magen Hälsa > undersökningar > MYC, FBXW7 och TP53 kopienummer variation och uttryck i Gastric Cancer

MYC, FBXW7 och TP53 kopienummer variation och uttryck i Gastric Cancer

MYC, FBXW7 Mössor och TP53
kopienummer variation och uttryck i Gastric Cancer Bild Sammanfattning
Bakgrund
MYC avreglering är en vanlig händelse i gastric cancer, vanligen som en följd av genamplifiering, kromosomtranslokationer eller posttranslationella mekanismer. FBXW7
är en p53-kontrollerad tumörundertryckare som spelar en roll i regleringen av cellcykeln exit och återinträde via MYC nedbrytning.
Metoder
Vi utvärderade MYC
, FBXW7
och TP53
kopietal, mRNA-nivåer, och proteinuttryck i magcancer och parade icke-neoplastiska prover från 33 patienter och även i gastriska adenokarcinom cellinjer. Vi bestämde också invasionen potential mag cancercellinjer Resultat.
MYC
förstärkning observerades i 51,5% av gastriska tumörprover. Strykning av en kopia av FBXW7 Mössor och TP53
observerades hos 45,5% och 21,2% av gastriska tumörer, respektive. MYC
mRNA-expression var betydligt högre i tumörer än hos icke-neoplastiska prover. FBXW7 Mössor och TP53
mRNA-expression var markant lägre i tumörer än i parade icke-neoplastiska prover. Dessutom avreglerades MYC Mössor och FBXW7
mRNA-uttryck i samband med förekomsten av lymfkörteln metastasering och tumörstadium III-IV. Dessutom var MYC immunofärgning mer frekvent hos intestinal-typ än diffusa typ gastric cancer och förknippades med MYC
mRNA-uttryck. In vitro visade studier att ökad MYC och reducerad FBXW7 uttryckning är associerad med en mer invasiv fenotyp i gastriska cancercellinjer. Detta resultat uppmuntrade oss att undersöka aktiviteten av gelatinaser MMP-2 och MMP-9 i båda cellinjerna. Båda gelatinaser syntetiseras övervägande genom stromaceller snarare än cancerceller, och det har föreslagits att både bidra till cancerutveckling. Vi observerade en signifikant ökning av MMP-9-aktivitet i ACP02 jämfört med ACP03 celler. Dessa resultat bekräftar att ACP02 celler har större invasion kapacitet än ACP03 celler.
Slutsats
Sammanfattningsvis kan FBXW7 och MYC mRNA spela en roll i aggressivt biologiska beteende gastric cancerceller och kan vara en användbar indikator på dålig prognos. Dessutom är MYC ett mål kandidat för nya behandlingar mot magcancer.
Nyckelord
Magcancer MYC FBXW7 TP53 Bakgrund
Gastric cancer (GC) är den fjärde vanligaste cancerformen och den näst vanligaste orsaken till cancerdöd worldwide [1]. GC anses ett stort folkhälsoproblem, särskilt i utvecklingsländerna, inklusive Brasilien [2]. Review, en grundläggande aspekt av cancer är okontrollerad celltillväxt till följd av ansamling av förändringar som främjar uttryck eller undertryckandet av cellcykelkontrollgener [3]. MYC
är en transkriptionsfaktor inblandad i cellcykelreglering och celltillväxtstopp som ofta är avreglerad i cancer och har beskrivits som en viktig del av gastric cancer [4, 5]. Flera olika typer av posttranslationella modifieringar av MYC har beskrivits, inklusive fosforylering, acetylering, och ubikvitinering [6]. Ubiquitin-proteasom-systemet är den huvudsakliga proteinnedbrytning reglerande reaktionsvägen involverat i celldifferentiering och tillväxtkontroll [7]. FBXW7
kodar en F-box-proteinet subenheten av Skp1 /Cul1 /F-box-komplexet (SCF) ubiquitin ligas komplex. SCF FBXW7 inducerar nedbrytning av produkterna av positiva cellcykelregulatorgener, såsom cyklin E
, MYC
, NOTCH
, och juni
, genom fosforylering beroende ubikvitinering [8]. Bland SCF FBXW7 substrat, är MYC av särskild betydelse i cellcykeln utgång eftersom det är tänkt att spela en roll för att avgöra om däggdjursceller delar eller inte [9].
Avreglerade FBXW7
uttryck är en viktig orsak av cancer [10-12]. Förlust av FBXW7
uttryck kan leda till MYC uttryck och har associerats med dålig prognos i GC patienter [13]. Men MYC aktivering av FBXW7
förlust utlöser aktivering av p53, som spelar en nyckelroll i regleringen av cellulära svar på DNA-skada och onormalt uttryck av onkogener. Induktion av cellcykelstopp av p53 möjliggör DNA-reparation eller apoptos induktion [14]. Således är det nödvändigt åtföljande förlust av FBXW7 Mössor och TP53
att framkalla genetisk instabilitet och tumörbildning [11].
I den aktuella studien undersökte vi MYC
, FBXW7
och TP53
genkopietalet variation och mRNA och proteinuttryck i GC prover och gastriska adenokarcinom cellinjer. Möjliga associationer mellan våra resultat och kliniskt patologiska egenskaper och /eller invasion och migration förmåga cellinjerna utvärderades också.
Metoder
kliniska prover
Prover erhölls från 33 GC patienter som genomgick kirurgisk behandling vid João de Barros Barreto Universitetssjukhuset i Pará State, Brasilien. Dissekerade tumör och parade icke-neoplastiska vävnadsprover omedelbart skära från magen och frystes i flytande kväve tills RNA-extraktion. Sälja The kliniskt patologiska funktioner i patientprover visas i tabell 1. GC prover klassificerades enligt Lauren [15] . Alla GC prover visade närvaron av Helicobacter pylori
och cagA virulensfaktorn bestämdes genom PCR-analys av urea
och cagA
såsom beskrivits av Clayton et al
. [16] och Covacci et al.
[17], respektive. Alla patienter hade negativa historia av exponering för antingen kemoterapi eller strålbehandling före operation, och det fanns inga andra co-förekomster av diagnostiserade cancer. Informerat samtycke med godkännande av den etiska kommittén i den federala universitetet i Pará var obtained.Table en MYC, FBXW7 och TP53 genkopietal variation MYC och p53 proteinuttryck och kliniskt patologiska egenskaper hos 33 GC patienter
CNV MYC
vid CNV FBXW7
CNV TP53
IHC MYC
IHC p53
2 kopior (n = 16)
≥ 3 kopior (n = 17)
p- värde
2 kopior (n = 18)
en kopia (n = 15)
p- värde
2 kopior (n = 25)
en kopia (n = 7)
p - värde
P (n = 19)
N (n = 14)
p- värde
P (n = 6)
N (n = 25)
p- värde
Ålder (y) (medelvärde ± SD) Hotel & gt; 50 (65,3 ± 9.1)
7
12
0.166
12
7
0.304
15
3
0.393
10
4
0.310
5
9
0.094
≤50 (42,1 ± 8,2) katalog 9
5
6
8
10 4
10
9 2
17
Kön
Male
8
7
0.437
7
8
1.000
13
1
0.104
12
3
0.072
2
13
0.413
Female
8
10
8
10
12
6
8
10
5
13
Histopatologi
Intestinal
12
10
0.465
12
10
1.000
16
6
0.387
17
5
0.009*
6
16
0.378
Diffuse
4
7
6
5
9 1
3
8 1
10
djup tumörinvasion
T1
3
3
1.000
5
1
0.186
5
1
1.000
2
4
0.182
1
5
1.000
T2-T4
13
14
13
14
20
6
18
9
6
21
Lymfkörtel metastaser
Absent
5
8
0.481
8
5
0.722
10
3
1.000
7
6
0.717
2
11
0.676
Present
11
9
10
10
15 4
13
7
5
15
Stage
I-II
8
10
0.732
12
6
0.170
14
3
0.678
12
6
0.493
3
15
0.674
III-IV
8
7
6
9
11 4
8
7 4
11
MYC IHC
Negativ
5
8
0,481
7
6
1,000
11 2
0,671
Positiv
11
9
11
9
14
5
p53 IHC
Negativ
14 12
0,398
14 12
1,000
21 4
0,157
positiv
2 5 4
3 4
3
* p Hotel & lt; 0,05; P: positiv; N:. negativ
cellinjer
Gastric adenokarcinom-cellinjer ACP02 och ACP03 [18] odlades i fullständigt RPMI-medium (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% penicillin /streptomycin och 1% kanamycin.
Kopiera nummer variation (CNV) Review DNA extraherades med användning av en DNAQiamp mini kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) enligt tillverkarens instruktioner. Duplex kvantitativ realtids-PCR (realtids qPCR) utfördes med användning FAM /MGB-märkt TaqMan-prober för MYC
(Hs01764918_cn), FBXW7
(Hs01362464_cn) eller TP53
(Hs06423639_cn), och VIC /TAMRA-märkt TaqMan CNV RNAs P
(# 4.403.326) användes för den interna kontrollen. Alla realtid qPCR reaktioner utfördes fyrfaldigt med gDNA enligt tillverkarens protokoll med hjälp av en 7500 Snabb realtids-PCR-system (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Kopieantalet för varje prov uppskattades genom CNV-analys med användning Kopiera Caller Software V1.0 (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Känd human genomisk DNA (Promega, Madison, USA) användes för kalibrering.
Kvantitativ realtids-omvänt transkriptas-PCR
Totalt RNA extraherades med TRI-reagens ® Solution (Life Technologies, Carlbad, CA, USA ) genom att följa tillverkarens instruktioner. RNA-koncentrationen och kvalitet bestämdes med användning av en Nanodrop spektrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) och 1% agarosgeler. Komplementärt DNA (cDNA) syntetiserades med användning av en hög kapacitet cDNA Arkiv kit enligt tillverkarens rekommendationer (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Realtids qPCR primers och TaqMan prober som riktar MYC
(Hs00153408_m1), FBXW7
(Hs00217794_m1) och TP53
(Hs01034249_m1) köptes som analyser-on-Demand Produkter för Gene Expression ((Life Technologies, . Foster City, CA, USA) Realtids qPCR utfördes med användning av en ABI Prism 7500-systemet (Life Technologies, Foster City, CA, USA) enligt tillverkarens anvisningar GAPDH
(NM_002046.3;. Life Technology, USA) valdes som en intern kontroll för att övervaka RNA ingång och omvänd transkription effektivitet. All realtid qPCR reaktioner för målgener och interna kontroller utfördes i tre exemplar på samma platta. den relativa kvantifiering (RQ) av genuttryck beräknades med hjälp av ΔΔCt metod [19], i vilken den icke-neoplastisk prov betecknades som en kalibrator för varje parad tumörprov.
Immunohistokemi
Immunohistokemisk analyser~~POS=HEADCOMP för MYC och p53 utfördes på formalinfixerade, paraffininbäddade kirurgiska sektioner. Serie 3-ìm sektioner användes. Värmeinducerad antigenåtervinning användes (mikroprocessorstyrd tryck Pascal ® DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). En universal peroxidaskonjugerad sekundär antikropp kit (LSAB System, Dako, Carpinteria, CA, USA) användes för detektion med diaminobensidin (DAB) som kromogen. Följande primära antikroppar användes: mus monoklonala antikroppar riktade mot MYC (utspädning 1: 150, SC-40, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA och klona 9E10, Zymed ®, San Francisco, CA, USA) , FBXW7 (utspädning 1:50, Abnova Corp., Taipei, Taiwan), och p53 (utspädning 1:50; Dako, Carpinteria, CA, USA). Positiv proteinexpression definierades som tydlig nukleär färgning i mer än 10% av cellerna.
Migration och invasionsanalys
Migration och invasionsanalyser utfördes i en modifierad Boyden-kammare med filterinsatser (8-xm porer) för 12-brunnsplattor (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). För att bedöma invasion, var filter belagda med 10 pl Matrigel (10-13 mg /ml) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) medan på is. Celler (2 x 10 5) pläterades i den övre kammaren i 1 ml RPMI utan FBS. Den undre kammaren fylldes med 1,5 ml av RPMI med FBS. Efter 48 h i odling fixerades cellerna med 4% paraformaldehyd och post-fixerades med 0,2% kristallviolett i 20% metanol. Celler på den övre sidan av filtret, inklusive de i Matrigel, avlägsnades med en bomullspinne. Invaderande cellerna (på den nedre sidan av filtret) fotograferades och räknades. Experiment utfördes i tre exemplar.
Immunofluorescens
Celler odlade på täckglas av glas fixerades med 1% paraformaldehyd i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) under 10 minuter, därefter permeabiliserades med 0,5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) i PBS under 15 min och blockerades med 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS. Cellerna färgades med mus-antikroppar mot MYC (utspädd 1:50; Zymed ®, USA), p53 (utspädd 1:50; Dako, Carpinteria, CA, USA), och FBXW7 (utspädd 1:50; Abnova Corp ., Taipei, Taiwan). Primära antikroppar avslöjades med användning av en anti-mus Alexa-568-konjugerad sekundär antikropp (Invitrogen). Alla inkubationer utfördes i 60 min vid rumstemperatur. Kärnor färgades med DAPI i Förläng anti-fade monteringsmedium (Invitrogen). Negativa kontrollprover bearbetades enligt beskrivning ovan med undantag av att primära antikroppar utelämnades och ersattes med enbart PBS.
Western blotting
Protein extraktion från celler utfördes enligt standardförfaranden. I korthet framställdes totalt protein extraherat från ACP02 och ACP03 celler med användning av 50 mM Tris-HCl-buffert innehållande 100 mmol /l NaCI, 50 mM NaF, 1 mM NAVO 4, 0,5% NP-40, och fullständig proteasinhibitorcocktail (Roche , Tyskland). Proteinkoncentrationen uppskattades med användning av en Bradford-analys (Sigma-Aldrich). Ca 30 ^ g av totalt protein extraktet laddades på en 12% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) -gel och elektrofores. Lösta proteiner överfördes därefter från gelén till ett nitrocellulosamembran. Membranet blockerades med 5% fettfri mjölk i Tris-buffrad saltlösning innehållande 5% Tween (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA) och inkuberades sedan med monoklonal mus-anti-MYC (Santa Cruz Biotechnology), anti-FBXW7 (Abnova , Taipei City, Taiwan), anti-p53 (DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA), och anti-β-aktin (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA) antikroppar utspädda 1: 200, 1: 100, 1: 100, och en: 2000, respektive. Därefter inkuberades membranen med en 1: 5000 utspädning av pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerad får-anti-mus-antikropp (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) under 1 h vid rumstemperatur. Proteiner visualiserades genom förstärkt kemiluminescens.
Zymografi
ACP02 och ACP03-celler (5 x 10 4 av varje) utströks och tilläts att vidhäfta och sprida sig i minst 8 timmar. Vidhäftande celler tvättades tre gånger med PBS, och odlingsmediet ersattes med serumfritt medium under 24 h. Aktiviteten av MMP2 och MMP9 i det konditionerade mediet bedömdes genom zymografi. Konditionerat medium samlades upp, koncentrerades (Microcon 30 K, Merck Millipore, Darmstadt, Tyskland) och återsuspenderades i SDS-PAGE-provbuffert (utan β-merkaptoetanol). De återstående cellerna lyserades och proteinkoncentrationen uppskattades med användning av en BCA-analys (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA). Totalt 1