Differentiella effekter av intragastrisk syra och capsaicin på gastrisk tömning och afferenta input till råttan ryggmärgen och hjärnstammen

Differentiella effekter av intragastrisk syra och capsaicin på magsäckstömning och afferenta input till råttan ryggmärgen och hjärnstammen Bild Sammanfattning
Bakgrund
Saltsyra (HCl) är ett potentiellt hot mot integriteten av magslemhinnan och är känd att bidra till övre delen av buken. Vi har tidigare funnit att gastrisk mukosal utmaning med överskott av HCl signaleras till råttan hjärnstammen, men inte ryggmärgen, såsom visualiseras genom uttryck av c-fos-messenger ribonukleinsyra (mRNA), en surrogatmarkör av neuronal excitation. Denna studie undersökte huruvida gastrointestinala exponering för kapsaicin, en stimulerande av nociceptiva afferenter som inte skadar magslemhinnan, signaleras till både hjärnstammen och ryggmärgen och om skillnader i afferenta signaleringen av gastrisk HCl och capsaicin utmaning är relaterade till olika effekter på magtömning.
Resultat
Råttor behandlades intragastriskt med vehikel, HCl eller capsaicin, aktivering av neuroner i hjärnstammen och ryggmärgen visualiserades genom hybridisering in situ-autoradiografi för c-fos-mRNA, och gastrisk tömning som härletts från den kvarhållande av intragastriskt administrerad fluid. I förhållande till fordonet, HCl (0,5 M) och kapsaicin (3,2 mM) ökade c-fos-transkription i kärnan tractus solitarii med faktorer av 7,0 och 2,1, respektive. Kapsaicin orsakade också en 5,2-faldig ökning av c-fos mRNA-uttryckning i lamell I i den kaudala bröstkorg ryggmärgen, även om antalet c-fos-mRNA-positiva celler i denna lamina var mycket liten. Således, i genomsnitt bara 0,13 och 0,68 c-fos mRNA-positiva celler räknades i 0,01 mm sektioner av den ensidiga lamina jag efter intragastrisk administrering av fordon och capsaicin, respektive. I kontrast, intragastrisk HCl misslyckades med att inducera c-fos-mRNA i ryggmärgen. Mätning av gastrisk vätskeretention avslöjade att HCI tryckt magtömning medan capsaicin inte.
Slutsats
Resultaten från denna studie visar att gastrointestinala exponering för HCI och capsaicin differentiellt överförs till hjärnstammen och ryggmärgen. Eftersom endast HCl block magtömning, är det en hypotes att de båda stimuli omvandlas av olika afferenta vägar. Vi drar slutsatsen att HCI uteslutande signaleras av mag vagala afferenter medan capsaicin bearbetas både mag vagala och tarm spinal afferenter.
Bakgrund
Magsyrarelaterade sjukdomar är bland de vanligaste slemhinnor störningar i övre mag-tarmkanalen. Det finns också belägg för att saltsyra (HCI) bidrar till smärta i samband med gastroesofageal reflux och ulcussjukdom samt icke-kardiell bröstsmärta och funktionell dyspepsi [1-3]. Gastric chemonociception framkallad genom exponering av råttmage till överskott av HCl förmedlas av vagala afferenta neuroner, med tanke på att visceromotor smärta svar på intragastrisk (IG) administrering av HCl avskaffas genom bilateral vagotomi, medan visceromotor svar på uttänjning är oförändrad [4] . Detta resultat överensstämmer med vår observation att IG administrering av HCl signaleras till kärnan tractus solitarii (NTS) av rått-hjärnstammen, det centrala anslutningsområdet av vagala afferenta nerver, som visualiseras genom expression av budbärar-ribonukleinsyra (mRNA) för det omedelbara tidiga gen c-fos, medan ingen induktion av c-fos-mRNA ses i ryggmärgen [5, 6]. På liknande sätt, gastric utmaning med ammoniumhydroxid inducerar c-fos-mRNA och protein endast i hjärnstammen, men inte ryggmärgen, hos råtta [7]. Medan både HCl och ammoniumhydroxid skada magslemhinnan vid koncentrationer som orsakar nära maximal översättning av c-fos-genen i NTS [7], är capsaicin en kemikalie som exciterar gastrointestinala afferenta neuroner [8-10] utan att orsaka skada på råttmage [11]. Detta beror på att capsaicin stimulerar afferenta neuroner genom grind Transient Receptor Potential jonkanaler av vanilloid typ 1 (TRPV1), som uttrycks av både vagala och spinal afferenta nervceller innerverar råttan magen och tarmen [12-16].
Övergripande målet av detta förberedande studie var att testa om gastrisk mukosal utmaning med kapsaicin och överskott av HCl är differentiellt överförs till råtthjärnstammen och ryggmärgen och huruvida differential bearbetning av de två stimuli sker på nivån för den övre gastrointestinala kanalen. Två uppsättningar av experiment utfördes för att ta itu med dessa frågor. I den första studien, IG administreras capsaicin och HCl jämfördes i deras effekt på expressionen av c-fos-mRNA i NTS och i den kaudala bröstkorg ryggmärgen som tar emot den tätaste afferenta input från råttmage [17, 18]. Det var framför allt undersökte huruvida IG administrering av HCI och capsaicin har en tydlig effekt på nervceller i specifika lameller och kärnor i rygg ryggmärgen. Koncentrationerna av HCI (0,5 M) och capsaicin (0,64 och 3,2 M) testades i dessa experiment valdes från tidigare experiment. Exponering av råttans magslemhinna till HCl (0,5 M) orsakar en distinkt men submaximal induktion av c-fos-mRNA i hjärnstammen [5], medan IG administrering av 0,64 mM kapsaicin är maximalt effektivt för att öka gastrisk mukosal blodflödet i en sensorisk neuron -beroende sätt [19].
Eftersom det konstaterades att den afferenta signaleringen av HCI och capsaicin till NTS och ryggmärgen är annorlunda, syftet med den andra studien var att undersöka om HCI och capsaicin inflytande gastrisk motilitet och tömning i en differential sätt. Det resonerades att storleken av c-fos-svar i NTS och ryggmärgen beror både på koncentrationen av kemikalierna och varaktigheten av deras närvaro i magen. Det har tidigare visat sig att IG administrering av överskott av HCl inhiberar gastrisk tömning och förändrar intragastriskt tryck [5, 20]. Resultaten av denna studie visar att, till skillnad från överskott av HCl, inte capsaicin inte hämmar magtömning. Det är en hypotes, och därför är som gastric HCl utmaning uteslutande signaleras till hjärnstammen via vagala afferenta nerver, eftersom den kvarhålles i magen under en förlängd tidsperiod, medan både gastriska vagala och duodenal spinal afferenter svara på IG administrering av kapsaicin, den tömning av vilka i tolvfingertarmen är inte efterbliven.
Resultat
Effekter av HCI och capsaicin att inducera c-fos mRNA i NTS och ryggmärgen (studie 1) Review som illustreras tidigare [5, 21], IG administrering av 0,5 M HCl orsakade många nervceller i NTS att uttrycka c-fos mRNA jämfört med IG administration av fysiologisk saltlösning. Antalet c-fos-mRNA-positiva celler per sektion ses efter IG administrering av HCl var 7,0 gånger större än efter IG administrering av fysiologisk saltlösning (Figur 1). Antalet c-fos-mRNA-positiva neuroner per NTS avsnitt räknades efter IG administrering av vehikel tenderade att vara högre än efter administrering av fysiologisk saltlösning, även om denna effekt var statistiskt inte signifikant (Figur 1). I förhållande till fordonet, kapsaicin (0,64 och 3,2 mM) förstärkt antalet c-fos-mRNA-positiva neuroner per NTS sektion, denna effekt beroende på koncentrationen av läkemedlet. Såsom kan ses i figur 1, var endast koncentrationen av 3,2 mM kapsaicin förmåga att signifikant öka induktionen av c-fos-mRNA med en faktor av 2,1. Distributionen av c-fos-mRNA-positiva celler i NTS efter IG exponering för HCl (0,5 M) och kapsaicin (3,2 mM) var ojämn, det högsta antalet aktiverade celler som inträffar i den ventromediala delen av NTS [22]. Figur 1 Antal c-fos mRNA-positiva celler per avsnitt (0,01 mm) i den ensidiga NTS bestämdes 45 minuter efter IG administration av NaCl (0,15 M), HCI (0,5 M), fordon (Veh) och capsaicin (Cap, 0,64 och 3,2 mM). Medel + SEM, n som anges. * P < 0,05 kontra Veh, ** P < 0,01 kontra NaCl.
I överensstämmelse med tidigare fynd [5], IG exponering för 0,5 M HCl misslyckades att inducera något uttryck av c-fos-mRNA i dorsal hälften av den kaudala bröstkorg ryggmärgen. Således, det totala antalet c-fos-mRNA-positiva celler per dorsal ryggmärg avsnitt räknades efter IG exponering för fysiologisk saltlösning var 1,30 ± 0,29 (n = 4) och efter IG exponering för HCl 1,33 ± 0,18 (n = 4). Denna brist på effekt av HCI sågs också när fördelningen av c-fos mRNA-positiva celler till LI, LII, LIII, LIV, LV, AX och IMLN efter IG administrering av HCI jämfördes med den efter IG administration av fysiologisk saltlösning ( Figur 2A). IG administration av kapsaicin (3,2 mM) har inte heller signifikant öka uttrycket av c-fos-mRNA i dorsal ryggmärg, med tanke på att det totala antalet C-fos mRNA-positiva celler per sektion räknades efter IG exponering för fordonet var 2,19 ± 0,32 (n = 6) och efter IG exponering för kapsaicin var 1,94 ± 0,23 (n = 7). Analys av fördelningen av c-fos mRNA-positiva celler till LI, LII, LIII, LIV, LV, AX och IMLN avslöjade dock lät capsaicin en betydande 5,2-faldig ökning av c-fos mRNA-expression i LI, som gick parallellt med en signifikant minskning i bildning av c-fos-mRNA i LIII och LIV (Figur 2B). Det bör noteras att graden av c-fos-transkription var mycket låg, som typiskt mindre än 0,7 c-fos-mRNA-positiva celler per lamina räknades i mm sektioner av den ensidiga dorsala ryggmärgen 0,01 (Figur 2). Av denna anledning har de experiment med HCI och capsaicin strikt parallellt med de som rör respektive kontroll /fordon lösning (Figur 2). Figur 2 Antal c-fos-mRNA-positiva celler per sektion (0,01 mm) i olika lamellerna och områden av det ensidiga dorsala hälften av den kaudala bröstkorg ryggmärgen bestämdes 45 minuter efter IG administrering av (A) NaCl (0,15 M), HCl (0,5 M), (B) fordon (Veh) och capsaicin (Cap, 3,2 mM). Diagrammen visar räknas för lameller I-V (LI-LV), område X (AX) och intermediolateral kärnan (IMLN). Medel + SEM, n som anges. * P < 0,05, ** P < 0,01 kontra Veh.
Effekter av HCI och capsaicin på intragastriskt tryck och magsaft återhämtning (studie 2)
baslinjen IGP mäts före administrering av något medium var mellan 400 och 500 Pa [20]. IG injektion av en 2 ml vätska bolus ökade IGP till en nivå, vars storlek var oberoende av om den injicerade fluiden var salin, HCl (0,35 M), vehikel eller capsaicin (3,2 mM) såsom bestämdes 2-3 min efter injektion (figur 3A ). I motsats härtill tidsförloppet för den efterföljande minskningen av IGP berodde på naturen av den administrerade mediet. Efter injektion av saltlösning eller vehikel, minskade IGP i en betydligt snabbare takt än efter injektion av HCl eller capsaicin, respektive (figur 3B). Således, i HCI-och capsaicin exponerade magar IGP inte signifikant faller under 30 min observationsperioden efter injektion, medan i NaCl- och fordonsexponerade magar IGP minskade signifikant till nivåer av ca 65% av IGP mätt 2-3 min efter injektion (Figur 3B). En annan effekt av HCl var att öka gastrisk vätskeretention som härletts från en återställnings 100% av den injicerade vätskevolym från magen 30 min efter injektion (Figur 3C). Däremot var 30 min efter administrering av saltlösning, vehikel eller capsaicin endast 30-60% av den injicerade vätskevolym återfick (figur 3C). Figur 3 Effekter av intragastrisk injektion av NaCl (0,15 M), HCI (0,35 M), fordon (Veh) och capsaicin (Cap, 3,2 mM) i (A) inledande ökningen av intragastriskt tryck (IGP), (B) senare tidpunkt loppet av IGP och (C) vätske återhämtning från magen. NaCl, HCl, Veh och Cap injicerades som 2 ml bolus. De värden som visas i panel A representerar IGP nådde 2-3 min efter injektion. IGP värden som uppmätts under de perioder 9-10 min och 29-30 min efter injektion (panel B) uttrycks som en procentandel av den initiala IGP upphov registreras 2-3 min efter injektion, och den gastriska volymen återhämtning (panel C ) mätt 30 min efter bolusinjektion uttrycks som en procentandel av den injektionsvolym (2 ml). Medel + SEM, n = 6-13. ** P < 0,01 mot IGP mätt 2-3 min efter injektion; ++ P < 0,01 kontra NaCl.
Diskussion
Resultaten av den aktuella studien visar att IG administrering av HCl och capsaicin till råttor alstrar differentiella ingångar till NTS och bröstkorg ryggmärgen, som är associerad med differentiella effekter på gastrisk tömning. Som tidigare beskrivits [5, 7], gastric signalering till hjärnstammen och ryggmärgen visualiserades genom uttryck av de inducerbara gen c-fos på mRNA-nivå, en metod som har etablerats som ett standardverktyg i funktionell neuroanatomi att avgränsa stimulans -evoked aktivering av neuroner [23, 24]. Transkription av c-fos-genen börjar inom minuter efter neuronal excitation [23, 24] och i NTS tycks vara maximal 45 min efter gastrisk HCl utmaning [5]. Även exponering för HCI (0,35-0,7 M) inducerar gastrointestinala skador i en koncentrationsrelaterad sätt, finns det bevis för att den afferenta signaleringen av gastrisk HCl utmaning inte är direkt relaterad till bildandet av mucosal skada, eftersom uttrycket av c- fos-genen i NTS kan stimuleras av IG koncentrationer av HCl som inducerar liten, om någon, epitelskada [5, 7]. Det har därför varit en hypotes [5, 7] att en massiv ökning av H + jongradient över gastrointestinala barriären är i sig tillräcklig för att driva H + joner i lamina propria där de kan uppväcka vagala afferenta nervfibrer, antingen direkt [25, 26] eller indirekt via neuroaktiva faktorer som frisätts i vävnaden.
topografiska fördelningen av c-fos-mRNA-positiva celler i NTS var ojämn men liknande efter IG administrering av HCl och capsaicin. Som tidigare visat genom immunhistokemi [22], var det högsta antalet HCI-aktiverade neuroner sett i ventromediala delen av NTS. Bortsett från vagal gastric ingång [27], denna del av NTS mottar också input från spinal lamina I nervceller via spinosolitary vägarna [28-30]. Det relativa bidraget av de vagala och spinal ingångar till denna del av den NTS följande kemiska stimulering av magen återstår att fastställa.
Föreliggande studie bekräftar att överskott av gastrisk HCl misslyckas med att inducera c-fos-mRNA och c-Fos-protein i det dorsala hornet av den bakre torakala ryggmärgen [5, 7] som tar emot den tätaste input från afferenta neuroner som innerverar råttans mage [17, 18]. Liknande fynd har gjorts efter exponering av råtta magslemhinnan till ammoniumhydroxid [7]. Det föreföll därför som om gastric utmaning med skadliga kemikalier signaleras av vagala afferenter bara är en gissning som förkastades av den nuvarande upptäckten att afferenta input från capsaicin-exponerade mage skickas både till ryggmärgen och hjärnstammen. Detta resultat är i linje med uttrycket av TRPV1, capsaicin-receptorn, både vagala och spinal afferenta nervceller innerverar råtta mag-tarmkanalen [12-16]. Retrograd spårning har visat att 80 och 71% av de KNUTIG och dorsala ganglieneuroner försörjer råttmage, respektive, uttrycka TRPV1 [16]. När de appliceras direkt till somata, exciterar capsaicin 90% av de dorsala ganglieneuroner och 59% av de KNUTIG ganglieneuroner utskjutande till råttan magen [31]. Medan TRPV1 är lätt att upptäcka i KNUTIG ganglierna, ligger under immunhistokemisk detekteringströskel [12] nivån TRPV1 uttryck i de flesta vagala afferenta nervfibrer i magen. Detta exempel skulle kunna förklara varför IG administrering av kapsaicin inducerar jämförelsevis litet uttryck av c-fos mRNA i NTS. Vi tror inte att den lilla effekten av kapsaicin är på grund av otillräcklig dosering, eftersom det har tidigare visat sig att IG administrering av 0,64 mM capsaicin är maximalt effektiv i att öka gastrointestinala blodflödet i ett sensoriska neuron beroende sätt [19].
Liksom HCI, capsaicin administrerades i råttmage misslyckats med att avsevärt förbättra den totala uttrycket av c-fos mRNA i rygg hälften av den bakre bröst ryggmärgen. Visade dock regional analys som kapsaicin orsakade neuroner i den ytliga lamina I dorsalhorn att uttrycka c-fos mRNA, en effekt som inte sågs efter IG administrering av HCI. Detta fynd erhölls med capsaicin är förenlig med projektionen av viscerala afferenta neuroner till lamina I och den ytliga delen av lamina II såväl som till lamina V och området X i råtta och katt ryggmärg [17, 32]. Våra data indikerar att administrering av kapsaicin in i de gastriska lumen aktiverar sensoriska neuroner som skjuter i första hand till lamina I i ryggmärgen. Mot bakgrund av dessa fynd kan det uteslutas att c-fos-uttryck är en otillräcklig metod för att visualisera chemoreceptor signalering från de gastriska lumen till ryggmärgen och att ett fel i gastrisk HCl utmaning att inducera c-fos-mRNA i ryggmärgen representerar ett falskt negativt resultat. Även om neurala sensorer varigenom överskott av HCl detekteras i magsäckens lumen inte är kända, är det tänkbart att både TRPV1 och syra avkänning jonkanaler (ASIC) såsom ASIC3 deltar [33]. Eftersom både TRPV1 och ASIC3 uttrycks av en majoritet av dorsala ganglieneuroner förser råttmage [16], verkar det osannolikt att IG HCI misslyckas att inducera c-fos mRNA i ryggmärgen, eftersom de respektive afferenter inte bär den lämpliga syran sensorer.
Jämfört med antalet neuroner som uttrycker c-fos mRNA i NTS, antalet c-fos-mRNA-positiva neuroner i 0,01 mm sektioner av ryggmärgen var mycket liten. Detta kommer sannolikt att återspegla att inåtledande input från råttmage till ryggmärgen är mindre i förhållande till ryggrads input från somatiska vävnader och att elektrofysiologiskt kännetecknas spinal afferenter knappast innerverar slemhinnan i mag-tarmkanalen [34, 35]. Den låga nivån av c-fos transkription i lamellerna av rygg ryggmärgen gjorde det obligatoriskt att köra experiment med HCI och Capsaicin strikt parallellt med de som rör respektive kontroll /fordon lösning. Vår hypotes är att den till synes olika fördelningen av c-fos mRNA-positiva celler i dorsala ryggmärgen hos kontrollråttor, som visas i de två panelerna i figur 2, får inte bara återspeglar inter-experiment variationer men också olika karaktär kontroll /vehikellösning: medan fordonet för HCl var fysiologisk saltlösning, fordonet för capsaicin var koksaltlösning innehållande etanol och Tween 80.
effekten av IG kapsaicin för att öka c-fos-mRNA-induktion i lamell i i ryggmärgen var förknippad med en signifikant minskning av c-fos-mRNA-uttryck i lamellerna III och IV. Vi har inte någon okomplicerad förklaring till denna observation. Eftersom lamellerna III och IV inte verkar få direkt ingång från inälvor [17, 32], hypotes vi att minskningen av c-fos mRNA bildning i dessa laminat är en indirekt effekt av kapsaicin. Möjligen, visceral afferenta input via lamina I nervceller aktiverar hämmande vägar som hämmar retbarhet av lamina III och IV neuroner.
Afferenta signalering av gastrointestinala exponering för kapsaicin och överskott av HCl bestäms inte bara av koncentrationen av den skadliga kemikalien men även genom varaktigheten av sin närvaro i mag lumen. Det har tidigare visat sig att, i förhållande till salin, IG administrering av HCl till sövda råttor förlänger vätskeretention i magen och förseningar anpassning av IGP [7, 20]. HCl-inducerad gastriska vätskeretention resultat från hämning av gastrisk tömning och förbättrad magsaft, bikarbonat och slemutsöndring [20, 36], men analys av maginnehållet var utanför ramen för denna studie. HCl-framkallade inhibering av gastrisk tömning medieras av neurala reflexer som initieras både i magsäcken och tolvfingertarmen [20, 37-40]. Koncentrationen av HCl testas för sina gastropyloric motoreffekter i bedövade råttor minskades till 0,35 M, eftersom anestesi försvagar gastrointestinala hinder för HCI och IG koncentrationen av HCl (0,5 M) med avseende på dess effekt på centrala c-fos-uttryck inducerar omfattande skada på sövda råttor men orsakar mindre gastrisk skada vid medvetande djur [5]. Som experimenten avslöjade, gastric exponering för HCI och capsaicin modifierade gastropyloric rörlighet på en differential sätt. Medan gastrisk tömning blockerades av HCI men lämnas oförändrad av kapsaicin, var anpassningen av IGP förhindras genom både HCI och capsaicin. Effekten av kapsaicin att fördröja IGP anpassning kan vara relaterad till dess förmåga att inducera kontraktion eller relaxation av rått gastric muskulatur, den typ av svar beroende på dosen av capsaicin och den gastriska regionen och muskelskiktet under studien [19, 41-43 ]. hotell med avseende på olikartade effekten av IG HCI och capsaicin på spinal c-fos-uttryck var det särskilt viktigt att notera att, till skillnad från HCI, misslyckades capsaicin att förbättra magsaft återhämtning, vilket innebär att gastrisk tömning inträffade felfri och IG administreras capsaicin snabbt transporteras in i övre tunntarmen. Det kan därför hävdas att kapsaicin-framkallad c-fos svar i NTS, som var mindre än det HCI, och ryggmärgen beror på kapsaicin-framkallad excitation av både mag- och tarm afferenter, medan den excitatoriska effekten av HCI är i stort sett begränsade till gastric afferenter. Misslyckandet i gastric HCI utmaning att inducera c-fos-uttryck i ryggmärgen kan inte förklaras av den rapporterade förmåga vagala afferenter för att aktivera fallande vägar och därigenom hämma afferenta input till ryggmärgen [44, 45], eftersom bilateral kronisk Vagotomy misslyckas att avslöja någon ökning av spinal c-fos mRNA induktion på grund av gastrisk HCl utmaning [5]. Det finns andra sätt att förklara skillnaden förmåga IG HCI och capsaicin att inducera c-fos mRNA i NTS och ryggmärgen, men analysen av dessa faktorer var utanför ramen för denna studie. Till exempel, finns det bevis för att kapsaicin är föga absorberas i magväggen [19], som också skulle förklara varför IG administreras capsaicin är jämförelsevis svag för att stimulera gastriska vagala afferenta nerver utskjutande till NTS, medan capsaicin transporteras till den övre tunntarmen kan mer lätt nå och stimulera spinal afferenta nervterminaler i tarm lamina propria.
grund av sin explorativ karaktär, har den aktuella studien sina begränsningar. Således är sannolikt differentiella effekten av IG administrerat capsaicin och HCI på vagala och spinal afferenta vägar att bero inte bara på magtömningshastigheten och absorptionskinetik HCl och capsaicin men också på omfattningen av mucosal skada och storleken på mucosal blod flöde. Medan integriteten hos magslemhinnan är endast störs av HCl [5, 7, 46], men inte genom att capsaicin [11], gastrisk mukosal blodflödet är förhöjd av både kapsaicin [19] och backdiffusing HCl [46].
Slutsats
Gastric utmaning med HCI och capsaicin differentiellt signaleras till NTS och ryggmärgen, vilket tyder på att de två stimuli behandlas av disparata nociceptiva afferenta vägar. Eftersom HCl inhiberar gastrisk tömning, medan capsaicin inte, är det sluta sig till att HCl-framkallade afferenta insignal till NTS överförs av vagala afferenta nerver i magen, under det att aktivering av NTS och spinal lamina I neurons by capsaicin förmedlas både av vagal afferenter i magen och genom spinal afferenter i den övre tunntarmen. Det krävs ytterligare experiment för att bestämma hur dessa resultat relaterar till gastric chemonociception. I samförstånd med våra c-fos data, nociception framkallas genom överskott gastric HCI förmedlas av vagala afferenta neuroner [4], och det väntar på att undersökas vilka afferenta vägar relä nociception framkallad av gastric capsaicin. Mechanonociception framkallad av utspänd magen till följd av spinal afferenter [4], även om uttrycket av c-fos syns både i ryggmärgen och i större utsträckning, i hjärnstammen [47].
Metoder
Djur
studien godkändes av en etisk kommitté vid förbundsministeriet för utbildning, vetenskap och kultur i Österrike och genomförs i enlighet med direktiv rådets Europeiska gemenskapernas av den 24 november 1986 (86/609 /EEG) . Experimenten var utformade på ett sådant sätt att antalet djur som används och deras lidande minimerades. Kvinnliga åldersmatchade Sprague-Dawley (Abteilung für Labortierkunde und -genetik, Medical University of Vienna, Himberg, Österrike) som vägde 180-220 g användes. De inhystes i grupper om fyra i plast transparent burar under normala förhållanden; lamporna var på från 06:00 tills 06:00.
Experimentella protokoll
Alla experiment ägde rum under den ljusa fasen 8:00 till 00:00. Tjugo timmar innan börjar av experimenten råttorna berövades mat för att säkerställa att magen var tom vid tidpunkten för experimenten, medan vatten fanns tillgängligt ad libitum under hela denna förberedande fas. Dessutom placerades råttorna i grupper om två på ett golv galler för att förhindra coprophagy. Två studier med olika experimentella protokoll utfördes.
Studie 1 genomfördes med icke-bedövade djur. Fysiologisk koksaltlösning (0,15 M NaCl), HCl (0,5 M), kapsaicin (0,64 och 3,2 mM) eller dess vehikel administrerades IG vid en volym av 10 ml /kg genom en mjuk spädbarnsuppfödning rör (ytterdiameter 2,2 mm; Portex, Hythe , STORBRITANNIEN). Efter 45 minuter råttorna avlivades genom intraperitoneal injektion av en överdos av pentobarbital (200 mg /kg, Intervet, Wien, Österrike) och deras hjärnstammen och ryggmärgen avlägsnas snabbt. Capsaicin (Sigma, Wien, Österrike) löstes upp i ett medium innehållande 10% Tween 80, 10% etanol och 80% fysiologisk saltlösning för erhållande av stamlösningar av 2 och 10 mg /ml (6,4 och 32 mM) kapsaicin. Dessa förrådslösningar späddes sedan med fysiologisk saltlösning för erhållande av testlösningar av 0,64 och 3,2 mM capsaicin, respektive. Fordonet för capsaicin bestod av 1% Tween 80, 1% etanol och 98% fysiologisk saltlösning
Studie 2 utfördes med djur som sövdes med fenobarbital (230 mg /kg intraperitonealt; Sigma). Och släpps ut på ett termostat tabell till bibehålla sin rektala temperaturen vid 37 grader Celsius [20]. Råttorna sedan förses med en trakealkanyl för att underlätta spontan andning. En kanyl i den vänstra halsvenen användes för kontinuerlig infusion av fysiologisk saltlösning (1,5 ml /h) för att undvika uttorkning. Efter en mittlinje laparotomi en IG-kateter (ytterdiameter: 2,2 mm) sattes in i magsäcken via matstrupen, och magen spolas [20]. Med sin spets är placerad i corpus regionen, den kateter som används för att spela in intragastriskt tryck (IGP) via en tryckomvandlare och för att injicera fluid in i och tömma den från magen [20]. Denna metod för IGP mätning har beskrivits och validerats i en tidigare studie [20]. Efter en jämviktningsperiod av 30 min tillsattes en 2 ml vätska bolus injiceras långsamt i magen under en period av 5 s och lämnades i magen under en period av 30 minuter varefter magsäcken avhälldes och vikten av den utvunna vätske bestäms . Återvinning av vätska från magen (ett indirekt mått på magtömning) uttrycktes som en procentandel av vikten av den fluid som administreras till magsäcken [20]. Varje råtta underkastades fyra injektion /återhämtnings prövningar i intervall på 15 minuter, under vilken magen lämnades tom. Först framställdes två primära prövningar med saltlösning genomfördes, följt av antingen en testprov med koksaltlösning och en testprov med HCl (0,35 M) eller av ett testförsök med fordon och en testförsök med capsaicin (3,2 mM). IGP var i genomsnitt för de perioder av 2-3 min, 9-10 min och 29-30 min efter injektion. Eftersom såsom beskrivits tidigare [20] topp ökningen av IGP efter injektion varierade på grund av skillnader i injektionshastighet, i genomsnitt IGP under perioden 2-3 minuter efter injektion togs som 100% och IGP registrerats under den efterföljande observations perioder uttryckta i procent av det referensvärde.
In situ hybridisering autoradiografi
hjärnstammen och ryggmärgen avlägsnades snabbt och frystes på pulveriserad torris. Koronala sektioner (0,01 mm) skars ut seriellt från hjärnstammen vid rostrocaudal förlängning av area postrema och den kaudala bröstkorg ryggmärgen med en kryostat [5, 6, 22]. Var sjätte sektionen bearbetades för hybridisering in situ med en oligodeoxiribonukleotid sond märkt vid 3'-änden med [ 35S] deoxiadenosin 5 '(α-tio) trifosfat, såsom beskrivits tidigare [6]. Sektionerna doppades i Ilford K5 fotografisk emulsion och efter 18-25 dagars exponering i förseglade lådor vid 4 grader Celsius, autoradiogrammen utvecklades och sektionerna motfärgades med hematoxylin och täck [6]. Specificiteten för förfarandet bevisades genom frånvaron av varje hybridiseringssignal när kontrollsektioner hybridiserades med en blandning av märkt sond med ett 100-faldigt överskott av omärkt ( "kall") sond.
Autoradiogrammen undersöktes i en kodad sätt med ett ljusmikroskop (Axiophot, Zeiss, Oberkochen, Tyskland) kopplad till ett datoriserat bildanalyssystem (Imaging, St. Catharines, Ontario, Kanada). Celler ansågs c-fos-mRNA-positiva när deras korndensiteten var minst 10 gånger högre än bakgrunden [6]. För att öka tillförlitligheten av de kvantitativa resultaten, var 5 hjärnstamssektioner och 7-10 ryggmärgs sektioner från varje djur utvärderas. Dessa sektioner valdes så att de var 0,05 mm från varandra för att undvika att samma celler räknades två gånger. C-fos-mRNA-positiva celler per sektion räknades ensidigt i NTS vid nivån för area postrema och i den dorsala delen av ryggmärgen vid den kaudala thoraxnivå (T8-T12). Dessa strukturer har identifierats enligt Molander och Grant [48] och Paxinos och Watson [49]. I rygg hälften av ryggmärgen, var fördelningen av c-fos mRNA-positiva celler till lameller IV (LI-LV), område X (AX) runt den centrala kanalen och intermediolateral kärnan (IMLN) utvärderas enligt råtta spinal cytoarchitecture beskrivits av Molander et al.

• Gastrointestinal stromal tumör i magen härma en levertumör: ett fall report
• Ny teknik för galla rekonstruktion med en isolerad magsond med en vaskulariserad BLOMSTJÄLK: ett levande djur experimentell studie och den första kliniska case