Förändringar av E-cadherin och β-catenin i magcancer

Förändringar av E-cadherin och β-catenin i magcancer Bild Sammanfattning
Bakgrund
E-cadherin-catenin komplex spelar en avgörande roll i epitelceller-cell adhesion och i upprätthållandet av vävnadsarkitektur. Störning i uttrycket eller funktionen av denna komplexa resulterar i förlust av inter adhesion, med eventuell åtföljande celltransformation och tumörprogression.
Metoder
Vi studerade de förändringar av E-cadherin och β-catenin i en uppsättning av 50 primära gastric tumörer med hjälp av förlust av heterozygositet (LOH) analys genmutation screening, detektion av avvikande transkript och immunohistokemi (IHC).
Resultat Review, en hög frekvens (75%) av LOH upptäcktes vid 16q22.1 innehåller E -cadherin locus. Tre fall (6%) visade identiska missense-mutation, A592T. Denna mutation är inte troligt att starkt bidra till karcinogenes av gastrisk cancer, eftersom en låg frekvens (1,6%) av denna mutation konstaterades också i 187 normala individer. Vi upptäckte också en låg frekvens (0,36%, 0%) av denna mutation i 280 brösttumörer och 444 andra tumörer, inklusive kolon och rektum, lunga, endometrium, äggstock, testikel, njure, sköldkörtel karcinom och sarkom, respektive. Vi analyserade också de avvikande E-cadherin mRNA i mag tumörer och funnit att 7 tumörer (18%) hade avvikande mRNA utöver det normala mRNA. Dessa avvikande mRNA kan ge onormala E-cadherin molekyler, vilket resulterar i en svag cell-cell-adhesion och invasiva beteende karcinomceller. Reducerat uttryck av E-cadherin och β-catenin identifierades vid frekvensen för 42% och 28%, respektive. Speciellt, 11 tumörer (22%) uppvisade positiv cytoplasmatisk färgning för β-catenin IHC. Ett samband sågs mellan minskat uttryck av E-cadherin och β-catenin. Dessutom har en association detekterades mellan minskat uttryck av E-cadherin och diffus histotype.
Slutsats
Våra resultat stödjer hypotesen att förändringar av E-cadherin och β-catenin spelar en roll i initiering och progression av magcancer .
bakgrund
E-cadherin (120 kDa, kromosom 16Q) är en klassisk cadherin och utgör nyckeln funktionella komponenten av vidhäftnings korsningar mellan epitelceller [1]. Den är bunden via en serie underbeläggningsproteiner, de catenins (α, P- och y) och aktin cytoskelettet [1]. Denna koppling mellan transmembranous cadheriner och aktinfilament av cytoskelettet är nödvändig för att bilda en stark cell-celladhesion. En intakt E-cadherin - catenin-komplexet krävs för bibehållande av normal intercellulär adhesion. Mot bakgrund av detta har flera grupper föreslagit att i karcinom, E-cadherin funktioner som en invasion suppressor molekyl så att dess förlust medger eller förbättrar invasionen av angränsande normala vävnader. Immunhistokemiska studier i humana cancerformer, inklusive magcancer, har ofta visat att en del av invasiva karcinom och karcinom in situ
visar avvikande halter av E-cadherin och /eller catenin uttryck i jämförelse med deras närstående normal vävnad [2-4] . I allmänhet är E-cadherin och catenin färgning stark i väl differentierade cancer som upprätthåller deras cellvidhäftningsförmåga och är mindre invasiva, men minskar i dåligt differentierade tumörer som har förlorat sin cell-celladhesion och uppvisar stark invasiva beteende [2, 3].
E-cadherin är involverad i kontaktinhibition av celltillväxt genom att inducera cellcykelstopp [5]. Den har förmågan att inhibera cellproliferation genom uppregleringen av p27 involverade i cellcykelreglering [5], även om den mekanism med vilken E-cadherin reglerar p27 är fortfarande oklart. Därför E-cadherin, beskrivs allmänt som en invasion suppressor [6], kan fungera som en viktig tillväxt /spridning ljuddämparen. Review, en viktig funktion av β-catenin i cellsignalering har klarlagts [7]. I avsaknad av en mitotisk signal från utanför cellen, är β-catenin bundet i ett komplex med adenomatös polypos coli (APC) genprodukt, en serin treonin glykogen syntetas kinas (GSK-3β) och en adapter protein axin (eller en homolog conductin), som möjliggör fosforylering och nedbrytning av fri β-catenin av ubiquitin-proteasom-systemet [8]. När en mitotisk signal levereras av Wnt väg, genom association av Wg /Wnt familj av utsöndrade glykoproteiner och deras membranreceptor krulliga, leder det till aktivering av ovårdade (Dsh) protein, som rekryteras till cellmembranet. Den aktiverade Dsh nedreglerar proteinkomplexet, så att det inte längre kan fosforylera β-catenin, som då inte försämras. Frigörandet av β-catenin från fosforylering och nedbrytning komplexa främjar β-catenin stabilisering och signalering. Detta resulterar i en ökning av fri cystolic β-catenin som translokerar till kärnan och direkt binder transkriptionsfaktorer Lef och TCF, vilket leder till aktivering av genexpression. Därför β-catenin utför olika funktioner i E-cadherin-medierad cell-cell-adhesion och i Wnt signalering [8].
Förlust av E-cadherin-locus på den långa armen av kromosom 16 (16q22) förekommer i magsäcken (24 %), hepatocellulära (50%), lobulär bröst (50-100%) och esofagala (66%) karcinom [4, 9-12]. Det har förekommit flera rapporter om E-cadherin genmutationer i humana cancerformer [13]. I dåligt differentierade tumörer, såsom lobulär bröstcancer och diffundera-typ magcancer, E-cadherin-mutationer spelar en viktig roll i tumörutveckling [14, 15]. Flera studier har rapporterat nedärvda mutationer i E-cadherin genen i familjer med en ärftlig diffus typ av magcancer [16, 17]. Endast en minoritet av magcancer kan förklaras av E-cadherin mutationer. Frekventa somatiska mutationer av β-catenin-genen har hittats i små kolorektala adenom och intestinal typ magcancer [18, 19]. De flesta av mutationerna involverade förlusten av seriner eller treoniner från GSK-3β fosforylering region. Genetiska förändringar i β-catenin avskaffa cell-cell-vidhäftning har observerats i två gastriska cancercellinjer, HSC39 och 40A; båda härrör från samma signetring cellkarcinom i magen och visar en diffus tillväxtmönster [20, 21]. Denna mutation resulterar i en stympad β-catenin som saknar regionen för interaktion med β-catenin. Transfektion av dessa cellinjer med vildtyp β-catenin åter cellulär vidhäftning [21].
Här utförde vi E-cadherin och beta-catenin genmutation och expressionsanalys i en serie av 50 primära gastriska tumörer för att förstå bättre medverkan av de förändringar av E-cadherin och β-catenin i karcinogenes av magcancer.
Material och metoder
prover sälja ingår i studien var 50 tumörer och motsvarande normala prover, varav två tumörer (17 och 23) var från samma familj, resten sporadiska (tabell 1). Dessa fall diagnostiserades vid avdelningen för patologi, Universitetssjukhuset i Island. Vävnad erhölls nyligen på dagen för kirurgi eller från paraffininbäddade material. Information om tumörstadium, histotype och kvalitet förvärvades även från samma avdelning. DNA för PCR isolerades genom proteinas K-behandling [22]. RNA för RT-PCR extraherades med hjälp av Tri Reagent (Molecular Research Center, INC. USA). För A592T-mutationen, skärmad vi 187 normala individer, 280 bröst och 444 andra patienter med tjocktarmen och ändtarmen, lunga, livmoderslemhinnan, äggstockar, testiklar, njure, sköldkörtel karcinom och sarkom cancer. Alla individuella identifierare avlägsnades från kontrollproverna före analys och utredare har således blinda för identifiering av prover som inte längre kan spåras till specifika individer. Samtycke förmodades för patientprover. För fall 294 och 728 med A592T-mutation analyserade vi deras stamtavlor och fann att det inte fanns några andra cancerfall i stamtavla fall 294, men det fanns andra 5 cancerfall i stamtavla fall 728, varav 2 prostatacancer, en hud cancer, en lungcancer och en cancer i oklar origin.Table 1 Sammanfattning av förändringar av E-cadherin och β-catenin i en serie av 50 gastriska tumörer.
Tumour

Stage

Type

Grade

LOH

E-cad genmutationer
avvikande mRNA
E-cad
β-cat
Sample
vid
vid vid 16q22.1 Köpa och polymorfism
E-cad
IHC
IHC

1
T3N3
diff
+
IVS1+6T→C
-
+/-
++/-∇
3
T3N1
squ
G1
+
IVS4+10C→G
ND
-
+/-
17
T3N1
diff
ND
GTG (Val) → GTC (Val) vid cd832
ND -
-
23
träffade
+
GCC (Ala) → ACC (Thr ) på cd592 *
ND
+++ /-
+++ /-
43
T3N2
diff
+ -
-
-
+++ /-
50
T3N1
diff
-
IVS1+6T→C
-
++/-
++/-
165
T3N1
int
G3
ND
-
-
+++/-
+++/-∇
174
T3N2
int
G3
-
-
ND
+++/-
++/-
193
T3N2
int
G3
+
-
ND
-/+++
-/++
200
T3N1
int
G2
-
IVS4+10C→G
-
++/-
+++/-
231
T3N0
mi
G3
+
-
-
++/-
++/-∇
283
T3N0
int
G3
ND
-
ND
++/-
++/-
287
T3N1
int
G2
+
-
-
-/+
++/-
294
T3N1M1
mi
G4
+
GCC(Ala)→ACC(Thr) på cd592♦
-
++/-
++/-∇
304
T3N3
int
G2
-
-
-
-/+++
+/-
308
T3N1
int
G2
+
-
-
+++/-
++/-
314
T3N1
diff
-
CAC (His) → CAT (His) vid cd632 -
+++ /-
++ /- ∇
GGC (Gly) → GGT (Gly) på cd865
360
T2N1
int
G3
+
IVS4 + 10C → G
+ ♣
++ /-
+/-
369
träffade
+
-
+♣
+++/-
++/-
433
T3N1
mi
G3
-
IVS4+10C→G
-
-/++
-/+
435
T2N0
int
G3
+
-
-
-/+++
-/++
443
T2N0
int
G4
-
-
-
+++/-
+++/-
451
T4N0
int
G2
ND
-
ND
+++/-
++/-
474
T3N1
int
G3
ND
-
ND
-
+/-
493
T3N1
int
G3
+
-
-
-/+++
+/-
503
T3N1
int
G3
ND
-
-
-
+++/-
556
T3N2
int
G2
-
IVS1+6T→C
ND
++/-
+/-
5'UTR-71C → G
568
T3N2
mi
G3
+
-
+♣
++/-
++/-
612
T3N0
int
G2
ND
IVS4+10C→G
-
+++/-
+/-
AAC (Asn) → AAT (Asn) vid cd751
636
T3N1
diff
+
IVS4+10C→G
ND
+++/-
+++/-∇
650
T2N0M1
int
G2
+
-
ND
-/+
++/-
675
T2N0
mi
G3
+
IVS4+10C→G
-
+/-
++/-∇
676
T3N1
int
G2
+
-
-
+++/-
-∇
680
T3N1
mi
G3
+
IVS1+6T→C
-
++/-
++/-
AAC (Asn) → AAT (Asn) vid cd751
694
T3N1
int
G1
+
-
-
+++/-
+++/-
717
T3N1
int
G3
+
-
+♣
-/+++
+++/-
726
T2N1
int
G2
+
IVS4+10C→G
-
-/+++
++/-
728
T3N0
int
G2
+
GCC(Ala)→ACC(Thr) på cd592♦
-
-/+++
++/-
729
T3N1
int
G1
-
IVS1+6T→C
-
-/+++
+++/-
732
T2N1
int
G3
+
-
-
-/+++
+++/-
735
T4N3
diff
ND
AAC (Asn) → AAT (Asn) vid cd751 -
+++ /-
+++ /- ∇
738
T3N2
diff
+ -
- -
-∇
750
möttes
ND
AAC (Asn) → AAT (Asn) vid cd751
+♣
++/-
+++/-
755
T2N1
int
G2
ND
-
+♥
+++/-
++/-
808
T3N0
int
G1
+
ACG(Thr)→ACA(Thr) på cd251
+♠
+++/-
++/-
811
T2N1
int
G2
+
-
-
+++/-
-/+
832
T3N2
int
G2
+
-
-
+++/-
+++/-∇
855
T3N2
int
G2
+
-
-
+++/-
+++/-
875
T3N2
int
G2
-
IVS4+10C→G
ND
+++/-
+++/-
904
T2N0
int
G3
+
IVS4+10C→G
-
-/+++
++/-
Useful
30
3
7
21
14
Totalt
40
50
38
50
50
%
75
6
18
42
28
T, tumör (storlek och invasions); N, nod (grad av metastaser); M, metastas; G1, väl differentierade; G2, måttligt differentierade; G3, dåligt differentierade; G4, inte differentierade; diff, diffus (grad av differentiering = G4); mi, blandad; int, tarm; uppfyllda, metastatisk tumör troligen från magen tumör; squ, skvamöst epitel; LOH, förlust av heterozygositet; E-cad, E-cadherin; β-katt, β-catenin; IHC, immunohistokemi; cd, kodon; UTR, otranslaterade regionen; +, Positiv LOH, avvikande E-cad-mRNA, E-cad och β-cat IHC, - negativ LOH, E-cadherin genmutation, avvikande E-cad-mRNA, E-cad och β-cat IHC; ND, ej bestämd eller inte gjort; +/-, ++ /- Och +++ /- mer än 50% av cellerna positiva; - /+ - /++ Och - /+++, mer än 50% av cellerna negativ; *, Somatisk mutation; ♦, arvslinje mutation; ♣, insättning av intron 7 mellan exoner 7 och 8, stoppkodon 374; ♥, radering av sista 72 baser i exon 7, exon 8 och första 124 baser i exon 9, stoppkodon 322; ♠, deletion av exonerna 8 och 9; radering av sista 84 baser i exon 8, stoppkodon 358; ∇, dessa prover visade också cytoplasmisk färgning för β-catenin IHC
LOH bestämning
mikrosatellitmarkörer som används för LOH analys av kromosom 16Q var. D16S503, D16S496, D16S421, D16S545 och D16S512 för regionen 16q22.1 innehåller E -cadherin locus (Genome Database). Polymeraskedjereaktionen (PCR) produkterna separerades i en akrylamid sekvenseringsgel och överförs till ett positivt laddat nylonmembran, Hybond-N + (Amersham, Aylesbury, UK) och bakades under åtminstone 2 h vid 80 ° C. Den icke radioaktiva detektionsmetod som används för att visualisera PCR-produkterna har beskrivits tidigare [23]. Autoradiogram inspekterades visuellt med minst två granskare, att jämföra intensiteten av alleler från normala och tumör-DNA. Frånvaron eller en signifikant minskning av en allel i tumören jämfört med den normala referensprov ansågs som LOH.
Mutation screening
Alla 16 exoner av E-cadherin-genen och exon 3 av β-catenin genen screenades för inaktive mutationer med PCR-SSCP (enkelsträngkonforma polymorfism) analys av genomiska DNA-mallar. Primrarna för E-cadherin och β-catenin som används i SSCP-analys har beskrivits i vår tidigare artikel [4] och Park et al. [1999], respektive, och beställs från Pharmacia Biotech eller TAG Copenhagen A /S. Genomiskt DNA användes vid 30 ng per 25 ^ il reaktionsblandning innehållande 5 pmol av framåt och bakåt primrar, 2,5 nmol av varje dNTP, 0,5 enheter DynaZyme polymeras. Proven amplifierades under 35 cykler bestående av 30 s av denaturering vid 94 ° C, 30 s hybridisering vid 55-70 ° C, och slutligen 60 ar av förlängning vid 72 ° C. En varmstart användes genom tillsättning av enzymet i första cykeln vid runt 70 ° C, efter en förinkubation tid av 5 min vid 94 ° C. En 4 pl alikvot av PCR-produkter blandades med 7 pl av formamid färgämne (95% formamid, 0,05% bromfenolblått och 0,05% xylencyanol), denaturerades vid 94 ° C under 10 min och snapcooled på is. Alikvoter av 2 ^ il analyserades samtidigt på två icke-denaturerande polyakrylamidgeler (5% akrylamid med 2% tvärbindning), antingen innehållande 5% glycerol eller saknar glycerol. Elektrofores utfördes i 1 x TBE på vertikala geler vid 6w över natten eller i 6 h vid rumstemperatur. PCR-produkterna visualiserades såsom de mikrosatellitmarkörer. Prover med onormala rörlighets band amplifierades igen för 35 cykler såsom beskrivits ovan. En 5 pl alikvot av PCR-produkter inkuberades sedan med 10 U exonulease I och 2 U räkor alkaliskt fosfatas för att avlägsna alltför primers och dNTP (US70995, Amersham). Sekvenser av båda strängarna bestämdes genom termo Sequenase DNA-polymeras (Thermo Sequenase Radiomärkt Terminator Cycle Sequencing Kit, Amersham) med de två ursprungliga PCR-primers. Vi utförde A592T mutation analysen på dessa cancerformer, med undantag för cancer i oklart ursprung, i familjen av fallet 728 med användning av direkt sekvensering.
Aberrant mRNA screening
1-5 ^ g av totalt RNA omvänt transkriberas till cDNA med användning av första sträng-cDNA-synteskit (Amersham Pharmacia Biotech). undersökt alla prover för E-cadherin-cDNA deletioner och insättningar. E-cadherin-cDNA amplifierades med användning av primerpar EX7-REX10 /2 och EX9 /2a-rEx11 för regionen av exoner 7-10 kodar kalciumbindningsställen [24]. PCR-produkter visualiserades med hjälp av agarosgelelektrofores. Onormala fragment skars och sekvenserades med användning framåt och bakåt primers för att bestämma gränserna för de strykningar och insättningar. Här har vi använt BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Foster City, CA) och automatiserad sekvense ABI PRISM ™ 3100 (Perkin-Elmer) för sekvensering
Immunohistokemisk färgning
Immunohistokemi för E-cadherin och β P-katenin utfördes på 5

Förändringar av E-cadherin och β-catenin i magcancer

undersökningar

undersökningar

Other Languages