Fosforylerad Smad2 i framskridet stadium Gastric Carcinoma

fosforylerat Smad2 i framskridet stadium magcancer Bild Sammanfattning
Bakgrund
Transformerande tillväxtfaktor β (TGFp) receptorsignalering är nära förknippad med invasionen förmåga gastric cancerceller. Även Smad signal är en kritisk integratör av TGFp-receptorsignalöverföringssystem, är inte mycket känt om den roll som Smad2 uttryck i magcancer. Syftet med den aktuella studien är att klargöra vilken roll fosforylerat Smad2 (p-Smad2) i mag adenokarcinom i avancerade stadier.
Metoder
Immunohistokemisk färgning med anti-p-Smad2 utfördes på paraffininbäddade prover från 135 patienter med avancerad magsäcks adenokarcinom. Vi utvärderade också förhållandet mellan uttrycksnivåer av p-Smad2 och clinicopathologic egenskaperna hos patienter med gastriska adenokarcinom.
Resultat
p-Smad2 expressionsnivån var hög i 63 (47%) av 135 gastric karcinom. P-Smad2 expressionsnivån var signifikant högre i diffus typ karcinom (p = 0,007), tumörer med peritoneal metastas (p = 0,017), och tumörer med lymfkörtel metastas (p = 0,047). Prognosen för p-Smad2 höga patienter var signifikant (p = 0,035, log-rank) sämre än den för p-Smad2 låga patienter, medan en multivariat analys visade att p-Smad2 uttryck var inte en oberoende prognostisk faktor.
Slutsats
uttrycket av p-Smad2 är associerad med maligna fenotypen och dålig prognos för patienter med avancerad magsäckscancer.
bakgrund
transformerande tillväxtfaktor β (TGFp) är en multifunktionell cytokin och en av de viktigaste vägarna för cancerceller [1, 2]. TGFp binder till två olika serin /treonin-kinasreceptorer (XpR), benämns typ I och typ II. Den aktiverade TpR typ I kinas fosforylerar Smad2 och Smad3. Fosforylerad Smad2 (p-Smad2) och p-Smad3 är oligomeriseras med Smad4, migrera in kärnan och reglera transkription [1, 3]. I normala epitelceller, är TGFp en potent hämmare av proliferation, och det har ansetts vara en tumörsuppressor. Även TGFp fungerar som en tumörsuppressor i tumörer tidigt stadium under tumörprogression TGFp antiproliferativa funktion går förlorad, och i vissa fall TGF blir en onkogen faktor inducerar celltillväxt, invasion, angiogenes och immunosuppression [4, 5]. Det har rapporterats att TGFp kan signalera inte bara genom Smad-beroende, men också Smad-oberoende vägar [6]. På grund av de dubbla aspekter av TGFp i onkogenes kan Smad signalen vara en kritisk integratör av TGFp-receptorsignalöverföringssystem, även om betydelsen av Smad uttryck är fortfarande kontroversiell. Bruna et al. 2007 visade att höga TGFp-Smad aktivitet är närvarande i aggressiva, höggradigt proliferativa gliom och ger dålig prognos för patienter med gliom [7], medan en brist på Smad uttryck verkar vara korrelerad med tumörutveckling och dålig prognos för patienter med esophageal squamous cell carcinoma [8] bröstcancer [9] och kolorektal cancer [10]. Inte mycket är känt om prognostiska värdet av Smad2 uttryck i magcancer, medan flera rapporter om serumnivåer av TGF [11, 12] föreslog att TGFp kan inducera invasion och metastas i magcancer. Förstå betydelsen av Smad2 kan vara användbara för magcancer. I denna studie, därför undersökte vi p-Smad2 uttryck för magcancer att klargöra vilken roll p-Smad2 i avancerad magsäcks adenokarcinom.
Metoder
Patienter
vi granskat kirurgiska prover från patienter på Osaka City Universitetssjukhuset, Osaka, Japan. Totalt 135 patienter som genomgått resektion av primärgastriska tumörer och bekräftades histologiskt ha avancerad magsäckscancer, var inskrivna i denna studie. "Advanced cancer" indikerar cancer invasion av muscularis propria eller slemhinnorna. Ingen av patienterna hade genomgått preoperativ strålning eller kemoterapi. Patologiska diagnoser och klassificeringar följde japanska Klassificering av magcancer [13]. Levermetastaser och peritoneal metastas undersöktes vid laparotomi. Peritonealsköljning cytologi i bukhålan utfördes vid laparotomi, och exfolierad cancerceller var mikroskopiskt undersöktes. Djup av tumörinvasion, differentiering, lymfkörtel metastas, venös invasion och lymfatiska invasion baserades på mikroskopisk undersökning av material som erhållits genom kirurgisk resektion. Den histologiska klassificeringen baserades på den dominerande mönster av tumör. De histologiska subtyper var: papillär adenokarcinom, väl differentierade rörformiga adenokarcinom och måttligt differentierad rörformiga adenokarcinom, betraktas som intestinal-typ. De subtyper var: fast dåligt differentierade adenokarcinom, icke-fast dåligt differentierade adenokarcinom, klackring cellscancer och mucinous cancer, anses vara diffusa-typ. Lymfkörtel metastas beslutades på den regionala lymfkörtlar metastaser. De regionala lymfkörtlarna i magen indelas i tre stationer numrerade såsom beskrivits i den japanska klassificering [13] att beroende på placeringen av den primära tumören. Eftersom antalet ökar, indikerade det att spridning till avlägsna lymfkörtlar. Studieprotokollet överensstämde med de etiska riktlinjerna i Helsingforsdeklarationen (1975). Studien godkändes av Osaka City University etisk kommitté den. Informerat samtycke erhölls från alla patienter före inträdet
Immunohistokemiska tekniker
Alla H &. E-färgade objektglas av de kirurgiska prover granskades och representativ del av tumören som inkluderade platsen för djupaste invasion valdes för immunohistokemisk studie Review, en polyklonal kanin-anti-human P-Smad2-antikropp (Chemicon International, Themecula, CA. 1: 2000). användes för att detektera p-Smad2. Metoderna för immunhistokemisk färgning för p-Smad2 har beskrivits i tillverkarens instruktioner. I korthet var objektglasen avparaffinerades, och upphettades under 20 min vid 105 ° C i autoklav i Target Retrieval Solution (Dako, Carpinteria, CA). Sektioner inkuberades sedan med 3% väteperoxid för att blockera endogen peroxidasaktivitet. Proverna inkuberades med p-Smad2-antikropp (1: 2000) över natten vid 4 ° C. Sektionerna inkuberades med biotinylerat get-anti-kanin-immunoglobulin G i 30 min, följt av tre tvättningar med PBS. Objektglasen behandlades med streptavidin-peroxidas-reagens, och inkuberades i PBS diaminobensidin och 1% väteperoxid v /v, följt av motfärgning med Mayers hematoxylin. Vi har tidigare rapporterat expressionsnivån av p-Smad2 i gastriska cancercellinjer [14]. Utelämnandet av den primära antikroppen tjänade som negativa kontroller.
Immunhistokemisk bestämning av p-Smad2
P-Smad2 färgning utvärderades vid invasionen framför gastric cancer. Både hematoxylin och eosin-färgning användes som referens bilden för att välja cancerområden vid den invaderande fronten. Förekomsten av cancerceller kontinuerligt undersöktes från serosa till slemhinnan under ett mikroskop. De invaderande fram bestämdes vid lesionen där cancerceller först hittades från serosala sida. P-Smad2 färgning var tydlig i kärnorna av cancerceller. Den procentuella andelen av p-Smad2 immunpositiva celler bestämdes genom räkning av 3 områden slumpmässigt valda i vävnaden i totalt 300 kärnor av cancerceller. Utvärdering gjordes av två dubbelblinda oberoende observatörer som var ovetande om kliniska data och histologiska diagnoser. Procentandelen av nucleus färgade celler för p-Smad2 bestämdes också. Det fanns 15 (11%) fall av avvikande utvärdering mellan de två oberoende observatörer. I dessa fall, vi kontrolleras på nytt och diskuterade och slutresultatet erhölls genom färgning konsensus.
Poängsattes med användning av Allred poängsystem som beskrivits tidigare [15]. För semikvantitativ analys av p-Smad2 immunoreaktivitet var intensiteten av färgningen och andelen tumör färgade celler utvärderas i den representativa hög effekt (x 400) och låg effekt fält (× 200) med hjälp av optisk mikroskopi: intensitet bedömdes 0-3 (0 = ingen immunreaktivitet, 1 = svag, 2 = måttlig, och 3 = intensiv immunreaktivitet) och andel bedömdes 0-5 (0 = 0%; 1 = 1-20%; 2 = 21-40%; 3 = 41-60%; 4 = 61-80%; 5 = 81-100%). De två poängen tillsattes sedan för att erhålla det slutliga resultatet av 0-8. Median poäng av alla fall var 6,07. Då brytpunkt bestämdes 6; p-Smad2 uttryck ansågs hög uttryck när poängen var ≥7 och låg uttryck när poängen var. < 7
Statistisk analys
jämförande analyser av data genomfördes med hjälp av Chi-square test eller Fishers exakta test. Överlevnads varaktighet beräknades med hjälp av Kaplan-Meier-metoden och analyserats av log-rank test för att jämföra den kumulativa överlevnadstider i patientgrupperna. Cox proportionella-risker regression användes för att beräkna univariata och multivariata faror förhållanden för studieparametrar. Ett p-värde av mindre än 0,05 definierades som statistiskt signifikant. SPSS 10,0 programvara (SPSS Japan, Tokyo, Japan) användes för analyserna.
Resultat
Förhållandet mellan kliniskt patologiska egenskaper och fosfor-Smad2 uttryck
fosfor-Smad2 främst immunolocalized i kärnan av cancerceller (Figur 1A). Intensiteten av färgningen och procentandelen färgade tumörceller var variabel. När det gäller intensitet, var poäng 0 hittade i några fall (0%), poäng en i 55 fall (41%), poäng 2 i 33 fall (24%), och poäng 3 i 47 (35%) fall. Vid utvärdering av positiva procentcell var poäng 0 hittade i några fall (0%), poäng en i 2 fall (1%), poäng 2 i 11 fall (8%), poäng 3 i 16 fall (12%), poäng 4 i 43 fall (32%), och poäng 5 i 63 fall (47%). De totala Allred poängen varierade från 2 till 8. Den höga expressionsnivån av p-Smad2 återfanns i 63 (47%) av 135 gastriska karcinom. Sambanden mellan p-Smad2 uttryck och kliniskt patologiska egenskaper hos tumörerna visas i Tabell 1. P-Smad2 expressionsnivån var signifikant hög i diffus typ karcinom (p = 0,011) och signifikant korrelerad med peritoneal metastas (p = 0,017), lymfkörtel metastas av japanska klassificering [13] eller UICC klassificering [16] (p = 0,047, p = 0,004) och peritoneal cytologi (p = 0,026). "Peritoneal cytologi" betyder peritonealsköljning cytologi vid laparotomi som en standardmetod för detektering av fria tumörceller och en användbar prediktor för peritoneal återfall i magcancer. I 12 fall var peritoneal cytologi inte utförts. Då det totala antalet peritoneal cytologi var 123 fall. Det fanns ingen statistiskt signifikant samband mellan fosfor-Smad2 uttryck och antingen levermetastaser, venös invasion eller lymfatiska invasion. Antalet metastatiska lymfkörtlar i hög uttrycksgrupp (median = 12,3) var signifikant (p = 0,002) högre än i låg uttrycksgruppen (median = 5,77), medan ingen skillnad i antalet drabbade lymfkörtlar visades mellan låg-p-Smad2 grupper (median = 41,1) och hög-p-Smad2 grupper (median = 44,4). Figur 1 (A), Immunhistokemisk bestämning av p-Smad2. P-Smad2 hittades i kärnan av cancerceller. Den immunoreaktiva intensitetspoäng av p-Smad2 färgning i tumörceller utvärderades med användning av de positiva och negativa kontroller. Score 3 innebär hög intensitet som samma som den positiva kontrollen. Immunoreaktivitet, poäng 1 = svag, poäng 2 = måttlig, och poäng 3 = intensiv. (× 400). (B), Den totala överlevnaden hos patienter baserat på p-Smad2 uttryck. Kaplan-Meier överlevnadskurva visar den övergripande överlevnaden i förhållande till p-Smad2 expression i 135 patienter med gastrisk carcinom. En statistiskt signifikant skillnad i överlevnad observerades mellan de höga p-Smad2 grupper och låga p-Smad2 grupper (p = 0,035; log-rank,).
Tabell 1 Förhållandet mellan p-Smad2 och kliniskt patologiska funktioner i 135 ventrikelcancer fall.
Parameter
P-Smad2
p
Värde

vid hög (n = 63)
Låg (n = 72)
vid Kön
Man
39 ( 41,9%) Review 54 (58,1%) katalog NS
Kvinna
24 (57,1%) Review 18 (42,9%) Review Morfologisk funktion +
typ 1
6 ( 37,5%) Review 10 (62,5%) Review 0,025
typ 2 Review 14 (35,0%) Review 26 (65,0%) Review Typ 3
17 (45,9%)
20 (54,1%) Review typ 4
26 (61,9%) Review 16 (38,1%) Review T etapp 2
7 (25,9%) Review 20 ( 74,1%) katalog 0,031
3
52 (50,0%) Review 52 (50,0%) 4
4 (100,0%) Review 0 (0,00%) Review Differentieringen
Intestinal-typ
15 (31,2%) Review 33 (68,8%) katalog 0,011
Diffusa-typ
48 (55,2%) Review 39 (44,8%)
Lymfkörtel metastaser +
(japansk klassificering) Review N0 och N1
34 (40,5%) Review 50 (59,5%) Review 0,047
N2 och N3
29 (56,9 %) Review 22 (43,1%) Review Lymfkörtel metastaser ++
(UICC klassificering) Review N0 och N1
31 (36,9%) Review 53 (63,1%) Review 0,004
N2 och N3
32 (62,7%) Review 19 (37,3%) Review levermetastaser
Negativ
62 (47,0%) Review 70 (53,0%) Review NS
Positiv
en (33,3%) katalog 2 (66,7%) Review Peritoneal metastaser
Negativ
48 (42,1%) Review 66 (57,9%) Review 0,017
Positiva
15 (71,4%) Review 6 (28,6%) Review Peritoneal cytologi +++
Negativ
36 (40,4%) Review 53 (59,6%) Review 0,026
Positiv
22 (64,7%) Review 12 (35,3%) Review lymfatiska invasion
Ly0 och Ly1
26 (40,6%) Review 38 (59,4%) katalog NS
Ly2 och ly3
37 (52,1%) Review 34 (47,9%) Review Venös invasion
Negativ
50 (45,5%) Review 60 (54,5%) Review NS
Positiv
13 (52,0%) Review 12 (48,0%) katalog klinisk fas
jag
2 (22,2%) Review 7 (77,8%) Review 0,022
II
15 (39,5%) Review 23 (60,5%) Review III
18 (40,0%) Review 27 (60,0%) Review IV
28 (68,7% ) Review 15 (31,3%) Review +, Klassificering enligt de allmänna bestämmelserna för magsäckscancer studien av den japanska Research Society for ventrikelcancer [13]. Typ 1 definieras som en polypoid tumör; typ 2 som polypoid tumör med sår och med skarpt avgränsade marginaler; typ 3 som sårigt carcinoma med cancer infiltration i den omgivande väggen; typ 4 som diffust infiltrerar platt carcinoma in där sår är oftast inte en markant inslag.
++, var Nodal skede bedömas av Union Internationale Contre le Cancer (UICC) tumör nod metastasering (TNM) klassificering [16] och genom klassificering enligt de allmänna reglerna för magcancer studie av japanska Research Society for magcancer. I TNM klassificering, var nodal skede klassificeras i enlighet med antalet inblandade regionala LNS enligt följande: PN0, ingen LN spridning; PN1, en till 6 sjuka LNS; pN2, 7-15; och PN3, mer än 15. I den japanska klassificering, var nodal skede klassificeras i enlighet med omfattningen av positiv LN i n0, n1, n2, och n3 och anses återspegla den anatomiska vägen för lymfatisk spridning. n1 definieras som intill regional LN sjukdom, och N2 och N3 definieras som avlägsen.
+++, I 12 fall, peritoneal cytologi utfördes inte (Totalt 123 fall).
fosfor-Smad2 avser med dålig prognos i magcancer
i denna serie av avancerad magsäckscancer, överlevnad fosfor-Smad2 uttrycks patienter på hög nivå var betydligt sämre än för fosfor-Smad2 uttrycks patienter låg nivå (p = 0,035, Figur 1B). I univariat analys, hög fosfo-Smad2 uttryck (p = 0,048), morfologisk typ 4 (p < 0,001), diffus-typ-tumörer (p < 0,001), lymfkörtel metastas (p < 0,001), peritoneal metastas (p < 0,001), peritoneala fria cancerceller (p < 0,001), lymfatiska invasion (p = 0,006) och kliniska stadiet IV (p < 0,001) var signifikant associerade till dålig patientens överlevnad (Tabell 2). I multivariat analys, morfologisk typ 4, diffus typ tumörer och kliniska stadiet IV var statistiskt oberoende prognostiska faktorer, men fosfor-Smad2 var inte (tabell 3) .table 2 Univariat analys med avseende på total överlevnad (n = 135).
Parameter
Riskprocent
95% konfidensintervall
p
Värde
P-Smad2 uttryck
1,650
1,005-2,710
0,048
Låg vs
. hög
Morfologisk funktionen
5,354
3,199-8,963
< 0,001
typ 1, 2, och 3 vs
. typ 4
Differentiering
3,883
2,020-7,463 Hotel < 0,001
Intestinal-typ vs
. Diffusa-typ
Lymfkörtel metastaser (japansk klassificering) Review 3,269
1,978-5,403 Hotel < 0,001
N0 och N1 vs
. N2 och N3
Peritoneal spridning
5,534
3,056-8,738 Hotel < 0,001
Negativ vs
. positiv
Peritoneal cytologi
5,937
3,468-10,166
< 0,001
Negativ vs
. positiv
lymfatiska invasion
2,055
1,234-3,421
0,006
Ly0 och Ly1 vs
. ly2 och ly3
klinisk fas
6,901
4,088-11,651 Hotel < 0,001
I, II och III vs
. IV
Tabell 3 multivariat analys med avseende på total överlevnad (n = 135).
Parameter
Riskprocent
95 % konfidensintervall
p
Värde
P-Smad2 uttryck
0,627
0,347-1,133
0,122
Låg vs
. hög
Morfologisk funktionen
2,325
1,221-4,388
0,010
typ 1, 2, och 3 vs
. typ 4
Differentiering
2,807
1,251-6,298
0,012
Intestinal-typ vs
. Diffusa-typ
Lymfkörtel metastaser (japansk klassificering) katalog 1,387
0,689-2,794
0,360
N0 och N1 vs
. N2 och N3
Peritoneal spridning
1,097
0,549-2,193
0,793
Negativ vs
. positiv
lymfatiska invasion
1,394
0,805-2,413
0,235
Ly0 och Ly1 vs
. ly2 och ly3
klinisk fas
4,382
1,924-9,978 Hotel < 0,001
I, II och III vs
. IV
Diskussion
P-Smads2 är en primär steg och intracellulär signalering effektor för förmedling av intracellulär signalering av TGF [1]. I tumörer tidigt stadium verkar TGFP som tumörer dämpare, medan avancerade tumörer blir en onkogen faktor. På grund av den dubbla rollen av TGFp vid onkogenes, beroende på vilken typ och stadium av tumören, fokuserade vi vår studie på p-Smad2 uttryck på ett framskridet stadium av magcancer. P-Smad2 uttrycksnivåer av cancerceller var hög i 63 (47%) av 135 gastric karcinom, vilket tyder på att vissa typer av gastric karcinom starkt påverkats av TGF. I den aktuella studien, p-Smad2 uttryck i tumörceller var signifikant högre i diffus-typ tumörer och i fall med peritoneal metastas, gratis peritoneala cancerceller och lymfkörteln metastasering. Dessutom, p-Smad2 högt uttryck förutspådde dålig överlevnad. Dessa fynd tyder på att p-Smad2 är associerad med malign fenotyp och är en molekylär biomarkör sjukdoms resultatet i avancerad magsäckscancer.
P-Smad2 uttrycksnivåer av cancerceller var höga i diffus-typ magcancer också känd som en scirrhous typ . Det finns två typer av magcancer: diffusa typ och tarm typ, enligt Laurén klassificering [17]. De karakteristiska kliniska egenskaperna hos diffus typ magcancer, en diffust infiltrera typ av magcancer, innehålla en hög frekvens av metastaser till LNS [18-20] och till bukhinnan [21-23]. Uttrycksnivån för TGF i scirrhous magkarcinom var relaterad med dålig prognos [24]. Tumörceller i scirrhous carcinoma producera mer TGF än icke-scirrhous cancer [25, 26]. TGFp signaler kan spela en viktig roll för metastatisk spridning av cancerceller, såsom migration och invasion, som tidigare rapporterats [2, 11, 27]. I själva verket var Uttryck av Smad2 samband med metastaser, och korrelerade med dålig prognos av gastric tumörer speciellt diffus typ magcancer. TGFp-Smad2 signalering kan ha en viktig roll i utvecklingen av diffus typ magcancer. Den aktiverade Smad2 nivå kan vara förknippade med olika kliniska fenotypen av malignitet mellan diffusa-typ och tarm-typ i magcancer.
Immunhistokemisk är en bra metod för val för utvärdering av proteinuttryck i en speciell vävnad, eftersom det är det möjligt att särskilja celltyper färgade, liksom antalet celler och intensiteten av immunhistokemiska färgas. Båda analyserna måste kombineras och det gjordes. Allred poängsystem utvärderar en kombination av intensitet och andelen och därigenom öka prognostiska värde av analysen av intensiteten ensam eller andelen ensam i denna studie. Allred betyg för 7-8 ansågs lämpliga för identifiering av aggressiva avancerad magsäckscancer. Allred poängsystem för p-Smad2 uttryck kan vara lämpliga för exakt bedömning av p-Smad2-uttryckande tumörceller, och kan vara tillräckligt för att förutsäga resultatet av patienter med magsäckscancer. P-Smad2 färgning utvärderades vid invasionen framför gastric cancer. P-Smad2 uttryck i kärnan av cancerceller kontinuerligt granskas från serosa till slemhinnan under ett mikroskop. Få skillnad på p-Smad2 färgning återfanns mellan infiltrativa fram och yta lesioner i samma fall. Och, tumörcellerna vid den invaderande fronten skulle kunna spela en viktig roll för avlägsna metastaser. Därför var p-Smad2 expression av tumörcellerna utvärderas vid den invaderande fronten.
Eftersom den aktiverade Smad2 var associerad med den maligna fenotypen av magcancer, är det möjligt att hämning av p-Smad2 signalering i magkarcinom kan ge välgörande effekter genom hämning av invasion och metastas av cancer. Även den TGF väg att utvärderas som ett terapeutiskt mål i magcancer [28, 29], kan de komplexa roller TGF i tumörprogression gör det svårt att välja de patienter som kommer att gynnas av en anti-TGF terapi. Fastställandet av p-Smad2 uttryck av Allred poängsystem kan förbättra patientens val och utvecklingen av framgångsrika riktade terapier, även om det kommer att bli nödvändigt att bekräfta att p-Smad2 Allred poäng ger också betydande prognostisk effekt för gastric cancerpatienter i en prospektiv studie.
Slutsats
P-Smad2 verkar spela en avgörande roll i avancerad magsäckscancer och kan vara ett användbart prognostisk markör för dålig prognos.
förklaringar
Tack
Vi tackar Masako Shinkawa (Osaka City University Graduate School of Medicine) för att få hjälp.
författarnas ursprungliga inlämnade handlingarna Images of Nedan finns länkar till författarnas ursprungliga inlämnade filer för bilder. 12885_2010_2451_MOESM1_ESM.pdf Författaroriginalfilen för figur 1 12885_2010_2451_MOESM2_ESM.jpeg Författaroriginalfilen för figur 2 Konkurrerande intressen
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

• Bedömning av Toll-like receptors 4 Asp299Gly, Thr399Ile och interleukin-8 -251 polymorfismer i risk för utveckling av distala magcancer
• Löslig Fas kan tjäna som ett diagnostiskt verktyg för adenocarcinom