Utvärdering av passagen av Lactobacillus gasseri K7 och bifidobakterier från magen till tarmarna genom att använda en enda reaktor model

utvärdering av passagen av Lactobacillus gasseri
K7 och bifidobakterier från magen till tarmarna genom att använda en enda reaktor modell Bild Sammanfattning
bakgrund
Probiotiska bakterier tros spela en viktig roll i matsmältningssystemet och därför måste överleva passagen från magen till tarmarna. Nyligen genomfördes en ny metod för att simulera passage från mage till tarmarna i en enda bioreaktor utvecklas. Fördelen med detta automatiserade ett reaktorsystem var förmågan att testa inverkan av syra, gallsalter och pankreatin.
Lactobacillus gasseri
K7 är en stam som isolerats från begynnes faeces med egenskaper som gör stammen intressant för ostproduktion. I denna studie var en enda reaktor som används för att utvärdera överlevnaden av L. gasseri
K7 och utvalda bifidobakterier från vår samling genom magen-tarmkanalen.
Resultat
Initial screening för syrabeständighet i surgjort kultur media visade en låg tolerans för Bifidobacterium dentium
för detta tillstånd som indikerar låg överlevnad i passagen. Liknande resultat uppnåddes med B. longum
subsp. infantis
medan B. animalis
subsp. lactis
hade en hög överlevnad.
Dessa inledande resultat bekräftades i bioreaktorn modellen i magen-tarmen passagen. B. animalis
subsp. lactis
hade den högsta överlevnaden (10%) uppnå cirka 5 x 10 6 cfu ml -1 jämfört med de andra testade bifidobakterier stammar som reducerades med en faktor på upp till 10 6 . Lactobacillus gasseri
K7 var mindre motståndskraftig än B. animalis
subsp. lactis
men överlevde vid cellkoncentrationer ungefär 1000 gånger högre än andra bifidobakterier.
Slutsats
I denna studie kunde vi visa att L. gasseri
K7 hade en hög överlevnad i mag- tarmen passagen. Genom att jämföra resultaten med en tidigare studie hos smågrisar kunde vi bekräfta tillförlitligheten hos vår simulering. Av de testade bifidobakterier stammar, endast B. animalis
subsp. lactis
visade acceptabel överlevnad för en framgångsrik övergång i systemsimulering.
Bakgrund
probiotika, särskilt mjölksyrabakterier har positiva effekter för konsumenterna hälsa som föreslås i 1907 [1]. Man trodde att bakterier styrs främst infektioner orsakade av tarmpatogener och reglerad toxoaemia och därigenom förbättra hälsan och påverka dödligheten. Samtidigt har det varit känt att en del av de positiva effekterna för konsumenterna hälsa är en förbättring i mikrofloran balans i tarmen, stimulering av immunsystemet och medhjälp organismen att bekämpa patogena mikroorganismer [2]. En stor del av intresset koncentrerades på användning av stammar av släktena Lactobacillus Mössor och Bifidobacterium
, även om det också finns andra bakterier med probiotiska effekter, t.ex. några propionibakterier. sälja The ovannämnda egenskaper är också grunden för en mikroorganism märkas probiotiska. Det finns olika definitioner i hela världen, men de är liknande innehåll. Ett av kriterierna för en probiotisk stam är dess motståndskraft mot syra och mag lösningar i mag- och tarmkanalen [3]. Det är därför viktigt att utvärdera beständigheten hos en potentiell probiotisk stam till den sura och gastric miljö i tarmen.
Grund av höga kostnader och etiska samt säkerhetsföreskrifterna för kliniska studier, är lättare screening överlevnad för att simulera in vitro
. Ett enkelt test är att inkubera bakteriecellerna i sura eller galla saltlösningar under en definierad tidsperiod och räkna antalet överlevande celler. I ett ytterligare steg, är simuleringen utförs i omrörda kolvar, som kombinerar surhet och gastriska lösningar följt av en uppskattning av överlevande celler över hela simuleringen. Detta är en mer realistisk replikering av betingelserna i tarmen [4]. Ett annat system, simulatorn av människans tarm Microbial Ecosystem (Shime), består av fem till sex seriekopplade pH kontrollerade bioreaktorer [5-7]. Installationen är ganska komplicerat och kräver absolut anaeroba förhållanden. Vidare är absorptionen av metaboliter och vatten inte simuleras. Detta var övervinnas genom användning av dialysmembran som beskrivits av Marteau et al
. [8].
Nyligen ett nytt system med hjälp av en enda bioreaktor har utvecklats för att studera magen-tarmkanalen [9]. Systemet får pH ändras i en enda reaktor och anpassades till retentionstiderna i de olika regionerna i magen-tarmkanalen.
Lactobacillus gasseri
K7 nyligen isolerats från spädbarn avföring [10]. Det ger en bakteriocin som är aktivt mot Clostridium
sp. och deras sporer. L. gasseri
tillhör den så kallade "acidophilus" -gruppen och flera oberoende studier identifierade dessa stammar som invånare i huden och tarmen [11-13]. I tidigare försök har det redan visats in vitro
att L. gasseri
K7 levde i en sur miljö och med 0,3% gallsalter [10]. Dessa fynd gör stammen intressant som en möjlig probiotika.
I denna studie, ett enda bioreaktor system baserat på arbetet av Sumeri et al
. [9] användes för att utvärdera överlevnaden av Lactobacillus gasseri
K7 och åtta Bifidobacterium
stammar från vår samling. Vi kunde jämföra resultaten för L. gasseri
K7 med en studie på smågrisar [14], som gjorde det möjligt för bedömning av en korrelation mellan in vitro
studie med resultat från in vivo
experiment .
retentionstiderna och pH som används i denna studie baserades på data från litteraturen. Det finns flera metoder för mätning av pH i tarmen [15]. Tabell 1 visar de pH-värden i de olika delarna av tarmen mätt genom Heidelberg kapsel [16, 17]. Retentionstider kan beräknas antingen genom att använda markörämnen (kemiska) eller genom radio telemetri kapslar såsom Heidelberg
kapsel [18]. Emellertid kapslar har oftast längre retentionstider än kemiska markörer. Tabell 2 listar några av retentionstiderna som finns i litteraturen [4, 5, 19-24] .table 1 pH-värden i människans tarmkanalen, mätt med Heidelberg
kapsel.
vid magen
duodenum
Jejunum
Ileum
proximala
medial
Distal
pH
1,4 **
6,22 *
6,4 **
7,1 **
7,4 **
* Fallingborg et al
. 1994 [16]
** Fallingborg et al
. 1998 [17]
Tabell 2 Retentionstider i tunntarmen som det hänvisas till i litteraturen.
Retentionstid
Källa
Anmärkningar

1-4 h
Huang och Adams 2004 [21]
4,25 h
Van Den Driessche et al
. 2000 [24]
magen och tunntarmen
4 h
Mojaverian 1996 [22]
6 h
Picot och Lacroix 2004 [4]
Selected maximal tid av simuleringen
7,5 h
Fallingborg et al
. 1990 [20]
barn
8 h
Fallingborg et al
. 1989 [19]
8 h
Alander et al
. 1998 [5]
Simulering i shime Reactor
6-10 h
Thews et al
. 1991 [23]
Baserat på de uppgifter som finns i litteraturen och det arbete som Sumeri et al
. [9] jäsningsprocessen inrättades som beskrivs i Material och metoder och visas i Figur 1. Figur 1 Parametrar i magen-tarmkanalen simulering över 7 h.
Resultat
Acid motstånd screening
Syftet med en första serie tester var att få en överblick över syrabeständigheten hos åtta bifidobakterier stammar. Figurerna 2, 3 och 4 visar överlevnaden av dessa stammar med hjälp av konturdiagram gjorda med Sigmaplot. Bifidobacterium dentium
(figur 3) visade minsta syraresistensen. Mellan pH 4,0 och pH 2,0 var det ingen skillnad i överlevnad och koncentrationen av celler minskade med mer än 7 log inom 40 minuter. Bifidobacterium animalis
subsp. lactis
var mer resistent upp till 40 minuter vid pH 2,0, men minskade sedan med cirka 3 log när de inkuberas under 120 minuter (Figur 4). Vid ett pH mellan 2,5 och 3,0 var minskningen mindre än 1 log efter 120 minuter. Figur 2 Syrabeständighet av tre Bifidobacterium longum stammar. X-axel: tid (min); Y-axel: pH; log cfu visas i färg (skala till höger om diagrammen). Siffror inom bakterie namnen är stammen nummer i FAM-databas av ALP.
Figur 3 syrabeständigheten hos Bifidobacterium dentium, B. longum subsp. infantis och B. adolescentis. X-axel: tid (min); Y-axel: pH; log cfu visas i färg (skala till höger om diagrammen). Siffror inom bakterie namnen är stammen nummer i FAM-databas av ALP.
Figur 4 syrabeständigheten hos Bifidobacterium breve och B. animalis subsp. lactis. X-axel: tid (min); Y-axel: pH; log cfu visas i färg (skala till höger om diagrammen). Siffror inom bakterie namnen är stammen nummer i FAM-databas av ALP.
Alla andra testade Bifidobacterium
stammar (B. longum, B. breve, B. longum
subsp. Infantis och B. adolescentis
) visade en liknande men olika mönster från B. animalis
subsp. lactis
(figurerna 2, 3 och 4). De hade en kort överlevnadstid under pH 2,5 och överlevde i större antal över pH 3,5.
I syfte att utveckla en metod för att simulera GI i bioreaktorn, var ett ytterligare test utförs med en stam. För att observera påverkan av en livsmedelsmatrisen, koncentrerad B. longum
subsp. infantis
återsuspenderades i skummjölk innan ympning i sura lösningar. Såsom visas i den högra kolumnen i fig 5, hade mjölk en direkt effekt på överlevnaden av stammen. Mellan pH 3,0 och 3,5 bakterierna överlevde under 120 minuter med en minskning av log 2. Under pH 3,0 överlevnaden minskade till ca log 5. Minskningen i överlevnad under pH 3,0 var snabb men regelbunden över tiden. Vid pH 3,5 och högre, stammen var resistent under minst 120 minuter. Figur 5 Jämförelse av syrabeständigheten hos Bifidobacterium longum subsp. infantis 14390 suspenderades i NaCl eller skummjölk. Vänster: bifidobakterier suspenderades i NaCl, höger: bifidobakterier suspenderades i mjölk. X-axel: tid (min); Y-axel: pH; log cfu visas i färg (skala till höger om diagrammen). Siffror inom bakterie namnen är stammen nummer i FAM-databas av ALP.
Vänstra kolumnen i figur 5 visar samma stam utan tillsatt skummjölk. Vid ett pH över 3,5, fanns det ingen inverkan på överlevnaden av bakterierna. Men under pH 3,5 överlevnad minskade beroende på längden av inkubationstiden. Mellan pH 3,0 och 3,5 stammen redan hade minskat med cirka log 5. Efter 30 min inkubation, det var nästan en linjär minskning i överlevnad med minskande pH från 3,0 till 2,5.
Simulering i bioreaktorn
De flesta system som beskrivs i litteraturen bestå av flera reaktionskärl, t.ex. den Shime [6]. Andra studier användes immobiliserade celler med tre reaktorer [25] eller ett dialyssystem [8]. Baserat på arbete Sumeri et al
. [9] och de insamlade uppgifterna om de regler som i tarmkanalen vi kunde begränsa simuleringen till ett fartyg. Tillsammans med data från syrabeständig screening, skulle valet av en eventuell utgångs-pH och buljong komposition i simulatorn väljas. De resulterande simulering parametrar visas i figur 1 och beskrivs i Material och Metoder. Under försöksstadiet för denna studie, Sumeri et al
. [9] utvecklade ett liknande system för att utvärdera Lactobacillus
sp. i en mage-tarm passagen simulering.
programpaket "Lucullus" var ett utmärkt verktyg för att kontrollera pH och förfarandet enligt den utvecklade simulering. Val av mediet i bioreaktorn förenklades genom att välja den motsvarande tillväxtmedium för stammarna, kompletterat med skummjölk, som fungerar som en simulerad livsmedelsmatrisen. Efteråt visade det surgjordes till utgångs pH och kompletterat med enzymlösningar, såsom beskrivs i Material och Metoder. Simuleringarna utfördes i serie, en per dag. Resultaten visas i figur 6. De stammar som används för simuleringen listas i tabell 3 (endast Bifidobacterium dentium
uteslöts) och standardiserades till en OD 650 1,5 före ympning. Figur 6 Utveckling av 7 Bifidobacterium stammar under magen-tarmkanalen simulering för 7 timmar. Streckad linje visar tiden för tillsats av gallsalter och pancreassaft. Siffror inom bakterie namnen är stammen nummer i FAM-databas av ALP.
Tabell 3 testade stammarna i simuleringen.
Namn
identifieringsnummer ALP stamsamling
Bifidobacterium adolescentis
FAM-14377
Bifidobacterium breve
FAM-14.398
Bifidobacterium longum
subsp. infantis
FAM-14390
Bifidobacterium animalis
subsp. Lactis
FAM-14403
Bifidobacterium dentium
FAM-14396
Bifidobacterium longum
FAM-14382, -14.383, -14.406
Lactobacillus gasseri
K7
FAM-14459
Bifidobacterium adolescentis
inokulerades såsom beskrivits ovan vid en initial koncentration av 10 7 cfu ml -1 och minskade nästan linjärt till under 10 4 cfu ml -1 efter 5 timmar. B. breve Mössor och B. longum
stammar hade en initial koncentration mellan 10 7 och 10 8 cfu ml -1 och minskat till under 10 2 cfu ml -1 inom de första 30 minuterna. B. animalis
subsp. lactis
14403 levt till cirka 15% av den ursprungliga genomsnittliga cfu av 5 x 10 8 cfu ml -1. Det var en snabb minskning i överlevnad av B. longum
subsp. infantis
över den första 30 min. Efteråt överlevnaden minskade endast långsamt från 10 5-10 4 cfu ml -1.
I ett senare skede, Lactobacillus gasseri
K7 ingick i studien, eftersom flera projekt igång vid denna tid på vårt institut med denna stam. Lactobacillus gasseri
K7 ympades vid 2,2 x 10 7 cfu ml -1 och efter 7 h simulering en koncentration av 10 5 cfu ml -1 levande celler fortfarande var närvarande i odlingsmedia (fig 7, kurva för 250 ml i förväg kultur). Den högsta minskningen i överlevnad var inom de första 2 timmarna och började omedelbart efter tillsatsen av magsaft och gallsalter. Inom denna tid fanns det en minskning av levande celler genom log 2. Under resten av tiden simulering, det var bara en log en minskning av levande celler. Figur 7 Jämförelse av påverkan av 100 ml pre-kultur av Lactobacillus gasseri K7 med 250 ml förkultur. Pre-kultur skördades genom centrifugering och återsuspenderades i fysiologisk natriumkloridlösning för att uppnå en OD600 på 1,5. Magen-tarmkanalen simulering inkuberades med den justerade lösningen och inkuberades under 7 timmar. Den streckade linjen visar tillsats av gallsalter och pancreassaft. Kurvor är medelvärdet av dubbla experiment.
Beredning av inokulum av L. gasseri
K7 i en 100 ml odlingsvolym utvärderades också. Resultaten av experimenten visas i Figur 7. Med 250 ml odling minskningen i levande celler var cirka log 2 medan minskningen med en 100 ml odling bara logga en över hela inkubationstiden. Men 2 h efter tillsats av gallsalter och bukspott, minskningen i cellantal var likartad för båda volymerna.
Diskussion
Vid skörd en kultur efter en viss inkubationstid, kan tillväxtfasen av varje bakteriestam vara annorlunda eftersom alla har olika tillväxtdynamiken. I syfte att erhålla celler vid ungefär samma tillväxtfasen, var preliminära experiment utfördes (data visas ej). En inkubationstid på 15 timmar för pre-kulturen var lämplig för alla testade stammar utom Bifidobacterium longum
subsp. infantis
som behövs för att vara inkuberas under endast 12 h.
syratolerans screening (figurerna 2, 3 och 4) utfördes för att utvärdera effekten av pH oberoende av andra tillstånd. Bifidobacterium dentium
var mycket känsliga för syra och därför skulle kanske inte överlever passagen genom magsäcken. Stammen har därför inte i simuleringsexperiment. B. longum
stammar (Figur 2) inte gav mycket bättre resultat än B. dentium
(Figur 3). Men nära pH 4 att de var mer motståndskraftiga än B. dentium
.
B. longum
subsp. infantis
är en av de första arterna för att befolka den mänskliga tarmen strax efter födseln [26]. Baserat på experimenten i denna studie, men den testade B. longum
subsp. infantis
stammen skulle bara kunna passera barnet magen i stora mängder, om övergångstiden i den sura magsäcken var mycket kort. Överlevnaden av den valda stammen i det testade miljö var för låg för framgångsrik passage i stora mängder. När stammen återsuspenderades i skummjölk, ökad överlevnad (figur 5). Detta kan vara en indikation på att bröstmjölk hjälper B. longum
subsp. infantis
stammar att passera magen-tarmen passage med vid en högre överlevnad.
De skyddande effekterna av mjölkproteiner i matsmältningssystemet har redan beskrivits i litteraturen [27]. Skydd med mjölkproteiner har också visats i denna studie (figur 5). Med lämplig matris eller till och med en bärare, kan probiotiska bakterier på ett säkert sätt passera genom magen till tarmarna för att nå sin verkningsplats.
B. adolescentis
stammar som befolkar den mänskliga tarmen vid en senare ålder, hade något högre motstånd än B. longum
subsp. infantis
vilket kan förklara minskningen av den senare under utvecklingen av den mänskliga spädbarn till vuxen ålder [26].
mest intressanta stammen var B. animalis
subsp. lactis
, som var den minst känsliga stammen i vår studie. Detta pH-resistent stam har en stor potential för användning i livsmedel som en probiotisk komplement eftersom ett större antal bakterieceller skulle överleva passagen. Men att använda denna stam som probiotiska, fler studier måste göras för att uppnå den probiotiska status enligt definitionen av Klaenhammer [3].
I vår studie var intag av en livsmedelsmatrisen simuleras i en initial miljö av syrad mjölk och tillväxtmedium. Den tillsatta simulerad gastric lösning och syre under magen fasen ökade stressen. Under den simulerade passagen till tunntarmen syret ersattes med kväve och mediet neutraliserades till pH 6,3. Tillsatsen av de pankreatiska lösnings- och gallsalter avslutade passagen in i tunntarmen. Detta in vitro
systemet inte tar hänsyn till att in vivo
matsmältning, enzymer aktiverade och inaktiverade och andra ämnen, t.ex. gallsalter återabsorberas. Sumeri et al
. [9] fann en partiell lösning för att kringgå detta problem. De utspädda innehållet i reaktorn med en speciellt utformad utspädningsmedium. En annan möjlighet skulle vara att fälla ut de gallsalter vid slutet av simuleringen av tunntarmen att imitera den enterohepatiska kretsen. Detta skulle kunna utföras med kalciumjoner [28-30]. Borttagning av gallsalter skulle bättre simulera miljön i tjocktarmen och kan även tillåta bifidobakterier att föröka sig.
I vår studie, de återstående gallsalter och bukspott i simuleringen lett till en ytterligare belastning på bakterier som förmodligen ändrat sanna egenskaper av stammarna in vivo
.
utgångs~~POS=TRUNC cfu i simuleringen varieras inom ett log cfu trots justering av OD 650 av ympen har tidigare testats med Bifidobacterium animalis
subsp. lactis Mössor och Bifidobacterium longum
subsp. infantis
stammar. De bifidobakterier användes i denna studie visade en tendens att bilda kluster som kan resultera i minskad cfu (visuella observationer, data visas ej). I en annan studie kunde bildningen av kluster vara relaterad till sjunkande pH under tillväxt [31]. Dessa kluster är vanligtvis räknas som en koloni på en plåt.
Figur 6 visar resultaten av magen-tarmen passagen simulering över 7 h av sju testade Bifidobacterium
stammar. Koncentrationen av levande celler av bifidobakterier sjönk omedelbart efter inkubation på grund av det låga pH (pH 3,0). Emellertid B. animalis
subsp. lactis
förblev stabil. Detta bekräftade resultaten från tidigare experiment som diskuterats ovan (Figur 4). Detta motstånd skulle kunna utvidgas till gallsalter och bukspott även om cellräkningar av B. animalis
subsp. lactis
minskade med ca 85% av det ursprungliga värdet (Figur 6). Jämfört med andra stammar som används i denna studie, men denna minskning var nästan försumbar. | Allt B. longum Mössor och B. breve
stammar dog mycket snabbt i början av simuleringen och var under detektions gränsen för beläggningsmetoden inom några timmar (figur 6) som var att förvänta från resultaten av screening experimentet ovan (fig 2 och 4).
Å andra sidan, B. longum
subsp. infantis
14390 minskade snabbt i början av simuleringen men efter tillsatsen av pankreassaft och gallsalter och en förändring till en anaerob miljö, minskade reduktionshastigheten. Vår studie visar att denna stam är väl anpassad till förhållandena i tarmen utan måste intas i stora mängder för att överleva villkoren i magen (syre, låg pH). Såsom nämnts ovan, B. longum
subsp. infantis
stammar hör till den första gruppen av bakterier befolka tarmen hos spädbarn [26].
I motsats till B. longum
subsp. infantis
, B. adolescentis
minskade nästan linjärt under 7 h simulering. Det fanns ingen detekterbar avbrott när villkoren i fermentorn ändrats. Baserat på de experiment för syratolerans screening, detta resultat var oväntat.
Men detta kan vara relaterade till testförhållanden där gallan salt och magsaft koncentrationer kvar på den ursprungliga nivån och inte den utspädning som de skulle vara i vivo
. I en framtida experiment bör det utvärderas huruvida utspädningsmetoden som utvecklats av Sumeri et al
. [9] skulle stabilisera cellräkningar av B. adolescentis
under 6 h simuleringsperiod i tarmen.
I vår studie utvärderade vi också magen-tarmen passage av Lactobacillus gasseri
K7. Stammen har redan utvärderats för överlevnad in vivo
hos smågrisar [14]. Därför var det möjligt att jämföra våra in vitro
resultat med data från in vivo
experiment.
BOGOVIĆ et al
. [14] matas smågrisar under en period av 14 dagar med 5 * 10 10 cfu dag -1 L. gasseri
K7. Detta resulterade i ca. 7 * 10 4 cfu g -1 i avföringen under utfodringsperioden. Det måste tas hänsyn till att koncentrationen av bakterier späddes innan den slutligen anlände till magen tarmkanalen. I en grov approximation, uppskattade vi att ca 1% kom fram till passagen. Detta tillät oss att jämföra resultaten av denna smågris studie med slutet av vår simulering.
Som visas i figur 5, L. gasseri
K7 hade en cellkoncentration av cirka 5 * 10 4 cfu ml -1 efter simulering perioden 7 timmar (med en förodling av 250 ml) som liknar koncentrationen i faeces hos smågrisar. Detta tyder på att simuleringsmodellen som används i denna studie skulle kunna vara ett användbart verktyg för att uppskatta effekterna av passagen i en in vitro
modell före användning av dyr in vivo
modeller. Modellen skulle kunna optimeras ytterligare genom att späda gallsalter och bukspott som beskrivits av Sumeri et al
. [9]. För att simulera aktivering och avaktivering av enzymer en lämplig metod har ännu inte hittats.
När endast 100 ml medium användes för ympning av L. gasseri
K7, kulturen överlevde simuleringen bättre (Figur 7). Båda volymer hade en liknande initial celltal. Båda volymerna ympades med 1 ml. Därför, kulturen med 250 ml volym var i ett tidigare stadium av tillväxt än 100 ml odling. Dessa resultat var en indikation på tillväxtfas beroende av kultur under stress.
Slutsats
I denna studie kunde vi visa att systemet för att simulera magen-tarmkanalen som utvecklats av Sumeri et al
. [9] var lämplig för bedömningen av överlevnad 8 Bifidobacterium
stammar och Lactobacillus gasseri
K7 även om vi inte simulera avlägsnandet av magsaft och gallsalter. För L. gasseri
K7 kunde vi jämföra resultaten med en in-vivo
studie på smågrisar och fick liknande resultat.
Enda reaktorsystemet som presenteras här ger en enklare identifiering av den ideala tillväxtfasen för eventuella probiotiska stam som krävs för att passera magen-tarmkanalen än om det måste utföras med andra system med en svår installation.
studien visade också att alla testade Bifidobacterium
stammar, med undantag för B. animalis
subsp. lactis
skulle kräva skyddande medel för att överleva passagen genom magsäcken-tarmen i stora mängder. Detta skulle kunna göras med hjälp av en lämplig matris mat eller inkapsling av cellerna.
Metoder
Bakteriestammar
Alla stammar bifidobakterier selekterades från stammen samlingen av Agroscope Liebefeld-Posieux ALP Research Station Schweiz, isolerades genom ALP från humana källor. Lactobacillus gasseri
K7 härstammar från ZIM Collection of Industrial Mikroorganismer från University of Ljubljana, biotekniska fakulteten (ZIM 105) [10] och även deponeras i ALP stamsamling. De testade stammar och deras identifikationsnummer ALP stamsamling listas i tabell 3. Alla stammar bifidobakterier tillhör ALP.
Media och tillväxtbetingelser Idéer för pre-kulturer, 1 ml frysta bevarar av stammarna var ympades i 250 ml Wilkins-Chalgren buljong (WC CM0643, Oxoid, Hampshire, UK) kompletterat med 9 gl -1 ytterligare laktosmonohydrat (bifidobakterier) eller De Man-Rogosa-Sharpe (MRS, Biolife, Milano, Italien) medium (Lactobacillus gasseri
K7) [32]. För L
. gasseri K7, ett försök med en 100 ml förodling utfördes också. Alla stammar, utom Bifidobacterium longum
subsp. infantis
, inkuberades vid 37 ° C under 15 timmar under anaeroba betingelser. Bifidobacterium longum
subsp. infantis
inkuberades under 12 timmar eftersom det var mycket känslig för utökade inkubationsperioder. De pre-kulturer centrifugerades under 15 min vid 3500 rpm och pellet återsuspenderades i 10 ml fosfatbuffrad fysiologisk koksaltlösning (PBS).
Bestämning av cellantalet
celltalet bestämdes genom 10-faldig serieutspädning av odlingen i fysiologisk saltlösning. De två högsta utspädningar ströks sedan på MRS-agar (Biolife, Milano, Italien) med en spiral plater (IUL Instruments, Barcelona, ​​Spanien) och utvärderas av en automatiserad koloniräknare med motsvarande programvara (IUL Instruments, Barcelona, ​​Spanien).
screening för syrabeständighet Hus till syraresistensen screening den koncentrerade cellsuspensionen från pre-kultur pipetterades i 20 ml PBS tills en OD 650 av 1,0 uppnåddes. 4 ml av denna cellsuspension ympades därefter i 16 ml citrat-HCl-buffert (tri-Na-Citratex2 H 2O 7,35 g och 250 ml destillerat H 2O, anpassad till motsvarande pH med 1 M HCI) vid pH av 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 och 4,0. Inkubationen utfördes vid 37 ° C och prover togs var 30 min under 120 min. 1 ml av prov blandades med 9 ml 0,25 M fosfatbuffert vid pH 7,0 vid det första steget av spädningsserie. För syrabeständighetstest i en livsmedelsmatris, samma mängd av pre-kulturen som användes ovan (justerad till en OD 650 av 1,0) pipetterades in i 20 ml av UHT skummjölk. 4 ml av denna cellsuspension i mjölk inokulerades i 16 ml citrat-HCl-buffert. Alla kemikalier inköptes från Merck (Darmstadt, Tyskland). Uppgifterna för screening experiment visualiseras i konturdiagram med hjälp av Sigmaplot 11,0 programvara (Systat Software Inc., Chicago, IL, USA).
Simulering i bioreaktorn
Alla lösningar var nyberedda för varje experiment. Simulerad mage lösning gjordes av 50 mg pepsin porcin magslemhinna (Sigma-Aldrich P7012, Buchs, Schweiz) i 20 ml av 0,1 M HCl. För den simulerade bukspott 2 g pankreatin (Sigma-Aldrich P7545) löstes i 50 ml 0,02 M fosfatbuffert vid ett pH av 7,5. Simulerad gallsalt lösning tillverkades av 7,5 g bovint galla (Sigma-Aldrich B3883) späds till 50 ml med destillerat H 2O. Buljongen för simuleringen var antingen en l WC eller MRS-buljong med 29,41 g tri-natrium citratex2 H 2O. Under testning av överlevnad i en livsmedelsmatris, 500 ml UHT skummjölk tillsattes och pH justerades till 3,0 med 5 M HCl kort före simuleringen. 1 l-medium tillsattes till bioreaktom (NewMBR Mini, NewMBR, Schweiz), som i förväg steriliserats med vatten (121 ° C, 20 min), och upphettades till 37 ° C. Under magen simulering, var luftning genomförs. Fermentationen kontrollerades och registrerades med hjälp av den integrerade processhantering Lucullus (Biospectra, Schlieren, Schweiz). Den koncentrerade cellsuspensionen från pre-kultur pipetterades i 40 ml PBS till en OD 650 av 1,5. Kort före inokulering av 40 ml cellsuspension tillsattes 20 ml av det simulerade magen lösning till mediet (1 l) i bioreaktorn.

• Riskbedömning av magcancer i samband med asbestos: en fallrapport
• Bakteriedödande verksamhet katjoniska steroiden CSA-13 och cathelicidin peptiden LL-37 mot Helicobacter pylori i simulerad magsaft