 1A). Notera var spridning av AGS naturligtvis hämmade när de behandlades med 10 iM Res, som inte observerades i de övriga två cellinjer (Figur 1A). I alla de tre cellinjer, närvaro av 100 | iM Res var tillräckligt för att inducera mer än 50% tillväxthämning (56,78% för AGS, 54,87% för BGC-823 och 52,16% för SGC-7901, respektive). Därför var 25 och 50 um Res används för efterföljande experiment. För att bestämma den funktionella rollen av SIRT1 i Res behandling, vi slog ner SIRT1 uttryck med hjälp av en specifik siRNA. Den effektiva inhiberingen av SIRT1 uttryckning verifierades genom western blöt (Figur 1B). Resultaten av MTS-analys visade att i SIRT1-minskade celler, gjorde Res inte inhibera cellproliferation (Figur 1C). Dessa data indikerar att Res kan hämma tillväxten av GC-celler och att den hämmande effekten kan räddas av SIRT1 utarmning.

Res Minskar Klonogena Potential av GC-celler i en SIRT1 beroende sätt

för tumörceller, har kolonibildning befunnits vara en mer känslig parameter än viabilitet för att bedöma effekten av ett läkemedel. Således ansträngningar sedan för att bestämma effekten av Res på klonogena potentialen hos GC-celler. Res, vid koncentrationen 25 ^ M, har lett till en betydande minskning av foci siffror samt storlekar i GC-celler. Efter behandling med 50 | iM Res den klonogena potentialen minskat ytterligare. Men knockdown av SIRT1 före Res behandling ökade antalet härdar till en nivå som är jämförbar med vehikelgruppen (Figur 2).

Res inducerar Ansamling av GC celler i G1 fasen i en SIRT1 beroende sätt

för att undersöka den hämmande effekten av Res på GC-celler, genomförde vi cellcykelanalys. Vi observerade att 25 och 50 | im Res ökat andelen celler i G1-fasen i både BGC-823 och SGC-7901-celler (Figur 3A och 3B). Induktionen av G1-fasen rest av Res var också dosberoende. Res vid en koncentration av 50 ^ M visade en starkare effekt än den gjorde vid 25 ^ M. Ökningen av antalet celler i G1-fasen åtföljdes av en minskning av cellpopulationer i huvudsak i de S-faserna. Utarmning av SIRT1 före Res behandling minskat G1 fas induktion av Res (figurerna 3A och 3B). Att bekräfta ovanstående resultat, undersökte vi uttrycket av cellcykelregulatorer i G1-fasen, inklusive cyklin D1, CDK4, CDK6, p21 och P16 i BGC-823 celler. Såsom visas i fig 3C, i Res-behandlade BGC-823-celler, proteinnivåer av aktivatorer av G1 /S övergång (cyklin D1, CDK4 och CDK6) minskade, medan proteinnivåer av inhibitorer av CDK (CDKIs) (p21 och p16) ökade. Däremot var dessa förändringar inte i SIRT1-utarmat BGC-823 celler när de behandlades med 50 iM Res. Liknande resultat erhölls från RT-QPCR av cyklin D1, CDK4 och p21 (Figur 3D).

Avsaknaden av sub-G1-celler indikerade att Res behandling inte orsakade apoptos i de GC-celler (figur 3A) , vilket var i linje med resultaten av TUNEL märkningsexperiment från BGC-823-celler (Figur S1A). Proteinnivåer av apoptosrelaterade molekyler, såsom bcl-2, bax och caspas-3, från varje grupp var jämförbara (figur S1B). Sammantaget visar våra resultat att Res inducerar G1 fasstillestånd i GC-celler i en SIRT1 beroende sätt och inducerar inte apoptos.

Res inducerar Åldrande av GC-celler i en SIRT1 beroende sätt

i våra händer, resulterar Res i tillväxtstopp i stället för ökad apoptos. Därför gjorde vi ytterligare ansträngningar för att undersöka om Res kan framkalla åldrande i GC-celler. P-gal-färgning, en specifik markör för däggdjurs åldrande celler, användes. Efter Res behandling, fann vi ökade fraktioner av celler färgades med β-Gal. Men förbehandlingen med SIRT1 siRNA blockerad Res-inducerad cellulärt åldrande (Figur 4). Liknande resultat erhölls från både BGC-823 och SGC-7901 celler, vilket tyder på att Res anhöriga på SIRT1 att inducera cellulärt åldrande i GC-celler.

Res hämmar tumörtillväxt in vivo i en SIRT1 beroende sätt

Nästa ytterligare studier genomfördes för att bestämma effekterna av Res på BGC-823 xenotransplantat tillväxt i nakna möss. För In vivo
studie, var stabila transducerade Lentiviral-shRNA BGC-823 celler används. Av de fyra SIRT1 shRNA-lentivirus, LV-1 och LV-4 utövade uppenbara tyst effekter på SIRT1 uttryck (Figur S2). Efter fyra veckors screening, var uttrycket av SIRT1 hålls vid de minskade nivåerna i de stabila Lentiviral-shRNA BGC-823-celler (Figur S2). Stabila LV-1 Lentiviral-shRNA BGC-823-celler användes i efterföljande xenografter studier på grund av de starkare hämmande effekt på SIRT1 uttryck jämfört med LV-4. Alla djuren överlevde till slutet av våra experiment, och ingen uppenbar skillnad hittades i sin kroppsvikt (data ej visade). Fyra veckor efter implantation, mätningar av tumörvolymerna indikerade att Res behandling minskade signifikant tillväxten av BGC-823 xenotransplantat (Res vs kontroll: 0.5728 ± 0,2276 cm ^{3 vs 1.4288 ± 0,1741 cm 3, P < 0,001) . Stabil transduktion av kontroll shRNA-lentivirus inte signifikant påverka tumörvolymen (Res vs Res + Ci: 0.5728 ± 0,2276 cm 3 vs 0,68 ± 0,0672 cm 3, P = 0,603). Men i SIRT1-utarmat xenotransplantat var de hämmande effekterna av Res på tumörväxt räddade (Res + Si vs Res + Ci: 1.2313 ± 0,1777 cm 3 vs 0,68 ± 0,0672 cm 3, P < 0,001, Res + Si vs kontroll: 1.2313 ± 0,1777 cm 3 vs 1,4288 ± 0,1741 cm 3, P = 0,123) (Figur 5A). I Res-behandlade xenografter, spridning markör, Ki67, minskade signifikant (Figur 5B) (% av Ki67-positiva celler, Res vs kontroll: 3 ± 1,8 vs 44,67 ± 3,79, P < 0,001). Senescens observerades i xenografter från Res-behandlade möss som indikeras av β-Gal-färgning (figur 5B). Dock ingen uppenbar apoptos inducerad av Res i xenotransplantat (Figur S1D) och inga förändringar observerades i regulatorer för apoptos, såsom bcl-2, bax och kaspas-3 (Figur S1C). Dessa resultat överensstämde med In vitro
experiment. Dessutom förändringar i uttrycket av regulatorer av cellcykeln, inklusive cyklin D1, CDK4, CDK6, p21 och p16 liknade vad vi observerade In vitro
(figur 5C). Alla förändringar som observerats i Ki67, β-Gal och cellcykelregulatorer har kastats av SIRT1 utarmning (figurerna 5B och C) (% av Ki67-positiva celler, Res + Si vs Res + Ci: 46,32 ± 6,03 mot 2,65 ± 1,53, P < 0,001, Res + Si vs kontroll: 46,32 ± 6,03 vs 44,67 ± 3,79, P = 0,946) katalog}

Diskussion

Res, en naturlig polyfenoler, utvärderas för närvarande som en lovande cancer. ombud. Även om det har visat sig ge antiproliferativa effekter mot flera cancertyper både i cellkultur och xenograft-modeller [9] - [11], dess kemoprevention effekter på GC och den bakomliggande mekanismen har inte studerats. I denna studie visade vi att Res hämmade spridningen av GC cellinjer (AGS, BGC-823 och SGC-7901). Den anti-tillväxtaktivitet observerades efter att cellerna behandlades med 25 ^ M Res under 24 h, och den inhiberande effekten var dosberoende. Vid en koncentration av 50 | iM Res, inhibitionskvoterna för dessa tre cellinjer var 41%, 34% och 32%, respektive. När koncentrationen av Res ökade ytterligare, var den hämmande effekten förstärkas. Både 100 och 200 ^ M Res inhiberade tillväxt med mer än 50% jämfört med vehikelgruppen. Dessutom är den högre dosen av Res alltför stor för att uppnå In vivo Mössor och därmed är ingen mening i en klinisk miljö [13], [14]. Därför var de två nedre effektiva koncentrationer av 25 och 50 pm Res används i efterföljande studier. Tillväxthämningsaktiviteten för Res verkar vara cellspecifik, eftersom IC50 varierar beroende på celltyp och varierar från 27 ^ M till 180 | iM [9], [10], [15], [16]. En del av dessa studier har också visat att Res utövar de hämmande effekterna i en tidsberoende sätt [15], [16]. Koncentrationen och varaktighet Res behandling som används i vår studie överensstämde med de flesta rapporter från andra grupper [8], [9], [16]. För In vivo
studie, administration metod som vi använde är sondmatning eftersom detta är den metod som ofta används i möss som ett alternativ till intraperitoneal injektion [15], [17]. Dessutom har studier på möss visat att Res absorberas effektivt efter oral administration och kan hittas i hela kroppen [17], [18]. När det används In vivo
, Res minskade signifikant proliferation av celler som kännetecknas av Ki67 uttryck, vilket överensstämmer med resultaten från våra in vitro
experiment.

Res kan bromsa spridningen av cancerceller genom olika mekanismer, bland vilka, cellcykelreglering är en viktig ett [9], [15], [19]. Vår in vitro
data visade att behandlingen av GC-celler med Res inducerar G1 fas stillestånd. G1-fasen är den första av de fyra faserna av cellcykeln som äger rum i eukaryotisk celldelning. G1 är en särskilt viktig cellcykelfasen eftersom det är den punkt där en cell förbinder sig att en omgång av division. Progression genom G1 fas kräver bildandet och verkan av cyklin D-CDK4 eller -CDK6 komplex. Dessa komplex fosforylerar sedan retinoblastom, vilket leder till frisättning av de E2F-transkriptionsfaktorer och nedströms gentranskription involverade i S-fas progression. Aktiviteterna hos cyklin D-CDK-komplex regleras av uppströms-hämmare, inklusive medlemmar av INK (p15, P16 och P18) och CIP familjer (p21, p27 och P57) [20], [21]. Längs samma linje, tillsammans med G1 fas stillestånd, observerade vi nedreglering av cyklin D1, CDK4 och CDK6 och uppreglering av p21 och P16 i Res-behandlade GC-celler. Vår In vivo
resultaten av uttrycksnivåer av dessa cellcykelregulatorer i tumörprover är förenliga med In vitro
resultat. Våra resultat är också i linje med de tidigare studier [15], även om vissa andra har rapporterat att S-fasen gripandet induceras av Res [9], [19]. Bestående tillväxtstopp kan leda till apoptos eller åldrande i celler. Eftersom båda p21 och P16 signalvägar deltar i åldrande progression medieras av olika typer av stress [22], [23], utförde vi β-Gal-färgning. Res behandling signifikant ökad frekvens av åldrande GC-celler i en dosberoende sätt. Den cellulärt åldrande programmet är en viktig barriär mot cancer initiering och utveckling [24], [25]. Även tidigare studier visar att genom dämpning av oxidativ stress och förbättring av ämnesomsättningen, Res utövar anti-aging effekter både In vitro Mössor och In vivo
[26] - [28], de motsatta effekter har påvisats vid cancer. Res har visat sig inducera senescens-liknande tillväxthämning i flera typer av cancerformer [29], [30]. Den dubbla rollen av Res i cellulärt åldrande, fördröja åldrandet i normala vävnader och accelererande åldrande i tumörer, gör det till en idealisk kandidat för förebyggande och behandling av cancer.

Apoptos är en annan vanlig effekt som vanligtvis observeras i Res-behandlade cancerceller [9], [11], [15], [16]. Experimentella bevis tyder på att apoptos kan förmedlas genom flera olika vägar och många reglerande molekyler. Bland dessa regulatorer, proteinerna som innefattar den bcl-2-familjen är viktiga. Det finns både anti-apoptotiska proteiner (BCL-2, bcl-XL) och pro-apoptotiska proteiner (bax, dålig, bak och BCL-XS) i denna familj. En ökning av den pro-apoptotiska bax /antiapoptotiska Bcl-2-förhållande förbättrar permeabiliteten hos mitokondriemembranet, orsakar frisättning av cytokrom c från mitokondrier till cytosolen och, i sin tur, resulterar i aktiveringen av kaspas-9 och nedströms rikta kaspas-3 [31]. Trots denna inneboende apoptotiska vägen, de pro-apoptotiska ligander, såsom FasL, genom att binda till deras receptorer, orsakar aktivering av kaspas-8 och nedströms effektorer, såsom kaspas-3. Aktiveringen av effektorceller kaspaser inducerar klyvningen av många cellulära substrat och direkt orsakar apoptos [31] - [33]. Trots att många tidigare rapporter indikerade att apoptos var ansvarig för Res-inducerad tillväxthämning, vi inte observera uppenbara apoptos i Res-behandlade GC-celler. Denna avsaknad av apoptos kan bero på koncentrationen och varaktigheten av Res behandling anpassas vårt experiment eftersom studier från olika grupper visar att Res utövar doser och varaktighet beroende effekter [34], [35]. Dessutom, eftersom effekterna av Res är också cellspecifika [36] - [38], GC celler som används i vår studie kan vara resistenta mot Res apoptos

Res har flera mål. bland vilka den klass III NAD ^{+ - beroende deacetylas SIRT1 är den mest studerade. Även en biokemisk studie visade att Res var inte en direkt aktivator av SIRT1 [39], har Res fortfarande betraktats som en klassisk agonist av SIRT1. Ett flertal studier visar att Res utövar olika effekter i olika modeller i en SIRT1 beroende sätt [40], [41]. I vårt experiment, SIRT1-utarmning vände tillväxthämning av Res båda In vitro Mössor och In vivo
. G1 fas gripande och åldrande inducerad av Res behandling räddades av SIRT1-utarmning. Dessa resultat tyder på att inhibitionseffekter Res på GC är beroende av SIRT1. Enligt de tidigare studierna, kan SIRT1 reglera genuttryck via två olika mekanismer. Först, direkt, SIRT1 medierar direkt deacetyleringen av ett protein och sedan ökar dess ubiquitinering och efterföljande ubikitin proteasom nedbrytning [42]. För det andra, indirekt, SIRT1 utövar deacetylas aktivitet påverkar bekräftelse kromatin eller undertrycka verksamhet transkriptionsfaktorer och sedan reglerar transkriptionen av gener [43] - [45]. Eftersom molekylerna (cyklin D1, CDK4, CDK6, p21 och P16) upptäckts i våra experiment har inte redovisats som direkta mål för SIRT1, spekulerade vi att SIRT1 kan reglera uttrycket av dessa gener huvudsakligen genom indirekt mekanism. Resultaten av RT-QPCR stöder också denna hypotes.}

Sammantaget tyder våra resultat att Res hämmar både spridningen av GC-celler In vitro Mössor och tillväxten av xenograft In vivo
. Res behandling inducerar G1 fas rest i GC-celler och leder till åldrande i stället för apoptos. SIRT1-utarmning räddar de ovan beskrivna effekterna av Res båda In vitro Mössor och In vivo
. Vårt arbete visar att Res hämmar GC i en SIRT1 beroende sätt och ger detaljerade bevis för möjligheten att tillämpa Res i förebyggande GC och terapi.

Bakgrundsinformation
figur S1.
Res utövar någon effekt på apoptos av BGC-823 celler. (A) Apoptos indikerades genom TUNEL-märkning (röd) och BGC-823-celler motfärgades med DAPI (blå). Behandling med H 2O 2 tjänade som den positiva kontrollen. Ursprunglig förstoring: x 200. Skalstrecken, 50 um. (B) Regulatorer av apoptos i BGC-823 celler, inkluderande bcl-2, bax och kaspas-3 analyserades genom western blöt. (C) Regulatorer av apoptos i xenografter, inklusive bcl-2, bax och kaspas-3 analyserades genom western blöt. För detektion av kluvna caspase-3, BGC-823 celler som behandlats med H 2O 2 tjänade som positiv kontroll (som visas i den högra panelen). (D) Apoptos i xenografter detekterades genom TUNEL-märkning (röd) och sektionerna motfärgades med DAPI (blå). Sektioner från kvinnliga gnagare bröstkörtel erhållna 3~5 efter avvänjning av råttungar (Millipore) tjänade som positiv kontroll. Ursprunglig förstoring: x 200. Skalstrecken, 50 um. "R" representerar resveratrol, representerar "Ci" kontroll siRNA, och "Si" representerar SIRT1 siRNA
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070627.s001
(TIF) Review figur S2.
Knockdown av SIRT1 genom shRNA-lentivirus. (A) BGC-823-celler transfekterades med kontroll- eller SIRT1-specifika shRNA-lentivirus. Transfektionseffektiviteten utvärderades med ett fluorescensmikroskop. Vid en infektionsmultiplicitet (MOI) av 50, var mer än 90% av cellerna transfekterade med shRNA-lentivirus. Efter fyra veckors screening med puromycin, alla levande celler transducerades. Förstoring: x 100, bar för 200 | j, m. (B) Cellerna skördades 4 dagar efter infektion och 28 dagar efter puromycin screening. Den tysta effektivitet SIRT1 verifierades genom Western blot
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070627.s002
(TIF) Review tabell S1.
Primers för RT-qPCR experiment utförda i denna studie
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070627.s003
(DOC) Review

• PLOS ONE: RhoE Främjar metastas i ventrikelcancer genom en mekanism Beroende på ökat uttryck av CXCR4
• PLOS ONE: mykofenolsyra inhiberar migration och invasion av Gastric cancerceller via flera molekylära vägar