Den distinkta magsaft proteomet i magcancer avslöjar en fler biomarkör diagnostisk profile

Den distinkta magsaft proteomet i magcancer avslöjar en fler biomarkör diagnostiska profil Bild Sammanfattning
Bakgrund
Totalt magsäckscancer överlevnad fortfarande dålig främst eftersom det finns inga tillförlitliga metoder för att identifiera mycket botas skede av sjukdomen tidigt. Multi-protein profilering av magsaft, som erhållits från den anatomiska platsen för patologi, kunde avslöja diagnostiska proteomik fingeravtryck.
Metoder
Proteinprofiler genererades från magsaft prover av 19 magcancer och 36 benigna gastritides patienter som genomgår elektiv, kliniskt -indicated gastroskopi med användning ytförstärkt laserdesorption /jonisering time-of-flight-masspektrometri på flera Protein arrayer. Proteomik egenskaper jämfördes genom signifikans analys av microarray algoritm och två-vägs hierarkisk klustring. En andra förblindade prov set (24 gastric cancer och 29 kliniskt godartade gastritides) användes för validering.
Resultat Musik av betydelse analysyis av microarray, 60 proteomik funktioner var upp-reglerade och 46 var nedregleras i magcancer prover (p Hotel < 0,01). Multimarker klustring visade två distinkta proteomik profiler oberoende av ålder och etnicitet. Arton av 19 cancerprov klustrade tillsammans (känslighet 95%), medan 27/36 av icke-cancerprov klustrade i en andra grupp. Nio icke-cancerprov som klustrade med cancerprov ingår 5 premaligna lesioner (1 adenomatös polyp och 4 intestinal metaplasi). Validering med användning av ett andra prov uppsättning visade känsligheten och specificiteten för att vara 88% och 93%, respektive. Positiva prediktiva värdet av de kombinerade data var 0,80. Utvald peptid sekvensering identifierade pepsinogen C och pepsin A aktiveringspeptiden som betydligt nedregleras och alfa-defensin som avsevärt uppreglerat.
Slutsats
Denna enkla och reproducerbara multimarker proteomik analys skulle kunna komplettera den kliniska gastroskopi utvärdering av symptomatiska patienter för att förbättra diagnostisk noggrannhet för magcancer och premaligna lesioner.
bakgrund
till skillnad från andra vanliga cancerformer, är prognosen för de flesta patienter med ventrikelcancer fattiga och har förbättrats mycket under senaste decennierna. Fem-årsöverlevnaden för magcancer är betydligt lägre än alla stora cancer utom cancer i levern, bukspottkörteln och matstrupe [1]. Med tanke på att cancer tidigt gastric har en mycket bättre prognos (5-års överlevnad ungefär 90%) än avancerad magsäckscancer (5-års överlevnad 3-10%) [2, 3], global dödlighet i magcancer borde minska avsevärt genom åtgärder som resulterar i downstaging av tumörer vid tidpunkten för diagnos.
Även gastroskopi är den gyllene standarden för magcancer diagnos, är dess riktighet inte så högt som det är för godartade gastric sjukdomar såsom magsår, särskilt i geografiska områden låg till mellanmagsäckscancer förekomst. Procentandelen missade cancerdiagnos, redovisas som 4,6%, 14% och till och med 33% [4-6], är inte obetydlig. Även i Japan, var andelen falskt negativa resultat rapporterats vara 19% [7]. Dessa data överensstämmer med det positiva prediktiva värdet av endast 0,4-0,7 för endoskopisk diagnos av magcancer i olika centra [8-10]. Även om andelen missade diagnoser förefaller liten, det absoluta antalet patienter nekas till förmån för diagnos vid en botas skede är inte försumbar. Även vid en måttligt låg falskt positivt diagnostisk hastighet av 5%, skulle mer än 47.000 gastric cancer har missat i en låg prevalens ensam land (USA) under ett enda år, 2000 [11]. Endoskopisk Utvärderingen omfattar ofta slemhinnor biopsier men det finns inga kliniska normer för antingen det optimala antalet biopsier eller anatomiska områden som ska provtas. Ett vanligt citerade rekommendation är att ta minst sju biopsier att korrekt diagnostisera magcancer [12]. I denna studie var dock helt 17% av alla skador senare visat sig vara elakartade anses godartade på endoskopi. Sålunda lider endoskopisk mucosal undersökning från inter-observatör variation suboptimal korrelation med histopatologi, svårigheter att upptäcka submukosala cancer och obehindrad visualisering av alla anatomiska delregioner t.ex. . Efter tidigare magoperationer [13, 14]
magsaft består av en blandning av utsöndrade lösliga och exfolierad cellulära proteiner från hela magslemhinnan - inklusive regioner som inte kan bedömas av fiberoptiska gastroskopi. Vi resone därför att proteomik profil magsaft, brukar betraktas som ett slöseri biprodukt vid gastroskopiundersökning, kan med fördel komplettera konventionell klinisk utvärdering genom att tillhandahålla en "molekylär biopsi" som effektivt samplar hela magslemhinnan, särskilt som tekniker protein upptäckt sådana som masspektrometri kan vara mycket känslig. Om det utförs under loppet av kliniskt indicerat gastroskopi, få magsaft inte ökar invasivitet av förfarandet. Till skillnad från plasma proteomet, kommer sannolikt att vara mindre komplicerad men anrikad på sjukdomsspecifika biomarkörer, alstras direkt på sjukdomsstället magsaften proteom. Samma biomarkörer, även om den finns i plasma, kan spädas utanför gränserna för detektering och blandas med andra rikligare system proteiner som återspeglar samtidiga patofysiologiska förhållanden (t.ex. komorbida sjukdomar), snarare än anatomisk platsspecifik sjukdom.
vi har undersökt en ny metod för att utveckla biomarkörer för magcancer genom att profilera lösliga utsöndrade peptider närvarande i endoskopiskt aspire magsaft och proteiner extraherades från exfolierad epitelceller, också återvunnits under endoskopi genom ytförstärkt laserdesorption-jonisering time-of-flight (SELDI TOF) masspektrometri. Våra resultat tyder på att flera protein biomarkörer från en organspecifik källa dvs magsaft, generera en distinkt magcancer signatur som förtjänar ytterligare utveckling som ett verktyg för att förbättra den diagnostiska träffsäkerheten av gastroskopi och har potential för att upptäcka tidigt stadium magsäckscancer och premaligna lesioner (intestinal metaplasi och dysplasi).
metoder
kliniska prover
magsaft erhölls under gastroskopi av natten fastade patienter som ses på Singapore General Hospital. Studieprotokollet godkändes av den etiska kommittén i Singapore General Hospital. och överensstämde med bestämmelserna i Helsingforsdeklarationen 1995. Indikationer gastroskopi var enbart kliniska och var oberoende av studien. Initial analys utfördes på en träningsuppsättning av 19 prover från histologiskt verifierad gastric adenokarcinom (13 intestinal typ, 4 diffus typ, en blandad typ, en obestämd) [15] och 36 prover från patienter med kliniskt godartade gastric förhållanden. Medelåldern för 19 gastric cancerpatienter (13 manliga, sex kvinnor, 17 kinesiska, två indiska) var 68 år. Fördelning av amerikanska kommittén för cancer (AJCC) klinisk staging var etapp 0 (1 patient), steg I (4 patienter), etapp II (2 patienter), stadium III (2 patienter) och steg IV (10 patienter). Medelåldern för 36 patienter med godartade magsår förhållanden (19 manliga, 17 kvinnliga, 33 kinesiska, 2 Malay, en indisk) var 57 år. Kliniska diagnoser efter endoskopi av patienterna icke-cancer var normala (9), antral gastrit (9), gastrit (6), magsår (4), diafragmabråck (3), hyperplastiska polyper (2), Barretts esofagus (1), fundic ärr (1) och adenomatös polyp (1).
klassificering algoritm som utvecklats från träningsmängden testades genom blindad analys av en valideringsuppsättning bestående av en annan 24 bekräftade histologiskt gastric adenokarcinom (10 intestinal typ, 7 diffus typ, en blandad typ, fem obestämd, en neuroendokrin) och 29 kliniskt godartade gastric prover. Medelåldern för dessa 24 patienter med ventrikelcancer (18 hanar, 6 honor, 21 kinesiska, 3 Malay) var 70 år. Fördelning av AJCC klinisk staging var steg I (5 patienter), etapp II (4 patienter), stadium III (2 patienter) och steg IV (12 patienter). En patient i validerings set sjönk ytterligare utredning och kunde inte hållas. Medelåldern för 29 icke-cancerpatienter (11 män, 18 kvinnor, 26 kinesiska, två indiska, ett Malay) var 47 år. Kliniska diagnoser efter gastroskopi av patienterna icke-cancer var gastrit (14), fundic körtel polyper (2), akut magsår (2), duodenit (2), diafragmabråck (1) och normala (8).
Ingen av mag cancerpatienter hade fått någon form av cancerbehandling vid gastroskopi.
med utbildning och validerings fall tillsammans, 19% (8/43) och 29% (19/65) av patienterna med magsäckscancer och godartade magsår förhållanden, respektive, var positiv för H. pylori
, en skillnad som inte var signifikant av Fishers exakta test (två-sidig p
värde = 0,4508).
Provtagning och bearbetning
magsaft var aspireras in i en steril behållare vid påbörjandet av endoskopi, tilldelas en avidentifierad kod och placerades omedelbart på is. Blod- eller galla-färgade prover avvisades. Endast kliniskt misstänkta slemhinneskada ades biopsier efter bedömning av endoscopist. Magsaft centrifugerades vid 180 g under 6 minuter vid 4 ° C, från vilken den överstående vätskan centrifugerades igen vid 16 100 g under 30 minuter vid 4 ° C. Pellets från båda centrifuge kombinerades. Höghastighets supernatanter lagrades separat från pellets vid -80 ° C.
Protein profilering
Efter upptining var 10 pl av varje magsaft prov appliceras på olika kemiska ytor av Protein matriser (Ciphergen Biosystems Inc, Kalifornien , USA): (a) koppar (II) Immobilized Metal Affinity Capture (IMAC3) i närvaro av 100 pl av 1 mol /L urea, 1 g /L 3 - [(3-cholamidopropyl) dimetylammonio] -1-propansulfonat ( CHAPS), 0,3 mol /l KCl, proteashämmare cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland), 50 mol /L TrisHCl, pH 7,5; (B) Svagt Cation Exchange (WCX2 och CM10) i närvaro av 100 pl av 50 mmol /L natriumacetat, 1 g /L oktyl glukopyranosid, proteasinhibitorcocktail, pH 5; (C) Starka anjonbytare (SAX2) i närvaro av 100 pl av 50 mmol /L Tris-HCl, 1 g /L CHAPS, proteasinhibitorcocktail, pH 8; och (d) Hydrofob interaktionskromatografi (H50) i närvaro av 100 pl av 5 ml /L trifluorättiksyra. Efter tvättning med 100 | il av samma respektive buffertar, till sinapinsyra tillsätts för att underlätta desorption och jonisering. Flisen analyserades genom SELDI-TOF-MS (pBSII, Ciphergen Biosystems Inc). Cancrar och kontroller blandade och köras samtidigt på samma chip och på flera chips för att minimera chip-to-chip variationer.
Magsaften pellets återsuspenderades i 25 ul av 6 mol /L guanidintiocyanat, 5 g /I oktyl- glukopyranosid, 0,1 mol /L Hepes pH 7, och 100 till 200 | j, l av 9 mol /L urea, 2 g /i CHAPS, 50 mmol /L Tris-HCl, pH 7,5 genom att vortexa i 45 minuter vid 4 ° C. Efter centrifugering vid 20 000 g under 5 minuter tillsattes 10 pl av extraktet anbringas på Protein matriser som beskrivits ovan. Review, en retentat karta genererades i vilka individuella proteiner visas som separata toppar på grundval av deras massa till laddningsförhållande . Uppgifter om de proteomik spektra analyserades med Ciphergen Express Data Manager med mönsterspåret och tvåvägs hierarkisk klustring algoritmen. Inriktade toppar med signalbrusförhållande över 3 normaliserades av total jonström. Proteomik egenskaper analyserades ytterligare med hjälp av betydelse analys av microarrays (SAM) programvara från Stanford University. Paketet har utformats för att ta itu med problem som är specifika för microarray analys av data (signal-brusförhållande variansen skiljer sig från gen till gen stort antal datapunkter från ett litet antal prover) men vi funnit det vara tillämplig på proteomik analys av data samt. Algoritmen av programvaran beskrevs av Tusher et al
. [16]. I korthet det definierat en metrisk kallas den relativa skillnaden för mätning av skillnaden mellan två eller flera grupper av data i stället för p
värdet. Det användes en variation av bootstrapping metoden och upprepade gånger delas upp en given datauppsättning (spektra som innehåller de proteomic funktioner i denna studie) slumpmässigt in i två grupper för att beräkna den relativa skillnaden för var och en av de permutationer. Antalet permutationer var inställd på att vara 1000 i denna studie och mjukvaran beräknas 1000 relativt skillnadsvärden för varje proteomik funktion. Den relativa skillnaden av den speciella grupp av intresse (observerade relativa skillnaden) jämfördes med den genomsnittliga relativa skillnaden från alla permutationer (förväntad relativa skillnaden) av varje funktion och funktionen bedömdes vara upp- eller ned-regleras i enlighet med huruvida dess observerade relativa skillnaden var större eller mindre än dess förväntade relativa skillnaden av några tröskelvärde. Programvaran uppskattade en falsk upptäckt hastighet (även definieras i referens [16]) för varje tröskelvärde som gav ett indirekt sätt att ställa in cutoff. Markörerna identifierade genom denna metod var statistiskt signifikanta. Den falska upptäckten hastighet var inställd på att vara mindre än 0,05 i denna studie.
Att validera markörer identifierats av SAM har en andra sats av 53 blinda prov läggs till datamängden för hierarkisk klustring med hjälp av Manager Ciphergen Express Data. Medan de kända proven används av SAM för att välja markörerna förväntades prestera bra i klustring ades förblindade prover med för att testa hur väl markörerna generalisera till okända prover. Resultaten av klustring helt enkelt jämföras med den verkliga identiteten av proverna och ingen avancerad klassificeringsmetod eller annan programvara användes i valideringen.
Biomarker identifiering
magsaft proteiner fraktionerades genom anjonbyteskromatografi (Q HyperD , Ciphergen Biosystems Inc.), med användning av stegvisa förändringar i pH för eluering. Proteiner i 50 mmol /L Tris-HCl, 1 g /L oktyl glukopyranosid, var pH 8 elueringsmedel renades ytterligare på en katjonbytar-array (LWCX30) med användning av 50 mmol /L natriumacetat, 1 g /L oktyl glukopyranosid, pH 5 som bindande och tvättbuffert. Efter tillsats av alfa-cyano-4-hydroxikanelsyra-energiabsorberande molekyler (Ciphergen Biosystems Inc.), var de kvarhållna proteinerna analyserades genom pBSII och Q-TOF (Waters /Micromass) utrustad med en Protein gränssnitt (PCI 1000, Ciphergen Biosystems Inc) . Proteiner karakteriserades genom MS /MS-fragmentering och identifiering genomfördes genom databassökning med Mascot (Matrix Science Ltd, London, UK).
Biomarker validering
Detta utfördes i en tredje uppsättning av gastriska vätskeprover tas från godartad mag- och gastric cancerpatienter. Varje nyligen uppsamlat prov bearbetades för avlägsnande av fast skräp och för att koncentrera proteininnehållet enligt följande. Efter tillsats fenylmetansulfonylfluorid till en slutlig koncentration av 0,2 mM, centrifugerades provet under 15 minuter vid 500 g och 4 ° C. Proteashämmare (Complete Mini ™, Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) tillsattes till supernatanten följt av centrifugal membranfiltrering vid 2 900 g och 15 ° C (Amicon Ultra-4 centrifugal filterapparat, 5 000 nominell molekylviktsgräns; Millipore, Billerica, MA, USA) tills provet reducerades till 10 - 20% av sin ursprungliga volym. Total proteinkoncentration bestämdes genom 2-D Quant Kit (Amersham Biosciences, Pisctaway, NJ, USA). Pepsinogen C och alfa-defensin 1-3 Koncentrationer bestämdes genom enzymkopplad immunanalys (ELISA) med användning av kit från Alpco Diagnostics (Salem, NH, USA) och Hycult bioteknik B.V. (Uden, Nederländerna), respektive. Varje bearbetat prov analyserades i duplikat för pepsinogen C och defensin nivåer med hjälp av leverantörernas protokoll. Prover för pepsinogen C-analysen som spätts 120 gånger. Koncentrationerna av pepsinogen C och alfa-defensin 1-3 härleddes med hänvisning till sina respektive standardkurvor och uttrycktes som ng (pepsinogen C) eller pg (defensin) per mikrogram av den totala magsaft protein.
Helicobacter pylori
närvaro av H. pylori
i magen vävnader identifierades genom visualisering av spiral mikroorganismer i histologi sektioner och /eller genom immunhistokemi. Fyra mikron vävnadssnitt de-vaxade i xylen och minskande grader av etanol. Antigenåtervinning var genom upphettning i citratbuffert, pH 6,0. Den primära antikroppen mot H. pylori
(1:50 utspädning; DAKO A /S, Glostrup, Danmark) följdes av den sekundära antikroppen polymerlänken (Envision Chem Mate, DAKO) och visualiserades med användning av diaminobensidin som kromogen
. resultat
Flera upp- eller nedregleras protein biomarkörer i magcancer upptäcktes i magsaft. Ett representativt proteomic karta över magvätska visas i figur 1. Det är en gel vy av ett masspektrum som visar magsaft proteiner selektivt bundna till immobiliserad koppar (II) metalljonen i molekylviktsområdet av 1500 Da till 6000 Da. Signifikanta proteinmarkörer som befunnits vara nedreglerade i cancer magsaft (p
< 0,01) indikeras med pilar. Figur 1 Expression skillnad karta över magsaft på koppar (II) immobiliserade metallaffinitetsinfångningsProtein array (IMAC3). Pilar indikerar protein biomarkörer signifikant olika i uttrycksnivå mellan de två grupperna av prover. Review, en representativ proteomik karta över magsaft pellets utdrag visas i figur 2. Proteiner selektivt bundna till en katjonbytar array yta. Signifikanta proteinmarkörer som befunnits vara upp- eller nedreglerade i magcancer fluid pellet (p
< 0,01) indikeras med pilar. Figur 2 Expression skillnad karta över magsaft pellets extrakt på katjonbyte Protein array (WCX2). Pilar indikerar protein biomarkörer signifikant olika i uttrycksnivå mellan de två grupperna av prover
Genomsnittlig CV. (Variationskoefficient, kumulativ 10-15 stora magsaft toppar per spektrum, n = 8) för immobiliserade koppar (II) Protein array (IMAC3) var 12,8%, för katjonbytar array (WCX2) till 15%, för anjonbytar array (SAX2) var 17,3% och för hydrofob interaktion chip (H50) var 13,6%. Dessa CV värden är i linje med reproducerbarhet bedömningen i SELDI litteraturen [17, 18]. Musik av SAM analys av alla proteomik egenskaper (totalt antal funktioner 41 800, genomsnittligt antal per retentat karta 314) i magsaft och pellets extrakt var 46 proteomik egenskaper visat sig vara betydligt nedregleras i magcancer och 60 proteomik funktioner var signifikant uppregleras i magcancer. (Data från olika förhållanden, t.ex. vätska och pellets samt olika ytor, helt enkelt samman tillsammans som separata funktioner för SAM. Markörer som rapporterats av SAM i både pellets och supernatant fraktioner manuellt identifierades och representerade endast en gång i listan efter att de var anses biologiskt signifikant). Betydligt ner reglerade markörer inkluderade 1884, 2428, 2594, 2840, 4050, 11720, 13700 Da; avsevärt uppreglerat markörer inkluderade 1761, 1831, 3372, 3443, 3605, 5160, 6780 Da. (De flesta av de betydande markörer upptäcktes på WCX2 och IMAC-koppar (II), följt av SAX2). Baserat på 106 betydligt olika proteomik egenskaper (Ytterligare fil 1), var tvåvägs hierarkisk klustring analys (tvådimensionell komplett koppling) utförs. De flesta av de gastriska cancerfall grupperade tillsammans för att bilda en distinkt grupp (figur 3 och övriga fil 2). Principalkomponentanalys av samma data visade också att cancer och godartade prover kunde väl separerade i två grupper, med 2 falskt negativa (representerande duplikatanalys av samma mål) och 9 falska positiva, respektive (Figur 4). En magcancer vätskeprov (från ett fall av steg I dåligt differentierad magcancer) klustrade bland icke-cancerprov; alla andra fyra tidigt stadium (stegen 0 och I) patienter klustrade korrekt med prover från 14 patienter med stadium II - IV magcancer, vilket ger en total diagnostisk sensitivitet på 95% (18/19 gastric cancerpatienter) på träningsmängden. Figur 3 Expression skillnad karta över magsaft och pellets extrakt proteiner av övningsuppsättningen prov på fyra Protein arrayer, som visas i tvåvägs hierarkisk klustring. Betydande proteomik funktioner visas vertikalt. Intensiteten i gråskala indikerar graden av relativ proteinnivå, högre eller lägre än medianvärdet. Patientfall presenteras horisontellt; de flesta patienter med ventrikelcancer är tätt grupperade tillsammans. Denna figur visar den övre kvartilen av hela bilden (se ytterligare en fil 2 för hela bilden).
Figur 4 Principalkomponentanalys tomt på proteomik egenskaper hos övningsuppsättningen prover. En enda plan (betecknas med den svarta linjen) delar proven i två grupper med ett falskt negativt (visas i dubbla platser) och 9 falska positiva.
Nio av 36 icke-cancerprover i träningsmängden klustrade med cancerprover (specificitet 75%). Av dessa 1 hade en dysplastiska adenomatös polyp - en precancerös lesion [19]. Bland de övriga 8 patienter hade sex kliniskt riktade biopsier som avslöjade intestinal metaplasi i 4 patienter (67%). Åtta icke-cancerpatienter vars magsaft proteinprofiler klustrade i den normala gruppen hade också kliniskt inriktad på slemhinnor biopsier som visade intestinal metaplasi i endast två patienter (25%). En översyn av 1000 gastric biopsier följd utförs för alla indikationer visade en total förekomst av intestinal metaplasi i Singapore General Hospital under studieperioden på 30%. Detta kontrasterar med förekomsten av åtminstone 67% av intestinal metaplasi bland kliniskt godartade fall vars proteomik profiler klustrade närmare med gastric cancerfall än med andra normala, är förenliga med tarm metaplasi är ett mellantillstånd i övergången från normal gastric epitel till magcancer . Exakt identifiering av intestinal metaplasi med endoskopi är känd för att vara felaktig [20]. Således är en magcancer-typ proteomik fingeravtryck möjligen en känslig indikator för närvaron av denna pre-maligna lesioner bland patienter kliniskt diagnostiserade ha godartade magsjukdomar.
Gastric cancerpatienter i utbildning som var betydligt äldre (medelålder 67,7 år) än patienter med godartade magsår förhållanden (medelålder 56,6) (p
= 0,0062). Att ta itu med möjligheten att proteinprofiler relaterat till ålder eller etnicitet, vi åter analyserade data för den undergrupp av kinesiska patienter över 55 års ålder. Detta resulterade i 1/17 cancer felaktig klassificering (samma tumör som misclassified när alla 19 cancer analyserades, känslighet 94%) och 4/17 kontroller felaktig klassificering (samma 4 kontroller som var bland de 9 felaktig klassificering benigna fall, specificitet 76,5%) .
Vi testade nästa det faktiska utförandet av proteomik profiler i särskiljande cancer från godartade prov i en andra serie av 53 förblindade magsaft och pelletsextraktprover (24 gastric cancer och 29 benigna magsjukdomar) (ytterligare en fil 3). Tjugoen av 24 gastric cancer var korrekt identifierade (känslighet 88%) och två av 29 godartade prover felaktigt klassificerade (specificitet 93%) (Figur 5). Figur 5 Expression skillnad karta över magsaft och pellets extrakt proteiner av validerings set prov på fyra Protein arrayer, som visas i tvåvägs hierarkisk klustring. Betydande proteomik funktioner visas horisontellt. Intensiteten av de röda eller gröna färger indikerar graden av relativ proteinnivå, högre eller lägre än medianvärdet. Patientfall presenteras vertikalt; de flesta patienter med ventrikelcancer är tätt grupperade tillsammans.
Selected proteomik markörer (baserat på arbetsuppgifternas betydelse värdera bestäms av SAM) var halvrenade på Protein arrayer och identifieras direkt på fläckar av kollisions dissociation sekvensering (Figur 6). Flera av de betydligt nedregleras markörer i cancerpatienter som visas i figurerna 1 och 2, 1881,9 Da, 2041,0 Da, 2188,1 Da och 2387,3 Da, identifierades att vara pepsinogen C och pepsin A aktiveringspeptidfragment (tabell 1). De uppreglerat triplett markörer hos cancerpatienter som visas i figurerna 2, 7 och ytterligare fil fyra identifierades vara alfa defensin-1,2,3. Intensitet scatter tomter visar mycket stora skillnader i medelintensiteterna defensin och pepsin fragment mellan godartad kontroll och magcancer vätskeprover (p
= 0,003 och 0,00002 respektive) (Figur 8). Använda ELISA specifik för pepsinogen C, bekräftade vi betydligt lägre koncentrationer i magcancer vätskor (11,9 ± 0,1 ng /ig totalt protein, medelvärde ± sem n = 6.) jämfört med godartade prover (21,5 ± 1,4 ng /xg totalt protein n =. 23) i ett tredje prov n (s
= 0,0126, Student oparade tvåsidiga t
test). ELISA utförs på samma prov uppsättning för defensin nivåer visade högre koncentrationer i magcancer prover (63,4 ± 9,2 pg /ug totalt protein, medelvärde ± sem n = 6) än i benigna prover (46,2 pg /ug totalt protein, medel ± sem n = 23) ((p
= 0,0654, Students t
test) .table en Peptidsekvenser sekvenser~~POS=HEADCOMP som identifierats av MS //MS
peptid m /z
Sequence
Protein Match
Mowse † poäng
Mowse poäng med signifikant homologi
2386,29
FLKKHNLNPARKYFPQWKA
Pepsin En aktiveringspeptid
35 Hotel > 28
2187,12
FLKKHNLNPARKYFPQW
Pepsin A aktiveringspeptid
18 Hotel > 26
2040,03
LKKHNLNPARKYFPQW
Pepsin En aktiveringspeptid
28 Hotel > 26
1775,95
FLKKHNLNPARKYF
Pepsin A aktiveringspeptid
47 Hotel > 26
1628,84
LKKHNLNPARKYF
Pepsin En aktiveringspeptid
40 Hotel > 28
1880,92
LRTHKYDPAWKYRF
Pepsinogen C aktiveringspeptiden
31 Hotel > 22
† Mowse poäng = -10Log ( P), där P = sannolikheten att matchen är en slumpmässig händelse (P Hotel < 0,05) m /z
, massa /ladda
Figur 6 Högupplöst masspektrum av fraktione magsaft proteiner på LWCX30 Protein array som erhållits på en QTOF utrustad med en PCI1000 gränssnitt. Boxed toppar utsattes för fragmentering analys av kollisions dissociation MS /MS.
Figur 7 Högupplöst masspektrum av magsaft proteiner på H50 Protein array som erhållits på en QTOF utrustad med en PCI1000 gränssnitt. Denna figur visar de upp-regleras triplett markörer i magcancer. Se ytterligare fil 4 för hela bilden.
Figur 8 Spridningsdiagram av intensitetsvärden för defensin och pepsin fragment närvarande i magsaft prover av godartad kontroll och gastric patienter från träningsmängden cancer.
Diskussionen
Våra data tyder på att den spektrala profilen av ofraktionerat magsaft kan vara ett användbart komplement för cancerdiagnos och upptäckt av tidiga sjukdomsstadier, i kombination med klinisk gastroskopi. De senaste försök att identifiera protein biomarkörer för magcancer har undersökt serum [21-29] och vävnad [24, 30-37], och har alltmer använt masspektrometri. Äldre rapporter om serologiska analyser av enskilda kända tumörmarkörer t.ex. CEA, CA 19-9, CA 72-4, CA242 och TAG-72, har i allmänhet låg känslighet (< 50%) [38-41]. Dessutom finns det betydande kors positivitet av dessa tumörmarkörer i icke-gastric cancer, t.ex. upphöjda CEA och MG7-Ag nivåer är vanliga i kolorektal cancer, kolangiokarcinom, pankreatisk karcinom, och även hos friska kontroller [40, 23]. Inte överraskande, sådana serumtumörmarkörer har någon etablerad roll i gastric cancerdiagnos och screening, även om de kan tjäna som prognostiska indikatorer och tidiga markörer för återkommande sjukdom efter gastrektomi [39, 41, 42].
Vi valde att undersöka proteomik profiler av magsaft för sjukdoms biomarkörer eftersom det verkade troligt att oroade gastric proteinutsöndring i maligna och premaligna tillstånd, tillsammans med eventuell förekomst av exfolierad cancerceller, kan generera distinkta proteomik profiler. Som i sökandet efter serum biomarkörer, har flera grupper undersökt den diagnostiska nyttan av kända tumörmarkörer i magsaft. Varken CEA eller CA 19-9 positivitet i magsaft har visat diagnostisk noggrannhet [43-46]. Alfa-1-antitrypsin i magsaft har nyligen rapporterats som en magcancer biomarkör [47, 48].
Vårt sätt att utveckla en känslig metod för gastric cancerdiagnos skilde sig från tidigare studier på tre sätt. Först valde vi ett biologiskt prov som var organspecifika (dvs endoskopiskt sugs magsaft) snarare än systemiskt (dvs serum), resonemang att de molekylära egenskaper mer sannolikt skulle vara sjukdomsspecifik. För det andra, masspektrometri det möjligt för oss att ta en opartisk upplevelsebaserat tillvägagångssätt. För det tredje, våra data genererade profiler för flera proteomik markörer som alltmer betraktas som har högre känslighet och specificitet än enstaka tumörmarkörer [49, 50]. För magcancer, som kombinerar även 2 eller 3 tumörmarkörer uppnås bättre diagnostiska noggrannheten jämfört med en enda ensam markör [38, 40].
Protein fingeravtryck av magsaft från mag cancerpatienter visade totalt 106 proteomik funktioner som var betydligt upp - eller nedregleras (Ytterligare filer 1 och 3). Två framträdande markörer valdes ut för identifiering av MS /MS. Pepsinogen A och pepsinogen C aktiverings peptider nedregleras i magsaft bort från magar med histologiskt bekräftad adenocarcinom. En studie av kryostatsnitt av magcancer har också rapporterat signifikant nedreglering av pepsinogen C, identifierad med MS /MS, i tumörvävnad [51].

• Genetiska linjer av odifferentierad typ gastriska karcinom analyserats oövervakad klustring av genomiskt DNA microarray uppgifter
• MIR-146a rs2910164 G /C polymorfism och magcancer mottaglighet: en metaanalys