Abstrakt
Bakgrund
Human heparanas spelar en viktig roll i utvecklingen av cancer och single nucleotide polymorphisms (SNP) i heparanas genen (HPSE) har visat sig vara korrelerade med magcancer. Den aktuella studien undersökte sambandet mellan enskilda SNP eller haplotyper i HPSE och känslighet, kliniskt patologiska parametrar och prognos av magcancer i ett stort urval av Han befolkningen i norra Kina.
Genomiskt DNA extraherades från formalinfixerade, paraffininbäddade normala gastriska vävnadsprover från 404 patienter och från blod från 404 friska kontroller. Sex SNP genotypades genom matrisassisterad laserdesorption /jonisering time-of-flight-masspektrometri. A chi-kvadrat (χ2) test och ovillkorlig logistisk regression användes för att analysera risken för magcancer; en log-rank test och Cox proportional hazards modell användes för att producera överlevnadsanalys och en Kaplan-Meier-metoden användes för att kartlägga överlevnadskurvorna. Den genomsnittliga genotypning framgångsrika var mer än 99% i båda grupperna. Haplotyp CA i blocket består av rs11099592 och rs4693608 hade en större spridning i gruppen BORR typer 3 och 4 (P = 0,037), gruppen av ett större antal lymfkörtelmetastaser (N3 vs N0 grupp, P = 0,046), och dessutom var korrelerad till dålig överlevnad (CG vs CA: HR = 0,645, 95% CI: 0,421-0,989, P = 0,044). Dessutom genotyper rs4693608 AA och rs4364254 TT var associerade med dålig överlevnad (P = 0,030, HR = 1,527, 95% CI: 1,042-2,238 för rs4693608 AA; P = 0,013, HR = 1,546, 95% CI: 1,096-2,181 för rs4364254 TT). Det fanns inga samband mellan enskilda SNP eller haplotyper och gastric cancerrisken.
En funktionell haplotyp i HPSE hittades, vilket inkluderade de viktiga SNP rs4693608. SNP i HPSE spelar en viktig roll i magcancer progression och överlevnad, och kanske kan vara en molekylär markör för prognos och behandling värden
Citation. Li AL, Song YX, Wang ZN, Gao P, Miao Y, Zhu JL, et al. (2012) polymorfismer och en haplotyp i heparanas Gene föreningar med progressionen och prognosen för magcancer i en nordlig kinesiska befolkningen. PLoS ONE 7 (1): e30277. doi: 10.1371 /journal.pone.0030277
Redaktör: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
emottagen: 13 oktober, 2011; Accepteras: 12 december 2011. Publicerad: 20 januari 2012 |
Copyright: © 2012 Li et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit
Finansiering:. Detta arbete stöddes av National Science Foundation i Kina (nr 30.972.879 och nr 81.172.370), en specialiserad forskningsfonden Doktorsprogrammet för högre utbildning (nr 200.801.590.006) och Natural Science Foundation i Liaoningprovinsen (nr 20.092.129). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet
Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns
Introduktion
Gastric cancer är den fjärde vanligaste cancerformen i världen och näst vanligaste orsaken till cancerdödlighet [1]. Trots framsteg inom diagnos och behandling, prognosen för patienter med avancerad magsäckscancer förblir dyster [2]. Dessutom är magcancer en sjukdom av gen-miljö interaktioner och genetiska faktorer spelar en viktig roll i tumörbildning och progression [3]. Därför kunde anses upptäckt och tillämpning av biomarkörer införlivas med traditionella cancerdiagnos, iscensättning och prognos det bästa alternativet för att styra denna livshotande sjukdom [4].
single nucleotide polymorphisms (SNP) har ansetts vara attraktiva biomarkörer i cancer riskbedömning, screening, byggnadsställning, eller sortering [5]. Dessutom är det mänskliga genomet består av en serie av "haplotyp stenar, som är icke slumpvis sammanslutningar av alleler på grund av länkdisekvilibrium (LD) och det är möjligt att utnyttja en stor mängd information med tanke på dessa haplotyp block [6], [7 ]. Även om tillämpningen av enskilda SNP-analys har begränsats hittills har haplotyp-baserad förening studie föreslagits som en kraftfull och övergripande strategi för att identifiera orsaks genetisk variation underliggande komplexa sjukdomar [8], [9].
heparanas är den enda kända däggdjursenzym som bryter ner heparansulfat (HS) proteoglykaner i basalmembran och den extracellulära matrisen [10]. Detta leder till isärtagning av extracellulära hinder, frisättning av HS-bundna bioaktiva faktorer och generering av HS-fragment som främjar tillväxtfaktor-receptorbindning och signalering [11], [12]. Heparanas är starkt förknippad med cancer progression och metastasering, inklusive cellöverlevnad, invasion, spridning, kärlnybildning och skapandet av en tillväxttillåtande mikro [13], [14] och det har både prognostiska och terapeutiska tillämpningar [15]. Den heparanas genen (HPSE), första klonade 1999, ligger på kromosom 4q21.3 [16]. Det har förekommit några studier på SNP i HPSE genen. Molekylära epidemiologiska studier har visat distributions skillnader i SNP i HPSE i olika israeliska judiska befolkningen [17]. Associationer till tumör känslighet har också visats, inklusive hematologiska maligniteter och magcancer, men resultaten har inte ENLIG [18] - [20]. Dessutom har Shirley Ralphand [21] visat en HPSE haplotypen korrelerades för de stadier i äggstockskarcinom och Yue et al. [20] har visat SNP var korrelerade till kliniskt patologiska parametrar och överlevnad. Specifikt studien visade att SNP i HPSE var förknippade med heparanas uttrycksnivåer och utgjorde grunden för fortsatta studier på sambandet mellan SNP och sjukdom [22]. Men dessa associationsstudier begränsade till små prover.
Nyligen Hennig G [23] och Horn H [24] observerade höga genotyping upptäckten hastigheten (93,5% och 94-97%) och en överensstämmer helt hastighet av 100% med DNA extraherat från normala formalinfixerade, paraffininbäddade vävnader (FFPETs) jämfört med bakterielinje DNA med användning av matris-assisterad laserdesorption /jonisering time-of-flight-masspektrometri (MALDI-TOF MS). Dessutom andra rapporter visade också höga genotypning upptäckta och en perfekt samstämmighet takt med FFPET-härledda DNA inklusive decennier gamla höghus jämfört med blod från samma individ med hjälp av andra metoder, även i genomet hela genotypning [25] - [28]. Det har konstaterats att FFPET-härledda DNA var tillräckligt för genetisk polymorfism analys. I den aktuella studien använde vi en stor samling av FFPET-härledda DNA-prover från patienter och blod-härledda DNA från kontroller i en MALDI-TOF MS-metoden till genotyp och studera potentiella associationer mellan sex SNP (rs4693602, rs6856901, rs4364254, rs11099592 , rs4693608 och rs4328905) eller haplotyper i HPSE och tumör känslighet, kliniskt patologiska parametrar, och överlevnaden för magcancer med ett stort urval av Han befolkningen i norra Kina. Som ett resultat, var enskilda SNP och en haplotyp befunnits visa associationer till progression och prognos av magcancer.
Ämnes egenskaper
Medelåldern var 56,67 ± 11,923 y och den procentuella andelen av hanar var 70,54% i fallet gruppen. Medelåldern i kontrollgruppen var 56,91 ± 11,477 y och andelen män var 70,54%. Det fanns ingen skillnad i kön och ålder mellan patienter och kontroller (P = 1,00 för både kön och ålder) distribution. Av de 404 patienter svarade steg I gastric cancerfall för 21,0% (85/404), steg II gastric cancerfall stod för 26,5% (107/404) och stadium III gastric cancerfall stod för 52,5% (212/404) ( tabell 1).
Genotypningstekniker framgångsrika
Vi använde Massarray Typer Analyzer 4.0.4.20 för automatiserad spektra bearbetning och genotyp identifiering. Representativa MALDI-TOF-MS-profiler av varje genotyp av de sex SNP i HPSE visades i figur S1. Alla SNP var polymorf med mindre vanliga allelen frekvens > 10% och genotyp distributioner var alla överens med Hardy-Weinberg jämvikt (data visas ej). Höga andelen framgångsrika, på mellan 96,29% och 100% (medelvärde: 99,09%) i FFPETs gruppen och mellan 99,50% och 100% (medelvärde: 99,79%) i kontrollgruppen, visade (Tabell S1) Review
Samband mellan enskilda SNP och kliniskt patologiska parametrar och överlevnad
alleliska frekvenser och genotypiska frekvenserna i de sex SNP skiljde sig inte signifikant mellan patienter och kontroller (P > 0,05 och P > 0,05 efter en permutation test för alleliska frekvenser, P >0,05 och P > 0,05 efter att ha justerat för kön och ålder för genotypiska frekvenser,. Tabeller S2 och S3) katalog
SNP utvärderades för föreningar med kliniskt patologiska parametrar. rs4364254 genotyper var förknippade med histologiska betyg (P = 0,002; tabell S4), var genotyp TT korrelerade väl celldifferentiering jämfört med genotypen TC /CC (OR = 0,482; 95% CI: 0,300 till 0,774). Andra SNP hade inga signifikanta korrelationer till kliniskt patologiska parametrar.
I univariat analys patienter bär rs4693608 AA genotyp hade dålig magcancer specifik överlevnad jämfört med patienter med AG + GG genotyp (P = 0,049, HR = 1,387 , 95% Cl: 1,001-1,923; Tabell 2, Figur 1 och Figur S2). I multivariat analys rs4693608 AA genotypen och rs4364254 TT genotyp båda hade en dålig magcancer specifik överlevnad (P = 0,030, HR = 1,527, 95% CI: 1,042-2,238 för rs4693608, P = 0,013, HR = 1,546, 95% CI: 1,096-2,181 för rs4364254, tabell 2). Även Borrmann typ (P < 0,001), Pt kategori (P < 0,001), pN kategori (P < 0,001), och lymphovascular invasion (P < 0,001) var signifikant korrelerade med överlevnaden i univariat analys. Borrmann typ (P = 0,021), Pt kategori (P < 0,001), och pN kategori (P < 0,001) förblev signifikant korrelerad med överlevnad i multivariat analys (tabell 2) Review
Förekomst av en haplotyp i samband med clinicopathologic. funktioner och överlevnad
Det fanns två två markerings haplotyp block konstruerade mellan de sex SNP i våra resultat (Figur 2). Block 1 bestod av rs4693602 och rs6856901 och innehöll tre vanliga haplotyper (frekvensområde: från 0,025 till 0,850), vilket motsvarade cirka 99,9% av patienterna; block 2 bestod av rs11099592 och rs4693608 och innehöll också tre gemensamma haplotyper (frekvensområde: 0.091-0.798), som representerade cirka 99,9% av patienterna. Alla sex gemensamma haplotyper hade ingen korrelation med gastric cancerrisken (P > 0,05 och P > 0,05 efter en permutation test, tabell S5).
Samband mellan haplotyper i HPSE och magcancer clinicopathologic funktioner vid tidpunkten för diagnos var utvärderas. Haplotyp CA i block 2 hade större spridning i gruppen BORR typ 3 och 4 jämfört med TG + CG haplotyper (P = 0,037; tabell 3). skillnader haplotyp distributionsobserverades i pN kategori (P = 0,045; tabell 3), CA hade en större spridning i N3-gruppen än N0 gruppen jämfört med CG (OR = 1.837,95% CI: 1,010-3,341, P = 0,046 ), men det fanns inga signifikanta distributions skillnader mellan N2 och N0 grupper och mellan N1 och N0 grupper (p = 0,671 och p = 0,496 respektive).
haplotyper i block 2 indikerade en signifikant skillnad i tumörrelaterad överlevnad. Patienter som bär CA haplotypen hade en dålig magcancer specifik överlevnad (CG vs CA: HR = 0,645, 95% CI: 0,421-0,989, P = 0,044; tabell 4) katalog
Diskussion MALDI-TOF MS-metoden, som erbjuder cirka 100% noggrannhet för SNP genotypning, är för närvarande betraktas som en guldmyntfot [29], [30]. Genotypning av FFPET-härledd DNA med MALDI-TOF MS har visat sig vara tillförlitliga och reproducerbara. Tidigare rapporter har visat att det inte fanns några allel frekvensskillnader mellan FFPET härrörande DNA och blod-härlett DNA från samma individ genom flera metoder inklusive MALDI-TOF MS [24] - [26], [28]. Våra ansträngningar visade höga svarsfrekvensen på mellan 96,29% och 100% (medelvärde: 99,09%), vilket var i enlighet med tidigare rapporterade uppgifter [23], [24], [29] SNP är stabilt ärvs. , mycket riklig och visa mångfalden inom och mellan populationer, som tros vara attraktiva biomarkörer. Däremot har tillämpningen av enskilda SNP varit begränsad eftersom de är låga penetrans och deras effekter är relativt svårt att identifiera [5], [31]. Därför har vikten av haplotyp uppgifter ökat länka DNA sekvensvariation med sjukdom [32]. Artiklar har rapporterat att funktionell SNP i HPSE var förknippade med heparanas uttrycksskillnader och heparanas har visat sig vara delaktiga i den patologiska processen, progression och resultatet av sjukdomen [10], [22]. Hur man införliva SNP, dock i studier om magcancer anlag och prognos och hur man bestämmer de verkliga föreningar är fortfarande utmanande uppgifter. Det fanns inga enskilda SNP korrelerade till magcancer risk i våra resultat. Associationerna mellan fyra enskilda SNP (rs4328905, rs4693608, rs11099592 och rs6856901) och magcancer risk med 155 patienter och 204 kontroller som rapporterats av Yue et al. [20] var i enlighet med våra resultat. Dessutom är alla sex vanliga haplotyper hade inga signifikanta skillnader i gastrisk cancerrisken. Denna konsekvens visade SNP i HPSE hade inget samband med förekomsten av magcancer i etniska Han norra kinesiska, inte bara ur enskilda SNP, men också ur haplotyper. I vår aktuella studien, genotyp rs4364254 TT korrelerades till väl celldifferentiering. Dessutom Ostrovsky et al. [22] fann personer med genotyp TT besatt relativt höga mRNA-nivåer (P = 0,0029). Däremot har det varit motstridiga resultat rapporteras att associationer mellan heparanas uttryck och histologiska differentiering. Endo K et al. [33] fann att histologiska differentiering var värre i heparanas mRNA-positiv magsäckscancer vävnader (p < 0,01). Chen JQ et al. [34] fann att histologisk differentiering inte var relaterad till heparanas mRNA-uttryck i magcancer (P = 1,000). Takaomi Ohkawa et al. [35] visade att heparanas uttryck detekterades som starkare i väl differentierade celler (P = 0,0277), vilket är ett konstaterande som consistents med våra resultat. Därför kan heparanas vara inblandade i celldifferentiering, men mekanismerna är inte klart i dagsläget I univariat analys, patienter som bär rs4693608 AA-genotyp hade en dålig överlevnad (P = 0,049). i multivariat analys, rs4693608 AA och rs4364254 TT båda signifikant korrelerade med dålig överlevnad (P = 0,030 för rs4693608 AA och P = 0,013 för rs4364254 TT). Möjligen, avsaknad av samförstånd i univariata och multivariat analys berodde på svag effekt av den enskilda SNP, men när individen SNP ansågs tillsammans med andra SNP, Borrmann typ, pT kategori, och pN kategori i multivariat analys, det genereras ett inflytande på prognos. Det finns gott om bevis som tyder på att genetiska faktorer bidrar till sjukdomsprocessen i vanliga komplexa egenskapssjukdomar, men effekten av en enda variant är förmodligen liten [36]. Dessutom, Ostrovsky et al. [37] gav en första tecken på korrelation mellan funktionella SNPs rs4693608 och rs4364254 och risk för akut graft-versus-host disease (GVHD) utveckling och rs4693608 var det viktigaste. Deras resultat var enligt vår. Dessutom Ostrovsky et al. [22] rapporterade både rs4364254 TT-genotyp och även rs4693608 AA-genotyp korrelerades till en relativt hög mRNA-nivå (P = 0,0029 och 0,004, respektive), vilket delvis kan förklara en sämre prognos för patienter med rs4693608 AA eller rs4364254 TT i föreliggande studie . Dessa observationer var biologiskt rimligt eftersom överuttryck av HPSE var nära förknippad med större invasions av magcancer [38] - [40]. De aktuella resultaten visade vår antagandet att SNP var inblandade i regleringen av heparanas uttryck, vilket påverkar invasionen förmåga och överlevnad i magcancer. Även om varken genotyp rs11099592 CC eller rs4693608 AA visade en statistisk skillnad i Borrmann typ, haplotyp CA sammansatt med dem visade en signifikant skillnad. Haplotyp CA hade en större spridning i gruppen BORR typer 3 och 4 (P = 0,037). Kanske patienter med haplotyp CA var mer benägna att utveckla en sämre allmän typ. Dessutom haplotyp CA hade en större utbredning i N3-gruppen (P = 0,046, jämfört med den N0 grupp). Men det fanns inga signifikanta distributions skillnader mellan N2 och N0 grupper och mellan N1 och N0 grupper. Kanske fanns det ett samband mellan haplotyp CA och ett större antal lymfkörtelmetastaser, men det behövs ytterligare studier. Dessutom patienter som bär CA haplotypen visade också dålig magcancer specifik överlevnad, som överensstämde med de skillnader i Borrmann typ och antal lymfkörtelmetastaser. Vidare Ostrovsky et al. [22] rapporterade att rs11099592 CC genotyp och rs4693608 AA genotyp var korrelerad till höga mRNA-uttryck (P = 0,0167 och P = 0,004 respektive), vilket var i enlighet med våra resultat om haplotyp CA. Kanske den absoluta risken associerad med var och en av SNP var låg, men kombinerat haplotypanalys kan vara mer användbart för att identifiera individer med hög risk för progression av sjukdomen. Kanske var det specifika haplotyper som spelar en viktig roll i magcancer invasion och metastas, ytterligare påverka prognosen. Ett funktionellt haplotyp blocket består av rs11099592 och rs4693608 hittades i våra resultat, som är förknippade med Borrmann typ, pN kategori och prognos av magcancer. Å ena sidan är SNP rs11099592 en A-G substitution nonsynonymous SNP belägen i exon 8 och denna förändring resulterar i en arginin-till-lysin utbyte vid position 307, kanske leder till en funktionell skillnad i proteinet. Å andra sidan, är SNP rs4693608 belägen i intron 3 och visade en korrelation till överlevnad. Ökande mängder av bevis tyder på att genom varianter i icke-kodande sekvenser kan förändra uttrycket av genprodukter genom att ändra genreglering, exon splitsning, mRNA-stabilitet, kryptiska splitsningsställen aktivering och så vidare, vilket kan därför orsaka sjukdom fenotyper. Dessutom kan haplotyper ge mer relevant information än enskilda SNP [7], [41]. Dessutom, oavsett om gentranskription, upprätthållande av cellulär differentiering och induktion av en invasiv metastatisk fenotyp är beroende på den direkta interaktionen av heparanas med DNA är ännu inte demonstrerad. Ostrovsky et al. [22] visade viktigt samband mellan kombinerade genotyper för rs4693608 och rs4364254 SNP och heparanas mRNA expressionsnivå. Dessutom delade de alla kombinerade genotyper i tre undergrupper (LR-låg uttryck, MR-mellan uttryck, HR-högt uttryck) enligt heparanas mRNA-uttryck för varje genotyp och de bekräftade betydande skillnader mellan tre undergrupper av kombinerade genotyp bärare och mRNA nivåer. Dessutom, Ostrovsky et al. [37] först hittade korrelationer mellan kombinerade genotyper för rs4693608 och rs4364254 SNP och risk för akut GVHD utveckling i följande studie med detta undergrupper analysmetod. Det är en viktig och värdefull metod. Dessutom är denna metod användbar för risk förutsägelse i samband med haplotyp strategi att följa klinisk praxis. Vår framtid studie, som förband mRNA-uttryck nivå genotyper eller haplotyper i HPSE av Han befolkningen i norra Kina, skulle använda denna metod. Eftersom provstorlek av vildtyp homozygot var relativt för liten för skiktad analys på varje genotyp av alla sex SNP undersökta i vår studie kan vi inte visa resultatet av SNP-analys på varje genotyp, men genomförde vi analys kombinerad heterozygot med vildtyp homozygot. Det var en begränsning av denna studie. Sammanfattningsvis Denna studie utvärderade polymorphisms av HPSE genen i magsäckscancer med en MALDI-TOF MS-metoden och arkiverade FFPETs i en stor nordkinesiska fall styrd kohort. Vi hittade ett funktionellt haplotyp blocket består av rs11099592 och rs4693608, som var förknippad med Borrmann typ, pN kategori och prognos; och SNP rs4693608, som ingick i blocket, uppvisade en korrelation till överlevnad. Dessa resultat stöds av associationer mellan SNP i HPSE och mRNA-expressionsnivåer som tidigare rapporterats av Ostrovsky et al. [22]. Dessutom har sex individuella SNP och haplotyper inte korrelerad till gastric cancerrisken. Dessa resultat överensstämde med vår ursprungliga antagandet att heparanas var inblandad i cancerinvasion och metastasering och påverkade prognosen slutligen men det var inte inblandad i förekomsten av cancer. Provtagning 404 patienter med histopatologiskt bekräftad magcancer som fått radikal kirurgi mellan januari 1998 och december 2004 har i följd vald. Patienterna var från norra Kina och ansågs vara goda representanter från denna region. 404 normala gastriska vävnadsprover erhölls från ett segment av de utskurna proven längst bort från tumören (> 10 cm) och FFPETs arkiverades i Surgical Oncology Institutionen för första sjukhuset i Kina Medical University i norra Kina. Samtliga prover fixerades och inbäddades under standard kliniska histologiska betingelser och vid rumstemperatur förvarades. Paraffin delar av FFPETs färgades med hematoxylin och eosin (H & E) för patologisk inspektion för att bekräfta frånvaron av tumörvävnad. Tumören histologiska grad bedömdes enligt Världshälsoorganisationen kriterier och tumörer arrangerades med hjälp av den 7: e upplagan av TNM stadieindelning av den internationella unionen mot cancer (UICC) baserad på postoperativ patologiska /amerikanska kommittén för cancer (AJCC) systemet (2010) undersökningen av exemplar. Fullständiga patologiska data erhölls inklusive ålder, kön, födelse kirurgi, lokalisering av primärtumören, histologiska grad, venös invasion, lymphovascular invasion, djup invasion, antal LNS hämtats antal metastaserande LNS, och antalet tumör insättningar hämtas. De (i) med synkrona eller metachronous maligna tumörer, (ii) med fjärrmetastaser hittade preoperativt, (iii) som genomgick preoperativ strålbehandling eller kemoterapi, eller (iv) med ofullständiga patologiska dataposter uteslöts från denna studie. Uppföljning slutfördes för hela studiepopulationen i januari 2010. Två patienter dog i den postoperativa perioden och 21 patienter försvann vid uppföljning, därför 381 patienter ingick i överlevnadsanalys. Median och genomsnittlig uppföljningstider var 90,0 månader och 93,3 ± 20,24 månader (intervall: 61-136 månader), respektive. Följande data erhölls för alla patienter: dödsdatum (i förekommande fall), dödsorsak (i förekommande fall), och datum för uppföljning. Det primära effektmåttet var orsak specifika överlevnadstiden från och med dagen för magcancer diagnos till datumet för dödsfallet. 5-års överlevnad av de 404 patienterna var 54,2%. 404 blodprov erhölls från cancerfria individer som slumpmässigt utvalda baserat på fysiska undersökningar under december 2009 till augusti 2011, som kontrollgruppen, och denna grupp ansågs vara en god representation av befolkningen i norra Kina regionen. Urvalskriterierna ingår ingen enskild historia av cancer, frekvens matchning till fall på kön och ålder och individer var orelaterade etniska hankineser. Proverna (etylendiamintetraättiksyra [EDTA] anticoagulate) lagrades vid -20 ° C inom 30-40 minuter, och flyttade sedan till en frys vid -80 ° C inom 2 eller 3 dagar efter samlingen. studien godkändes av forskningsetiska kommittén i Kina Medical University, Kina. Skriftliga informerade medgivanden erhölls från alla patienter innan de deltar i studien. Genomiskt DNA extraherades från FFPET prover i fallet gruppen. Sektioner med en tjocklek på 8 pm och en yta på upp till 250 mm 2 framställdes med en mikrotom och DNA isolerades från 6 till 12 sektioner, beroende på vävnaden storlek och kroppar. Mikrotomen rengjordes och bladen ändrades för att undvika intersample kontaminering. DNA-extraktion från FFPETs utfördes med QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) [29], enligt de förfaranden som beskrivs av tillverkaren, inklusive (i) löser paraffin i xylen och ta bort, (ii) lyse prov under denaturering betingelser med proteinas K, (iii) vända formalin tvärbindnings inkubation vid 90 ° C, (iv) binder DNA till membranet och tillåta föroreningar att flyta igenom, (v) tvätta restföroreningar, och (vi) eluerar ren och koncentrerad DNA från membranet (med tris-EDTA-buffert [TE]). Ca 2-10 ^ g av DNA utvanns i 50 fil slutliga lösningen och vid -80 ° C förvarades. Genomiskt DNA extraherades från blodprover från kontrollgruppen med den allmänna Iskt DNA Extraction Kit Ver.3.0 (TAKARA) i enlighet med tillverkarens instruktioner. Om 2-6 pg av DNA återfanns i TE och vid -80 ° C förvarades. I studien ingick sex SNP i HPSE, som tagits från NCBI SNP databas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp) och HapMap databasen (fas III databas) (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/index.html.zh ). Dessa SNP kartlades i HPSE genen (Figur 2). rs 11099592 var unik, inte bara med en mindre allel frekvens (MAF) > 1%, men även som polymorf i Han Kina Beijing (HCB) befolkningen bland alla kodande regionen SNP (cSNPs) i HPSE, som registrerats i databaserna. Dessutom har andra fem SNP ligger i intron och 3'-UTR regioner. Vidare har andra forskare visat att rs11099592, rs4693608 och rs4364254 var korrelerade med heparanas-mRNA-expression [22]. Även associationer mellan enskilda SNP eller haplotyper i HPSE och känslighet, kliniskt patologiska parametrar och prognos av tumör rapporteras i dessa artiklar var komplicerad, men främst koncentrerad på de sex SNP vi valt [17] - [22]. SNP genotypanalyserades med användning av MALDI-TOF-MS-system (Massarray; Sequenom, San Diego, CA, USA) med primrar och sonder (Tabell S6) såsom tidigare beskrivits [29], [42]. För att säkerställa skrivkvalitet, 1% positiva prover (Yanhuang cellstam) införlivades i varje genotypning platta för att validera tillförlitligheten av primrar och en% negativa prover (vatten med inget DNA) för att övervaka kontaminering. 5% slumpmässiga prover testades i duplikat av olika personer och reproducerbarheten var 100%. Laboratoriepersonalen var förblindade till provarrangemanget under processen. Det fanns sex steg, inklusive PCR-amplifiering, räkor behandling med alkaliskt fosfatas, bas förlängning, salt bort med harts, SpectroCHIP dispense (Sequenom, San Diego, CA, USA), och dataförvärv med MALDI-TOF MS enligt Justenhoven et al. [43]. Slutligen dataanalys utförs med hjälp av Massarray Typer Analyzer 4.0.4.20 (Sequenom, San Diego, CA) [44]. Haploview 4,2 programvara användes för att utvärdera LD och konstruera haplotyper [31]. LD mellan de sex SNP används i haplotypanalys mättes med en parvis D 'statistik. Strukturen för den LD blocket undersöktes med användning av metoden enligt Gabriel et al. [45], med hjälp av 80% förtroende gränserna för D "för att definiera platser av historiska rekombination mellan SNP. Haplotyper konstruerades från genotyp data i full storlek fall-kontrollpanelen inom block med en accelererad förväntan-maximering algoritm metod [46]. I korthet skapar denna metod mycket exakta befolkningsfrekvens beräkningar av fasas haplotyper baserade på den högsta sannolikhet som bestäms från unphased ingång [47]. Statistisk analys genomfördes med hjälp av PASW Statistics 18,0 programvara (SPSS, Inc., Somers, NY, USA). Ett test dubbelsidig chi-kvadrat (χ2) användes för att uppskatta populationsfördelningsegenskaper, jämföra skillnader i allel och genotypiska frekvenserna mellan fall och kontroller och bedöma samband mellan enskilda SNP och kliniskt patologiska parametrar. En permutation förfarande (1.000 test) användes för att korrigera det P-värde på enkel-locus associationsresultaten. Oddskvot (OR) och konfidensintervall (CI, 95%) beräknades genom ovillkorlig logistisk regression för att analysera sambandet mellan genotyp frekvenser och gastric cancerrisken, och justerades till kön och ålder. Endimensionella och flerdimensionöverlevnadsanalys gjordes med log-rank test och Cox proportional hazards modell med de kliniskt patologiska parametrar och SNP. Detta resulterade i identifiering av kovariater som signifikant korrelerade med överlevnaden av patienterna. Multivariat överlevnadsanalys utfördes genom att separat tillsätta de SNP variablerna till alla de kliniskt patologiska parametrar. En Kaplan-Meier-metoden användes för att kartlägga överlevnadskurvorna.
Material och metoder
DNA-extraktion
Val av SNP och genotypning
LD blocket beslutsamhet och haplotyp konstruktion
Statistisk analys
Matsmältningsmanifestationer vanliga men milda bland sjukhusvistade covid-19-patienter
Bestämning av syranutraliserande kapacitet för OTC-antacida
Tarmbakterier kopplade till metaboliska förändringar och autism i ny studie
Att hantera celiaki
Lantlig och urban mikrobiota skiljer sig från ung ålder,
Män som äter yoghurt två gånger i veckan är mindre benägna att utveckla tarmcancer
Studie avslöjar antivirala effekter av curcumin
Curcumin, en naturlig förening som finns i kryddgurkmejan, kan hjälpa till att eliminera vissa virus, forskning har funnit. En studie publicerad i Journal of General Virology visade att curcumin k
Lite bevis för mRNA COVID-19-vaccinassocierad trombocytopeni,
föreslår ny FDA -studie Även om en mängd vacciner har lanserats för att motverka coronavirus-sjukdomen 2019 (COVID-19), några allvarliga negativa effekter har rapporterats, i form av trombocytopeni. E
Mikrobiom kan hjälpa till att identifiera risken före cancer hos kvinnor med HPV
En ny studie publicerad i open-access journal PLOS Patogener i mars 2020 rapporterar den möjliga användningen av bakterierna Gardnerella finns i livmoderhalsen och slidan hos kvinnor med humant pa