PLOS ONE: Onkogen CagA Främjar Gastric cancerrisken via aktivering av ERK signalvägar: en kapslad fall-kontroll Study

Abstrakt

Bakgrund

CagA cellulär interaktion via aktivering av ERK signalväg kan vara en startpunkt i utvecklingen av magcancer. Denna studie syftade till att utvärdera huruvida gener involverade i ERK nedströms signalvägar som aktiveras av CagA är mottagliga genetiska markörer för magcancer.

Metoder

I upptäcktsfasen, totalt 580 SNP inom + /-5 kb av 30 gener genotypanalyserades att undersöka en förening med magcancer risk i den koreanska multicenter cancer Cohort (100 incident magsäckscancer fall-kontrolluppsättningar). De mest betydande SNP (råa eller permuterade p
värde < 0,02) identifieras i upptäckten analys har omvärderas i förlängningen fasen med hjälp av ovillkorlig logistisk regressionsmodell (400 magcancer fall-kontrolluppsättningar). Kombinerat analyser med pooled- och meta-analys utfördes för att sammanfatta alla resultat.

Resultat

24 SNP i åtta gener (ERK, Dock180, C3G, RAP1, Src, Crkl, Mek och CRK) var signifikant associerade med magcancer risk i den enskilda SNP-analyser i upptäcktsfasen ( p Hotel < 0,05). I förlängningen analyser, ERK rs5999749, Dock180 rs4635002 och C3G rs7853122 visade marginellt signifikanta gen dosering effekter för magcancer. Genomgående presenterade slutliga kombinerade analysen SNP som signifikant associerade med gastric cancerrisk (OR = 1,56 [95% CI: 1,19-2,06], OR = 0,61 [95% CI: 0,43-0,87], OR = 0,59, [95 % CI: 0,54-0,76], respektive) katalog

slutsatser

Våra resultat tyder på att ERK rs5999749, Dock180 rs4635002 och C3G rs7853122 är genetiska faktorer i gastric cancer

Citation.. : Yang JJ, Cho LY, Ma SH, Ko KP, Shin A, Choi BY, et al. (2011) Onkogen CagA Främjar Gastric cancerrisken via aktivering av ERK signalvägar: En kapslad fall-kontrollstudie. PLoS ONE 6 (6): e21155. doi: 10.1371 /journal.pone.0021155

Redaktör: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore

emottagen: 22 juli 2010; Accepteras: 21 Maj 2011; Publicerad: 16 juni 2011

Copyright: © 2011 Yang et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Denna studie stöddes av ett bidrag från grundforskning Research Program genom National Research Foundation of Korea (NRF) som finansieras av ministeriet för utbildning, vetenskap och teknik [KRF-2007-313-E00175] och [NRF-2009-0.066.258]. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Helicobacter pylori ( H. pylori
) är en beprövad orsak av gastric cancer [1]. Ändå kan den absoluta effekt modifieras genom individuella känslighet riskfaktorer såsom genetiska varianter och H. pylori
virulenta egenskaper [2], [3]. Cellgift-associerat antigen (CagA), en H. pylori
immunoprotein, är en avgörande faktor för individuell känslighet och associeras med allvarliga kliniska resultat inklusive magcancer [4], [5], [6]. I gastric epitelceller, CagA stör olika signaltransduktionsvägar, såsom Dock180-RAC1-WAVE-Arp2 /3, C3G-RAP1-BRAF-MEK, Sos1-HRAs-Raf1 och Ras-Raf-MEK-ERK signalering [3 ], [7], [8], [9]. Signaler som modifierats genom CagA inducerar cellulära förändringar såsom apoptos, proliferation och celldöd, och stimulera gastrisk cancer [10], [11], [12].

Bland flera nedströms vägar som aktiveras av CagA, den extracellulära signalen -regulated kinas (ERK) kaskad är en kärna väg eftersom den spelar en viktig roll i gastric cancer. CagA cellulära interaktioner med Src, SHP2, Crk, Crkl eller GRB2 är signifikant associerade med ERK aktivering och andra olika proteiner involverade i CagA signalering är intimt kopplad till ERK signalvägar [10], [11], [12], [13] . Proteiner kan regleras genom deras värdgener; Därför kan gener som kodar för proteiner relaterade till CagA och ERK signaleringen processen vara viktigt för gastric cancer, men få studier har fokuserat på dessa genetiska polymorfismer.

CagA onkogenicitetsstudie kan vara en utgångspunkt för att utveckla magcancer via aktivering av ERK signalvägen. Dessa signal transduktioner verkar ändras av värd genetiska varianter. Således, hypotes vi att gener som är involverade i ERK nedströms signalvägar som aktiveras av CagA kan vara känsliga genetiska markörer för magcancer. För att utvärdera denna hypotes genomförde vi en flerstegs genetisk associationsstudie som omfattade 1) upptäcktsfasen: en kandidat genanalys som fokuserade på 30 gener, CRK, Crkl, CSK, Grb2, c-Met, NFATC4, PTPN11, SMS, SOS1 , Src, ERK, FAK, PLCγ, KRAS, NRAS, BRAF, RAF1, MAP2K1, MAP2K3, MAP2K4, MAP2K5, MAP2K6, p21, Dock180, RAC1, RAP1, WAVE, Arp2, Arp3 och C3G, deltar i CagA och ERK signal omvandlingsvägen, och 2) förlängningsfasen som undersökte de mest betydelsefulla SNP som identifierats i upptäckten analysen.

Metoder

Studiepopulation

Discovery fas.

upptäckten kandidatgen analys var en populationsbaserad kapslade fall-kontrollstudie inom den koreanska Multi-Center Cancer Cohort (KMCC). Från 1993 till 2004, rekryterade KMCC totalt 19,688 deltagare från fyra städer och på landsbygden i Korea. Alla deltagare avslutade detaljerade standardiserade frågeformulär genom personlig intervju efter informerat samtycke. Blod- och urinprov uppsamlades också. Genom rekord kopplingar till nationella dödsattesten, sjukförsäkring journaler databaser och nationella cancerregistret, var alla deltagare passivt följas upp, och nydiagnostiserade fall konstaterades. Detaljerad information om KMCC beskrivs på annat håll [14]. I december 2005, 249 gastric cancerfall definieras enligt International Statistical Classification of Diseases och hälsoproblem 10th Revision (ICD-10, C16) identifierades. Fall som diagnostiseras innan rekrytering (n = 52), utan blodprover (n = 35), eller otillräcklig DNA-nivå under 50 ng /l (n = 62) uteslöts. Cancer fria kontroller matchas av ålder (± 5 år), kön, bostadsområde, och inskrivning år. Slutligen har 100 uppsättningar av magcancer fall och matchade kontroller definieras.

Extension fas.

1) I december 2008, 95 nya magcancer fallen dessutom utläsa KMCC. Dessa ärenden och 116 ärenden som uteslöts i upptäckten kohorten på grund av förekomsten status eller otillräcklig DNA-koncentration ingick i förlängningsfasen (n = 211). Genom att använda samma matchningsmetod som upptäcktsfasen var 211 kontroller valts. 2) Gastric cancerfall erhölls från två universitetssjukhus i Korea som var Chungnam Universitetssjukhuset och Hanyang University GURI Hospital. Från mars 2002 till september 2006 har totalt 490 patienter med ventrikelcancer nydiagnostiserade på sjukhusen. Deras epidemiologiska data och venösa helblodprover togs vid tidpunkten för diagnos eller före gastric cancerkirurgi. Bland dem var 189 fall med tillräcklig DNA-prover och informerade medgivanden även i förlängningssetet. Dessutom var 189 samhällsbaserade kontroller matchade efter ålder (± 5 år) och kön från KMCC försökspersoner som rekryterats efter 2000.

Etik Statement

De studieprotokoll för KMCC studien sjukhuset -baserade studie och den nuvarande kapslade fall-kontrollstudie godkändes av institutionella prövningsnämnder (IRB) av Seoul National University Hospital och National Cancer Center i Korea (H-0110-084-002 och C-0603-161-170) och av Institutional Review board av Hanyang Universitetssjukhuset (IRB nr. 2003-4).

Gene och SNP val

genom litteraturöversikt, identifierade vi 30 kandidatgener som kan vara inblandade i CagA signaltransduktionsvägen kopplad till ERK nedströms signaleringen genom direkt interaktion med CagA eller sekundär ömhet i CagA genetiska sekvenser [3], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. De 30 kandidatgener är följande: v-Crk sarkomvirus CT10 onkogen homolog ( CRK
); v-Crk sarkomvirus CT10 onkogen homolog (fågel) -liknande ( Crkl
); c-Src tyrosinkinas ( CSK
); tillväxtfaktorreceptorbundet protein 2 ( GRB2
); Met-proto-onkogen (C MET
); nukleär faktor av aktiverade T-celler, cytoplasmatiska, kalcineurin beroende 4 ( NFATC4
); proteintyrosinfosfatas, icke-receptor typ 11 ( PTPN11
); spermin-syntas ( SMS Review); son till sevenless homolog 1 ( SOS1
); v-Src-sarkom (Schmidt-Ruppin A-2) viral onkogen homologen ( SRC
); älg relaterade tyrosinkinas ( ERK
); fokaladhesion kinas 1 ( FAK
); fosfolipas C-gamma ( PLCγ
); v-Ki-ras2 Kirsten råtta sarkom viral onkogen homolog ( KRAS
); neuroblastom RAS virala (v-ras) onkogen homolog ( NRAS
); v-raf murin sarkom virus onkogen homolog B1 ( BRAF
); v-raf-1 murin leukemi viral onkogen homolog 1 ( RAF1
); mitogenaktiverat proteinkinas kinas 1 ( MAP2K1
); mitogenaktiverat proteinkinas kinas 3 ( MAP2K3
); mitogenaktiverat proteinkinas kinas 4 ( MAP2K4
); mitogenaktiverat proteinkinas kinas 5 ( MAP2K5
); mitogenaktiverat proteinkinas kinas 6 ( MAP2K6
); cyklin-beroende kinas-hämmare 1A ( p21
); dedicator av cytokines ett ( Dock180
); ras-relaterade C3 botulinumtoxin substrat 1 ( RAC1
); RAP1A medlem av RAS onkogen familj ( RAP1
); WAS proteinfamiljen, medlem 1 ( WAVE
); ARP2 aktin-besläktat protein 2 homolog ( Arp2
); ARP3 aktin-relaterat protein 3 homolog ( Arp3
); Rap guaninnukleotidutbytesfaktor (GEF) 1 ( C3G
).

genotypning

Discovery fas.

genotypning utfördes med hjälp av genomet hela människo SNP Array 5,0 enligt standardprotokollet som rekommenderas av tillverkarens instruktioner [15]. Före genotypning, var koncentrationerna av genomisk DNA för alla försökspersoner mäts med en spektrofotometer (Nanodrop ND-1000, Nanodrop Technologies). För varje individ analyserades, var 250 ng av genomiskt DNA digererades med ett restriktionsenzym (Nsp I eller Sty I). Även om vi screening totalt 580 SNP inom +/- 5 kbp av de 30 målgen platser, var 103 polymorfismer uteslutna på grund av en SNP samtal på mindre än 95% eller ett HWE värde mindre än 0,0001. Eftersom genomet hela human SNP Array 5,0 tillverkades baserat på en kaukasisk befolkning, gjorde 115 SNP inte uppfyller kriterierna i MAF < 0,05 i asiater och undantogs också. Dessutom har 20 fall och 14 kontroller utesluts på grund av otillräcklig genomiskt DNA (< 250 ng), kön obalans eller dålig genotypning (< 90%). Slutligen, var 362 SNP i 30 gener (genotypning hastighet av 99,5%) genotypas i 81 fall och 85 kontroller. Kluster bilder av signalintensiteten granskades för alla SNP

förlängningsfasen

Sju SNP med rå eller permuterade p
värde. ≪. 0,02 (rs5999749, rs9418677, rs4635002, rs10901081, rs7853122, rs530801, rs747182) identifierad i upptäckten analys genotypanalyserades hjälp av Illumina VeraCode Golden Assay med BeadXpress enligt tillverkarens protokoll (Illumina, San Diego, CA, USA) [16]. För att säkerställa tillförlitligheten hos de två genotypning metoder, var 135 prover (59 fall och 76 kontroller) genotypas två gånger genom både genomet hela human SNP Array 5,0 och Illumina VeraCode Golden Assay, och överensstämmelsen Hastigheten var > 98,2%. Av de 7 SNP var rs9418677 utesluten på grund av en SNP samtalstaxa < 95%. Två fall och 40 kontroller med låg DNA tillgänglighet (n = 15) eller genotypning samtalstaxa < 90% (n = 27) var inte heller i analysen. Slutligen har sex SNP i fem gener (genotypning hastighet av 99,1%) analyserades i 398 fall och 360 kontroller i förlängningsfasen.

H. pylori Köpa och CagA upptäckt

H. pylori
infektionsstatus och CagA seropositivitet utvärderades med hjälp av immunanalys, Helico Blot 2.1 ™ (MP Biomedicals Asia Pacific, Singapore). Helico Blot 2.1 ™ kit har rapporterat en känslighet på 99% för båda H. pylori Mössor och CagA seropositivitet och en specificitet på 98% för H. pylori Mössor och 90% för CagA seropositivitet [17].

Statistisk analys

Hardy-Weinberg jämvikt (HWE) i kontrollgruppen utvärderades genom Fishers exakta test med en skär off nivån av HWE. < 0,0001

i den primära skanning upptäckten set, sambandet mellan enskilda SNP och gastric cancerrisken bedömdes baserat på både rå och permuterade p
-värden med hjälp av LRT med en frihetsgrad i trenden (tillsats) modell. Trendanalys förutsätter en dos-respons effekt med ett ökande antal variant alleler. Permuterade p
-värden uppskattades av 100.000 permutationstester. Baserat på tillsats modellen har gastric cancerrisken beräknas som oddskvoter (ORS) och 95% konfidensintervall (CI) med ovillkorlig logistisk regressionsmodell justering för riskfaktorer som rökning (någonsin vs.
Aldrig) , H. pylori
infektion (positiv vs.
negativ) och CagA seropositivitet (positiv vs.
negativ). Den Benja-Hochberg falska upptäckt hastighet (BH-FDR) korrigeras p
-värden för varje SNP beräknades för att undvika falsk förening med falska positiva resultat [18].

I förlängningsfasen, de viktigaste SNP med rå eller permuterade p
värde < 0,02 identifierats i upptäckten fasen omvärderas. Baserat på tillsats modellen har gastric cancerrisken uppskattas yttersta randområdena och 95% KI använder ovillkorlig logistisk regressionsmodell justering för riskfaktorer som rökning (någonsin vs.
Aldrig), H. pylori
infektion (positiv vs.
negativ) och CagA seropositivitet (positiv vs.
negativ). Att sammanfatta resultaten från upptäckten och förlängningen analyser, data sammanslagning och meta-analys utfördes. Översikts yttersta randområdena och 95% KI beräknades med hjälp av en fast effektmodell och heterogenitet utvärderades av Cochran Q statistik [19].

Alla statistiska analyser genomfördes med hjälp av SAS Software version 9.1 (SAS Institute, Cary, North Carolina) och Plink programvaruversion 1,06 (http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink) [20]. Metaanalyser genomfördes med hjälp av STATA version 10 (Stata, College Station, TX).

Resultat

Tabell 1 sammanfattar de grundläggande egenskaperna hos studiedeltagarna i varje fas. Gastric cancerfall visade betydligt högre CagA seropositivitet ( p
= 0,03 i upptäcktsfasen, p
= 0,09 i förlängningsfasen och p
= 0,02 bland totalt ämnen) . H. pylori
infektion, var också högre bland gastric cancerfall (tabell 1) VacA seropositivitet och rökning.

I den primära genomsökning av upptäckten uppsättning av de 362 SNP valda från CagA-relaterade gener i signaltransduktionsvägen, 24 SNP i åtta gener, ERK, Dock180, C3G, RAP1, Src, Crkl, Mek och CRK, var signifikant associerade med magcancer risk på den inre SNP-analys ( p Hotel < 0,05) . Enligt den 100000 permutationstestet, ERK rs5999749 och Dock180 rs9418677 presenterades en starkare association med gastrisk cancer ( p
< 0,01). Dessa SNP visade signifikanta gen dosering effekter i den linjära trendtest och var signifikant associerade med en ökad risk för magcancer (OR = 2,83 [95% CI: 1,42-5,65] för ERK rs5999749 ELLER = 1,90 [95% CI : 1,18-3,05] för Dock180 rs9418677). Med undantag för Dock180 rs9418677 och RAP1 rs17028287, var de flesta SNP nedströms från CagA-Crk signalering (Dock180, C3G, RAP1 och Mek) signifikant associerade med en minskad risk för magcancer (tabell 2).

I förlängningsfasen , alla föreningar mellan de utvalda SNP och gastric cancerrisken var relativt dämpad. ERK rs5999749, Dock180 rs4635002 och C3G rs7853122 signifikant gen dos effekt för magcancer (OR = 1,40 [95% CI: 1,04-1,89] ELLER = 0,65 [95% CI: 0,44-0,94] ELLER = 0,61, [95% CI: 0,46 till 0,81], respektive). I den slutliga kombinerade analysen som inkluderade upptäckten och förlängningen analyser, var risk uppskattningar av ERK rs5999749 signifikant samband med magcancer i både poolade analysen och meta-analys (OR = 1,57 [95% CI: 1,20-2,07] ELLER = 1,56 [95% CI: 1,19-2,06], respektive). Dessutom Dock180 rs4635002 och C3G rs7853122 visade signifikant minskade risken för magcancer i båda analyserna (OR = 0,60 [95% CI: 0,42-0,84], OR = 0,61 [95% CI: 0,43-0,87] för Dock180 rs4635002 ELLER = 0,59 [95% CI: 0,45-0,77], OR = 0,59 [95% CI: 0,45-0,76] för C3G rs7853122). Det fanns ingen heterogenitet över studierna (Cochran Q test p Hotel > 0,05) med undantag för rs10901081 ( p
= 0,040) (tabell 3) Review

Diskussion <. br>

i vår flerstegs genetisk analys, tre SNP, ERK rs5999749, Dock180 rs4635002 och C3G rs7853122 visade starka associationer med magcancer och kan vara viktiga reglerande faktorer i CagA signaltransduktionsvägen.

extracellulär signal reglerad kinas (ERK), också känd som mitogenaktiverat proteinkinas (MAPK) är en viktig punkt integration för flera cellulära signaler som reglerar olika onkogena svar. ERK signalväg interagerar med ett stort antal substrat, inklusive proteinkinaser, fosfataser, cytoskelettala komponenter, apoptos regulatorer, och en rad andra signalrelaterade molekyler [21]. CagA-signalering är en av strömmarna som är involverade i ERK signalkaskad. Ett flertal studier har rapporterat att CagA-positiv H. pylori
kan aktivera ERK i gastric epitelceller att främja olämpliga cellfunktioner [11], [21], [22], [23]. Dessutom interaktion mellan CagA och signaltransduktionsvägar proteiner främjar ERK signalering i samband med Ras, Mek och NF-kB, förmå gastrisk cancer. I cellulära mekanismer verkar ERK att vara inblandade i en mängd olika cellulära processer. Sålunda kan värdgenen av ERK-protein vara viktigare att bestämma proteinuttryck och kapacitet. Resultaten av denna studie visar att ERK rs5999749 primärt valts i SNP-baserad analys och behåller sin starka association med magcancer i de slutliga kombinerade analyserna. Detta stöder att dess genetiska effekt kan spela en avgörande roll i gastric cancer lika med dess proteinaktivitetsnivå på cellstadiet.

Dock180, synonymt med en dedicator av cytokines ett, är ett protein 180 kDa nedströms kombinera molekyl av Crk och upp-regulator av RAC1 [24]. Det modulerar olika funktioner, bland annat cellspridning, cellmigration, och aktin cytoskelettala organisation genom aktivering av RAC1 [24], [25], [26], [27], [28]. Detta protein är ett av de Crk-nedströms proteiner involverade i kaskaden av CagA och Crk signalering genom Crk-Codk180-elmo-vägen [9]. Likaså C3G kallas Rap guaninnukleotidutbytesfaktor (GEF) 1 (RAPGEF1) också interagerar med Crk [29]. Tidigare studier har visat att Crk-C3G-RAP1 signalering kan aktivera ERK kaskad och inducera apoptos, celltillväxt, migration, vidhäftning och dödlighet [30], [31], [32]. I human karcinogenes, visas C3G genen för att spela en avgörande roll i sig. Förändring av C3G genetisk aktivitet via amplifiering eller metylering är associerat med flera cancerformer, såsom lung-, gastrointestinala och gynekologisk cancer [33], [34]. Även om det inte är exakt väl känt om de genetiska varianter av Dock180 och C3G gen är kopplade till gastric cancer, föreslår vår studie flera SNP i dessa gener, särskilt rs4635002 och rs7853122 är signifikant associerade med risk för magcancer, och kan således vara en känslig gen i utvecklingen av magcancer.

Baserat på de nuvarande resultaten och översyn av cellulära mekanismer [3], [9], [11], [21], [22], [23], [24], [30], kan CagA onkogenicitetsstudie induceras genom aktivering av ERK signalvägen kan infered (Figur 1). Den CagA interaktion med bindande molekyler såsom Src, Crk, GRB2 och SHP-2 stimulerar nedströmssignaler i ERK kaskad kopplade till avvikande cellulära funktioner som leder till gastric cancer. Under denna process, kan de genetiska effekterna av ERK, Dock180 och C3G spela kritiska roller är lika med deras proteinaktiviteter. Dessa resultat ger stöd för den genetiska och cellulära betydelsen av dessa molekyler.

Vår genetiska analysen rimlig bevis på genetiska varianter av ERK signaltransduktionsvägen aktiveras av CagA, men flera begränsningar bör noteras. Först, antalet försökspersoner var tillräckliga för att säkerställa statistisk kraft för att bedöma exakt association mellan utvalda SNP och gastric cancerrisk. För det andra, på grund av den lilla provstorleken och brist på hjärtpatienter magcancer (mindre än 5%), vi kunde inte göra skiktad analys enligt magcancer typ, hjärt vs.
Icke-kardiell. Därför bör resultaten tolkas med försiktighet.

Denna studie visar att gener som är involverade i ERK signaltransduktionsvägen aktiveras av CagA kan modifiera risken för magcancer. ERK, kan Dock180 och C3G generna spelar en viktig roll i utvecklingen av magcancer. Replikering studier i andra populationer gör det möjligt för oss att belysa magcancer patologiska mekanismer. Ytterligare biologiska studier fokuserade på dessa gener kan klargöra sina roller i gastric cancer.

• PLOS ONE: Genomisk Profilering av submukosala-Invasive Gastric Cancer av Array-baserade jämförande genomik hybridisering
• PLOS ONE: MicroRNA Låt-7F hämmar tumörinvasion och metastas genom att rikta MYH9 i Human Gastric Cancer