PLOS ONE: Mir-184 bindningsställe rs8126 T > C polymorfism i TNFAIP2 är förknippad med risk för Gastric Cancer

Abstrakt

Bakgrund

TNFAIP2
är en avgörande gen som är involverad i apoptos. Single nucleotide polymorphisms (SNP) i dess miRNA bindningsställen kan modulera funktionerna hos miRNA-målgener och därmed risk för cancer. I denna studie undersökte vi associationer mellan potentiellt funktionella SNP i miRNA bindningsställen i 3'UTR av TNFAIP2 Mössor och gastric cancerrisk i en USA: s befolkning.

Metoder

Vi har utfört en fall-kontrollstudie av 301 gastric cancerpatienter och 313 cancerfria kontroller frekvens matchas av ålder, kön och etnicitet. Vi genotypas fyra utvalda TNFAIP2
SNP (rs8126 T > C, rs710100 G > A, rs1052912 G > A och rs1052823 G > T). Och använde logistisk regressionsanalys för att bedöma sammanslutningar av dessa SNP med cancerrisk

Resultat

rs8126 CC genotyp associerades med en signifikant ökad risk för magcancer (justerat OR = 2,00, 95% CI = 1,09-3,64 och P
= 0,024) , jämfört med de kombinerade rs8126 TT + TC genotyper, särskilt i nuvarande dricker. Men ingen av andra TNFAIP2
SNP var förenat med risk för magcancer.

Slutsatser

Våra data tyder på att TNFAIP2
miRNA bindningsställe rs8126 T > C SNP kan vara en markör för mottaglighet för magcancer, och detta fynd kräver ytterligare validering av större studier

Citation: Xu Y, Ma H, Yu H, Liu Z, Wang LE, Tan D,. et al. (2013) Mir-184 bindningsställe rs8126 T > C polymorfism i TNFAIP2
är förknippad med risk för magcancer. PLoS ONE 8 (5): e64973. doi: 10.1371 /journal.pone.0064973

Redaktör: Nathan A. Ellis, University of Illinois i Chicago, USA

emottagen: 23 juli 2012; Accepteras: 23 april 2013, Publicerad: 28 maj 2013

Copyright: © 2013 Xu et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av National Institute of Health bidrag R01 CA131274 och R01 ES011740 (Q. Wei), och P30 CA016672 (The University of Texas MD Anderson Cancer Center). Dess innehåll är helt och hållet av författarna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:. Prof Qingyi Wei från M.D. Anderson Houston, Texas, är en redaktör för PLOS ONE. Detta ändrar inte författarnas anslutning till alla PLOS ONE politik för att dela data och material.

Introduktion

Gastric cancer är en av de främsta orsakerna till cancerrelaterade dödsfall i världen, även om båda dess förekomst och dödlighet har minskat under det senaste decenniet [1]. År 2010 fanns det cirka 21.000 nydiagnostiserade patienter och 10,570 dödsfall i denna sjukdom i USA [2]. Epidemiologiska studier har visat att miljöfaktorer, inklusive kost rik på saltade och nitrerade livsmedel, tobaksbruk, alkohol förbrukning och, i synnerhet, Helicobacter pylori
( H. Pylori
) infektion, är viktiga faktorer för etiologin av magcancer [3]. Men bara en bråkdel av människor anta liknande livsstil eller utsätts för samma miljö riskfaktorer så småningom utvecklade magcancer, vilket tyder på att värd eller genetiska faktorer kan också spela en roll i etiologin av sjukdomen [4].

Bland alla patofysiologiska förändringar orsakade av olika etiologiska faktorer relaterade till gastric cancer, har induktion av oxidativa skador på DNA i epitelceller i magen har visat sig vara en stark koppling till cancer [5], [6]. För att förhindra en okontrollerad celltillväxt till följd av denna typ av DNA-skada, måste några cellcykelkontrollmekanismerna initieras för att förhindra uppkomsten av mutationer eller för att initiera apoptos av cellerna med överväldigande skada på DNA.

MicroRNAs ( miRNA), en klass av endogena och små icke-kodande reglerande RNA reglerar negativt genuttrycket vid posttranskriptionsnivå genom hybridisering till komplementära sekvenser i den 3'-otranslaterade regionen (3'UTR) av målet budbärar-RNA (mRNA) [ ,,,0],7], [8], [9], [10]. Nya studier har visat signifikanta effekter av miRNA på olika biologiska processer, inklusive celldifferentiering, proliferation, cellcykelprogression och apoptos. Förändrade uttryck av miRNA samt deras potentiella funktioner tumörsuppressorer och onkogener har visats i flera typer av cancer, inklusive magcancer [11], [12]. Samtidigt har flera relativt vanliga genetiska varianter, såsom single nucleotide polymorphisms (SNP), har identifierat som biomarkörer för genetisk mottaglighet för cancer genom molekylära epidemiologiska studier. På grund av deras potentiella effekter på miRNA uttryck och efterföljande inverkan på mRNA-transkription, miRNA SNP eller miRNA relaterade SNP, såsom de som ligger i miRNA bindningsställen på 3 'otranslaterade regionen (UTR) av sina målgener har varit inblandad som avgörande genetiska faktorer i känslighet för olika cancerformer. Eftersom deras roller i cancer etiologi fortfarande oklart, är det viktigt att förstå funktionella och evolutionära betydelsen av dessa miRNA relaterade SNP genom deras effekter på cancerrisken och deras interaktion med risk miljöfaktorer i etiologin av magcancer [13].

att tillhöra den SEC6 familjen, var tumörnekrosfaktor α-inducerad protein 2 (TNFAIP2, även känd som B94 eller EXOC3L3), som är en typ av pro-apoptotiska proteinet, identifierades ursprungligen som en gen vars uttryck kan induceras av tumörnekrosfaktor-alfa (TNF) i umbilikalvensendotelceller [14]. TNFAIP2
är belägen på kromosom 14q32 och kodar för ett protein av 654 aminosyrarester med en skenbar molekylvikt av 73 kDa. Bestående av 11 exoner och 10 introner, TNFAIP2
spänner cirka 13,45 kb av genomiskt DNA [15]. I dbSNP databasen (http://egp.gs.washington.edu/), är denna gen rapporteras ha 180 SNP, varav 15 SNP i 3'UTR av TNFAIP2
finns i den förutsagda miRNA bindningsställen, men bara fyra av dessa miRNA relaterade SNP är vanliga [dvs. mindre vanliga allelen frekvens (MAF) > 0,05]. Dessa fyra SNP är rs8126 T > C (lokaliserad inom bindningsstället för MIR-184), rs710100 G > A (inom MIR-155), rs1052912 G > A (inom MIR-105) och rs1052823 G > T (inom MIR 550) (http://compbio.uthsc.edu/miRSNP) [Fig. 1A].

Nya studier har visat att dessa SNP i miRNA bindningsställen potentiellt kan vara förknippad med human cancerrisk [15], [16]. Därför hypotes vi att TNFAIP2
SNP är associerade med känslighet för magcancer. För att testa denna hypotes, genomförde vi en fall-kontrollstudie för att utvärdera sambandet mellan dessa fyra TNFAIP2
SNP i miRNA bindningsställen och risk för magcancer i ett amerikanskt icke-spansktalande vita befolkningen.

Material och metoder

försökspersoner

försökspersoner var patienter med nydiagnostiserad och histologiskt bekräftade magcancer vid University of Texas MD Anderson cancer Center (Houston TX) mellan mars 2002 och februari 2011, som rekryterades för ett pågående fall-kontrollstudie av magcancer. Samtidigt var cancerfria kontrollpersoner rekryterats genom frekvens matchning på ålder (± 5 år), kön och etnicitet (icke-spansktalande vita kontra andra) från en pågående molekylär epidemiologi studie av huvud- och halscancer mellan 2002 och 2011 [17]. Dessa cancerfria kontrollpersoner var inte sjukhuspatienter som sökte vård, eller genetiskt samband med fallen. Ytterligare information om riskfaktorer, som rökning och alkoholanvändning, samlades från varje kvalificerad försöksperson som hade lämnat informerat samtycke. Studieprotokollet godkändes av University of Texas MD Anderson Cancer Center Institutional Review Board.

Genotypning

Genom-DNA extraherades från buffycoat fraktion av varje blodprov med hjälp av en Blood Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) enligt tillverkarens instruktioner. DNA-renhet och koncentrationerna bestämdes genom spektrofotometrisk mätning av absorbans vid 260 och 280 nm genom UV-spektrofotometer.

Den valda två TNFAIP2
SNPs, rs710100 och rs1052912, var genotypas genom att använda TaqMan-metodiken i 384-brunnsplattor och läsa med Sequence Detection Software på en ABI-Prism 7900 instrument, i enlighet med tillverkarens instruktioner, Applied Biosystems (Foster City, CA), som också levererade primers och prober. Varje platta ingår fyra negativa kontroller, dupliceras positiva kontroller och åtta upprepade prover. Betingelserna för amplifiering var som följer:. 50 ° C under 2 min, 95 ° C under 10 min följt av 40 cykler av 95 ° C under 15 sek, och 60 ° C under 1 min

Eftersom TaqMan analysen var inte lämplig för de andra två SNPs, dvs rs8126 och rs1052823, var de genotypas genom PCR-restriction fragment length polymorphism metod, i vilken de primrar utformades för att skapa nya restriktionsställen och användes för att amplifiera de fragment som innehåller de polymorfismer för de båda två SNPs. [18] sekvenserna för de primrar som används för genotypning analyser var 5'-GGGGCCGGCTCTCTTGGGCC-3 'och 5'-CACACGTACAAAGACCTTGGGCATCC-3' för rs8126, och 5'-CCTTCGGACTCAGGCATGACTC-3 'och 5'-GTAAGGCAGTACCTGGGAAAAGGGTA -3 "för rs1052823. PCR-profilen bestod av en initial smältningssteg av 95 ° C under 5 min, 35 cykler av 95 ° C under 30 s, 60 ° C under 45 s och 72 ° C under 1 min och en slutlig förlängningssteg av 72 ° C under 10 min. PCR-produkterna för rs8126 C-allelen av 105 baspar (bp) digererades med Apa
I enzym (New England Biolabs, Beverly, MA) till två fragment av 85 bp och 20 bp, medan de av rs1052823 G-allelen av 108 bp klövs av Rsa
i (New England Biolabs) till tre fragment av 83 bp, 15 bp och 10 bp. Analys framgång för alla genotyper var > 99%, och de upprepade analyser för > 10% av proverna var 100 överensstämmande

Statistisk analys

De χ ^{2 tester. utfördes för att jämföra fördelningen av demografiska variabler och utvalda riskfaktorer, såsom rökning och alkohol förbrukning, mellan fall och kontroller. Hardy-Weinberg jämvikt testades av en godhet-of-fit χ 2 test för att jämföra de observerade genotyp frekvenser med de förväntade de i cancerfria kontroller. Sammanslutningar av genotyper av TNFAIP2
SNP med risk för magcancer uppskattades genom att beräkna odds ratio (OR) och deras 95% konfidensintervall (KI) från både univiariate och multivariata logistiska regressionsmodeller i fall-kontrollanalyser , följt av stratifiering analys efter ålder (≤59 vs. > 59 år), kön, etnicitet (vit kontra icke-vit), röka och dricka status. Alla dessa analyser genomfördes med eller utan justering för demografiska variabler och utvalda riskfaktorer. Proc haplotyp i SAS /Genetics programvara med förväntningarna-max-imization (EM) algoritm genomfördes för att generera maximal sannolikhet uppskattningar av haplotypfrekvenser. Haplotyper med frekvenser < 5% slogs samman till en grupp. Alla tester var tvåsidiga och en P Hotel < 0,05 ansågs cutoff för statistisk signifikans. Alla statistiska analyser genomfördes med Statistical Analysis System (version 9.2, SAS Institute, Cary, NC).}

Resultat

Demografiska egenskaper och riskfaktorer för Gastric Cancer

Denna studie inkluderade 301 patienter magsäckscancer och 313 cancerfria kontroller. Tabell 1 sammanfattar fördelningen av demografiska egenskaper och utvalda riskfaktorer för magsäckscancer. På grund av frekvensmatchning används i vår studiedesign, fanns ingen signifikant skillnad i fördelning av ålder (medianålder på 59 år), kön och etnicitet. Uppenbarligen, det fanns ingen skillnad i röka och dricka status mellan fall och kontroller. Men dessa variabler som justerats ytterligare för i ytterligare multivariata logistiska regressionsmodeller för att kontrollera för eventuella rest confounding på den huvudsakliga effekten av utvalda SNP.

TNFAIP2
genotyper och Risk för magcancer

genotypen fördelningarna för de valda fyra TNFAIP2
SNP mellan fall och kontroller är listade i Tabell 2. den observerade genotyp frekvenser av dessa SNP var alla överens med de som förväntas av Hardy-Weinberg-jämvikt i ämnena ( P
= 0,234 för rs1052823 G > T, P
= 0,698 för rs710100 G > A och P
= 0,125 för rs1052912 G > A), med undantag för rs8126 T > C ( P
= 0,013) i de fall. Fördelningen av genotyper för TNFAIP2
rs8126 T > C var 56,48% för TT, 32,56% för CT och 10,96% för CC i de fall avsevärt skiljer sig från dem i kontrollerna, vilket var 52,72% för TT , 41,53 för CT och 5,75 för CC. Denna skillnad var statistiskt signifikant ( P
= 0,019) under recessiv modell (rs8126 T > C CC /TT + CT). (Tabell 2) Review

Dessutom TNFAIP2
SNP rs8126 T > C, den enda av de fyra utvalda TNFAIP2
SNP i miRNA bindningsställen, visade en statistiskt signifikant samband i ytterligare logistisk regressionsanalys. Specifikt var rs8126 homozygot CC genotyp endast gränsfall i samband med en ökad risk för magcancer (justerat OR = 1,76, 95% CI = 0,96-3,27 och P
= 0,072), jämfört med TT genotyp, men denna risk ökat (justerat OR = 2,00, 95% CI = 1,09-3,64 och P
= 0,024), jämfört med de kombinerade rs8126 T variant genotyper (tabell 2). Men i följande skiktad analys av ålder, kön, etnicitet, rökning och dricka status, endast i undergruppen av nuvarande rökare, men inte dricker, gjorde den förhöjda risken kvarstår statistiskt signifikant med en större variation i beräkningarna (justerat OR = 4,04 , 95% CI = 1,08-15,08 och P
= 0,038) (tabell 3), även om undergruppen hade begränsad observationer. Ingen annan signifikant samband konstaterades i analysen för gemensamma effekterna av alla fyra TNFAIP2
SNP i miRNA bindningsställen.

TNFAIP2
haplotyper och Risk för magcancer

De haplotyper också undersökas för att avgöra om någon särskild haplotyp kan associeras med gastric cancerrisk. Såsom visas i fig. 1B, TNFAIP2
rs1052823 och rs1052912 är i hög kopplingsojämvikt (LD) (r ^{2 = 0,87); följaktligen hade rs1052912 inte ingår i haplotypanalysen. Fyra haplotyper visade sig ha frekvenser > 5% av alla fall, medan andra mindre vanliga haplotyper (frekvenser < 5%) kombinerades i en grupp i analysen. De fyra vanligaste haplotyper (rs8126 /rs1052823 /rs710100: T-G-G, C-G-A, T-G-A och C-T-A) svarade för 90,53% och 94,72% av kromosomerna av fallen och kontroller. Det var fördelningen av haplotyper frekvens inte statistiskt olika mellan fall och kontroller, och deras sammanslutningar med risk för magcancer var inte signifikant liksom. I ytterligare analyser av de övriga ovanliga haplotyper, haplotypen rs8126 /rs1052823 /rs710100: CGG visade en statistiskt signifikant samband med cancerrisken (justerat OR = 2,60, 95% CI = 1,39-4,85 och P
= 0,003) , jämfört med den gemensamma haplotyp TGG. (Tabell 4) Review}

Diskussion

I detta sjukhusbaserad fallkontrollstudie fann vi att TNFAIP2
miR-184 bindningsställe variant rs8126 CC genotyp var signifikant associerad med en förhöjd risk att utveckla magcancer i en recessiv genetisk modell. I skiktning analys, var en sådan effekt tydligare i undergruppen av nuvarande dricker, vilket kan vara en tillfällighet. Men det fanns inga statistiska bevis för ett samband med risk för sjukdomen för variant genotyper av andra utvalda SNP, inklusive rs1052823 G > T, rs710100 G > A och rs1052912 G > A, antingen i övergripande analyser eller skiktade analyser efter ålder, kön, etnicitet, rökning eller dricka status. Dessutom gjorde haplotypanalysen inte identifiera ytterligare undergrupper med gemensam frekvens med hög risk.

Nyligen två genomtäckande associationsstudier (GWASs) har rapporterat betydande sammanslutningar av flera genetiska varianter med magcancer risk i kinesiska populationer samt japanska och koreanska populationer [19], [20]. SNP i TNFAIP2
genen inte bland de rapporterade topp-träffar, eftersom endast alleliska associationer snarare än genetiska modeller, som recessiv modellen testades i dessa GWAS studier. I den aktuella studien med en begränsad provstorleken, vald SNP rs8126 T > C SNP i TNFAIP2
miRNA bindningsställe, en SNP som inte ingick, inte heller i LD med dem som ingår i GWAS chip, var associerad med gastrisk cancer. Detta konstaterande, men behöver ytterligare validering av större studier.

Få studier har undersökt rollen av SNP i miRNA bindningsställen i etiologin för magcancer. En fall-kontrollassociationsstudie i en japansk befolkning på 552 fall och 697 kontroller visade att rs2910164 CC genotyp i pre-miRNA (MIR-146a) var statistiskt samband med en ökad risk för magcancer [21]. En annan liknande magsäckscancer studie i en kinesiska befolkningen visade en signifikant ökad risk hos personer med variant CC homozygoter från Mir-196a-2 jämfört med vildtypen homozygot TT och heterozygota CT bärare. Denna SNP visade sig också ha ett starkt samband med lymfkörtelmetastaser [22]. Liknande effekter konstaterades för de kombinerade rs895819 AG + GG genotyper av tim-mir-27a i en kinesisk studie som utförts av Qingmin S et al
[23]. Ytterligare funktionella analyser indikerade att varianten C-allelen kan vara ansvarig för förhöjd expression av MIR-27a, genom att minska mRNA uttryck för sin målgenen, ZBTB10
(zinkfinger och BTB domän innehållande 10), en möjlig mekanism genom som HSA-mir-27a
SNP spelar en roll i magcancer känslighet [23]. Dock har inga publicerade studier undersökt vilken roll SNP bosatta i miRNA bindningssekvensen i magcancer.

TNFAIP2
( B94
) är en cytokin driven primära svaret gen som ursprungligen klonades från TNF-α-inducerbar transkript i humana stimulerade endotelceller [15]. Ytterligare studier funnit att det kan aktiveras av andra än TNF faktorer, inklusive interleukin-1β eller lipopolysackarid [24]. Uttrycket av TNFAIP2
har avslöjats att existerat i embryonal lever och njure samt i de manliga mogna könsceller och hematopoetiska och lymfoida vävnader [25]. Även om funktionen av TNFAIP2
gen är fortfarande till stor del okända, har det föreslagits att TNFAIP2
kan spela flera roller i utvecklingen av organ, inklusive vaskulogenes, blod celldifferentiering, myelopoes och spermatogenes . Vidare rapporterades det att genen tryckt i benmärgsceller från APL (APL) patienter och att dess mål mRNA kan vara upp-regleras av all-tans-RA (retinsyra) [26].

MIR-184 är en enkelkopiegen och evolutionärt konserverade på nukleotidnivå från flugor för människa. Även om dess funktion är fortfarande oklart, har vissa studier föreslagit MIR-184 som en potentiell onkogen kandidat. En studie på skivepitelcancer (SCC) av tungan visade att miR-184 skulle kunna spela en roll i en del i anti-apoptos och proliferation av tungan SCC-celler [27]. En annan studie visade först att MIR-184 minskade signifikant tumörutveckling och ökad överlevnad i en orthotopic musmodell av neuroblastom [28]. En senare studie visade att miR-184 var involverad i en gemensam genetisk väg genom inriktning serin /treonin-kinas EKT2 genom att agera med MYCN transkriptionsfaktor för att inhibera neuroblastoma cellöverlevnad [29]. Sammantaget visar dessa studier antyder en möjlig roll miR-184 i moduler cancerrisk. Det är dock oklart om SNP i dess bindningsställen ytterligare kan förändra en sådan differentiering.

I vår tidigare studie på 1,077 patienter med skivepitelcancer i huvud och hals (SCCHN) och 1,073 cancerfria kontroller en icke-spansktalande vita befolkningen, som utvärderade sammanslutningar av SNP i TNFAIP 2 Review genen med SCCHN risk [24], fann vi också att jämfört med rs8126 TT genotypen, variant CT och CC genotyper var associerad med ökad SCCHN risk i en allel-dos-respons sätt [18]. I genotyp-fenotyp korrelationsanalys av 37 SCCHN cell-linjer och perifera mononukleära blodceller (PBMC) från 43 SCCHN patienter var rs8126CC genotyp associerad med minskad uttryck av TNFAIP2
mRNA. Sammantaget tyder dessa fynd att Mir-184 bindningsställe SNP (rs8126T > C) i 3'UTR av TNFAIP2
är funktionell, möjligen genom att modulera TNFAIP2
uttryck och bidrar till SCCHN känslighet [18]. Våra resultat i magsäckscancer är förenliga med de i huvud- och halscancer.

Även om vår studie visade inte någon huvudsakliga effekten av andra SNP i miRNA bindningsställen av TNFAIP2
totala risken av magcancer, vi finna att rs8126 CC varianten homozygot genotyp, jämfört med de kombinerade genotyper (TC + ​​TT) var associerat med signifikant ökad risk för cancer. Den statistiska bevis för att endast kunde upprätthållas i en undergrupp av drinkers i skiktn analyser tyder på mycket begränsade urvalet av den aktuella studien. Även om användningen av tobak och alkoholkonsumtionen har betraktats som stora risker för magcancer, var vårt matcha designen avsedd att styra deras confounding på de viktigaste effekterna av de valda SNP, där overmatching kan hända på grund av eventuella samband mellan matchande variabler (ålder och kön) och de kända riskfaktorer (rökning och dricka) i denna studiepopulation. I ytterligare haplotypanalysen, medan fyra gemensamma frekvens haplotyper misslyckats med att visa någon statistisk cancerrisk förening, den mindre frekvens haplotyp rs8126 /rs1052823 /rs710100: C-G-G visade sig ha ökad risk jämfört med den gemensamma haplotypen T-G-G. Analysen av lågfrekventa haplotyper föreslår en annan slutsats, nämligen att det kan finnas en typlös lågfrekvent SNP som är associerad med magcancer. Ytterligare studier behövs för att bekräfta detta resultat.

Eftersom denna studie är, så vitt vi vet, den första studien på TNFAIP2
SNP och gastric cancerrisken, våra resultat är bäst anses preliminära och större studier befogat att ytterligare utvärdera vilken roll dessa SNP i etiologin av magcancer. En annan begränsning i den aktuella studien var bristen på information om H. pylori
infektionsstatus av försökspersonerna. Eftersom H. pylori
infektion i mag patienter var relativt ovanligt i USA [30], jämfört med dem i Sydamerika [31] och asiatiska länder [32], patienter rekryteras i vår studie testades inte för infektionen på deras besök på sjukhus. Därför inkludering av H. pylori
information bör övervägas i framtiden större studier.

Tack till

Vi tackar Margaret Lung och Jessica Fiske för deras hjälp att rekrytera de ämnen och samla information frågeformulär och Jianzhong Han, Kejing Xu, och Min Zhao och för deras hjälp i bearbetningen blod och DNA-extraktion.

• PLOS ONE: Epigenetisk tysta MIR-338-3p Bidrar till Tumörframkallande vid ventrikelcancer genom att rikta SSX2IP
• PLOS ONE: intratumör hypoxi Främjar Immune Tolerance genom Induktion regulatoriska T-celler via TGF-β1 i Gastric Cancer