Prognostic effekterna av att upptäcka livsdugliga cirkulerande tumörceller i gastric cancerpatienter med hjälp av en telomeras-specifika virus agent: en prospektiv study

prognostisk effekt för att detektera livsdugliga cirkulerande tumörceller i gastric cancerpatienter med hjälp av en telomeras-specifika virus agent: en prospektiv studie Bild Sammanfattning
bakgrund
identifieringen av cirkulerande tumörceller (CTCs) i perifert blod är en användbar metod för att uppskatta prognos övervaka sjukdomsförloppet, och mäta behandlingseffekter i olika maligniteter. Dock är den kliniska relevansen av CTCs kontroversiell. Vi försökte att upptäcka livskraftiga CTCs i perifert blod av gastric patienter som använder en telomeras-specifika virus agent cancer.
Metoder
vi tog en 7,5 ml blodprov från 65 patienter med ventrikelcancer behandlings negativa före operation och 10 friska frivilliga. Vi detekterade viabla CTCs i blodprover efter att inkubera dem med en telomeras-specifika, replikation-selektiva, onkolytiska adenovirala medlet som bär det grönt fluorescerande protein (GFP) -genen (OBP-401). GFP-positiva CTC definierades som har en diameter på åtminstone 7,735 pm; denna tröskel bestämdes av mottagaren kurvan analys. GFP-positiva celler räknades under ett fluorescensmikroskop.
Resultat
Det var en signifikant skillnad i total överlevnad bland patienterna med 0-4 och de med ≥5 GFP-positiva CTCs i steg I-IV sjukdomsgrupp och steg II-IV avancerade sjukdomsgrupp. Antalet GFP-positiva CTC var inte relaterad till cancer stadium. Bland de patologiska fynd, antalet GFP-positiva CTC endast signifikant relaterade till venös invasion, även om det fanns tendenser till mer GFP-positiva CTCs med sjukdomsprogression (tumördjup, lymfkörtel metastas, fjärrmetastaser, lymfatisk invasion och histologiska typ slutsatser
).
det fanns ett signifikant samband mellan antalet GFP-positiva CTCs och total överlevnad hos patienter med magcancer. Detektering av CTCs använder OBP-401 kan vara användbara för prognostisk utvärdering.
Trial registrering
University Hospital Medical Information Network i Japan, UMIN000002018.
Nyckelord
Cirkulerande tumörceller Magcancer Telomeras Bakgrund
avlägsna metastaser av en fast tumör är en stark prognostisk faktor [1-3]. Förekomsten av cirkulerande tumörceller (CTCs) i perifert blod tyder på att en patient är i en systemisk fas sjukdom [4]. Identifieringen av CTCs i perifert blod är en användbar metod för att uppskatta prognos övervaka sjukdomsförloppet, och mäta behandlingseffekter i bröst, prostata, hud, kolon och gastrointestinala maligniteter. Därför har olika metoder utvecklats för att detektera CTCs, och används ibland i kombination. Vanliga tekniker för anrikning och detektion av CTC är densitetsgradient separation [5], direkt anrikning genom filtrering [6, 7], immunmagnetisk separation [8], flödescytometri [9], i realtid RT-PCR (RT- PCR) [10, 11] och mikrochip teknik [12].
Cell anrikning genom densitetsgradient separation utförs med användning av kommersiella kit såsom OncoQuick® (Greiner, Frickenhausen, Tyskland) [13] och Lymphoprep (Nycomed, Oslo , Norge) [14]. Densitetsgradient separation är baserad på teorin att olika typer av celler kan separeras i enlighet med deras densitet. Därför är det svårt att extrahera alla CTCs på grund av cellmigration. RT-PCR är en av de vanligaste metoderna för tumördetektionscellen på grund av dess höga känslighet och specificitet, under antagande av lämplig primer och sond design. Emellertid kan falskt positiva resultat uppstå på grund av dess tekniska delikatess och hög känslighet [15, 16].
Immunomagnetiska cell anrikning, såsom den som utförs av CellSearch System (Veridex, LLC, Raritan, NJ, USA) [ ,,,0],17], är för närvarande den mest använda tekniken för att berika och upptäcka CTCs [18-21]. Fördelen med immunmagnetisk cellseparation är att CTCs kan visualiseras med en fluorescerande mikroskop. Celler som upptäcks med antikroppar mot epiteliala markörer (epitel celladhesionsmolekyler, EpCAMs) är fast beslutna att vara CTC. Därför kan denna teknik ge falskt positiva resultat baserade på normal epitel markör uttryck av icke-tumörceller, och falskt negativa resultat kan uppstå baserat på bristen på selektiva markör uttryck på tumörceller. Som en följd av de begränsningar som är förknippade med ovanstående metoder behövs en ny teknik för att upptäcka livskraftiga CTC exakt.
Telomeras spelar viktiga roller i cancer, cancer invasion och metastas [22-24]. Vi har utvecklat en teknik för att utnyttja hög telomerasaktivitet i cellerna. Denna teknik använder en telomeras-specifika, replikering selektivt modifierad viralt medel (OBP-401; TelomeScan®, Oncolys BioPharma, Tokyo, Japan), i vilken humant telomeras omvänt transkriptas (TERT
) genpromotor är insatt i E1-regionen och den gröna fluorescerande protein (GFP) -genen placeras under kontroll av cytomegalovirus-promotorn i E3-regionen som en markör av viral replikation [25]. Det har rapporterats att OBP-401 kan användas för att detektera viabla CTCs bland normala blodceller [26, 27].
Här tillämpade vi analysen för att detektera viabla CTCs med potential för metastas i gastric cancerpatienter. Vi upptäckt GFP-positiva CTC. Däremot är det möjligt att icke-cancerceller avger GFP fluorescens efter OBP-401-infektion [28]. Därför valde vi celler större än ett tröskelvärde bestäms genom jämförelse mellan friska frivilliga försökspersoner och patienter, eftersom CTC är större än normala blodceller [7, 29, 30]. . Vi studerade föreningen av GFP-positiva CTC nummer med överlevnad och patologiska index för sjukdomsprogression
Metoder
Patienter och friska försökspersoner sälja The patienter inkluderade i denna förstudie var som genomgår planerad kirurgisk behandling; patienter som var lämpliga för endoskopisk mukosaresektion eller endoskopisk submukosala dissektion uteslöts. Inklusionskriterierna var: (i) histologiskt verifierad adenokarcinom i magen genom endoskopisk biopsi; (Ii) klinisk ensam tumör; (Iii) ingen tidigare endoskopisk resektion, kemoterapi eller strålbehandling; (Iv) ålder 20-80 år; (V) Eastern Cooperative Oncology Group performance status [31] 0 eller 1; (Vi) tillräcklig organfunktion; och (vii) skriftligt informerat samtycke. Uteslutningskriterierna var: (i) synkron eller metachronous malignitet; (Ii) gravida eller ammande kvinnor; (Iii) aktiv eller kronisk viral hepatit; (Iv) aktiv bakteriell infektion eller svampinfektion; (V) diabetes mellitus; (Vi) systemisk administrering av kortikosteroider; och (vii) instabil hypertension. Sjukdomen skede i patienter patologiskt kännetecknas med hjälp av den sjunde upplagan av TNM klassificeringen av den internationella unionen mot cancer [32]. Djupet av tumören hos tre patienter utan gastrektomi och den regionala lymfkörtelstatus för fem patienter utan tillräcklig lymfkörtlar diagnostiserades kirurgiskt.
Samtliga patienter deltog vårt sjukhus regelbundet efter operationen, och kontrollerades var 3 månader. Patienterna genomgick också endoskopi och datortomografi minst en gång per år, beroende på deras sjukdomsstadium och kurs.
Vi rekryterade också friska frivilliga för att fungera som kontroller. Alla friska frivilliga var anställda av Sysmex Corporation och ingår sju män (medelålder 31,4 år, intervall 24-39 år) och tre kvinnor (medelålder 33,7 år, range 26-48 år). Alla volontärer gick hälsokontroller vid anställning och årligen; check-ups ingår medicinska intervjuer, auskultation, bröst röntgen och blod och urinanalyser. Dessutom utförde vi enskilda intervjuer före provtagning, Alla volontärer som var närvarande får medicinsk behandling, gravida eller ammar, eller som hade donerat inom den senaste månaden blod uteslöts.
Virus
OBP-401, en telomeras-specifik, replikations selektiv adenoviral medel där TERT
promotorelement driver uttrycket av EIA
och EIB
gener, och in i vilken GFP-genen är integrerad, användes i denna studie. Känslighet och specificitet för analysen med hjälp av OBP-401 har tidigare studerats av Kim et al. [27]. Testet upprepades fem gånger testa i provet, inklusive en MDA-MB-468 (bröstkarcinom) celler och 7,5 ml blod, och antalet GFP-positiva celler var 1, 1, 1, 2 och 3; i provet, inklusive 20 MDA-MB-468 (bröstkarcinom) celler, antalet GFP-positiva celler 15, 17, 19, 22 och 24. Virus prover vid -80 ° C.
cellinjer och kultur
A549 (lungcancer), HepG2 (hepatocellulär cancer), var HEC-1 (endometrial adenokarcinom), KATO-III (magsäckscancer), och SBC-3 (småcellig lungcancer) cellinjer som erhållits från Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan). LNCaP (prostata adenokarcinom) och OVCAR-3 (äggstockscancer) cellinjer erhölls från Riken Cell Bank (Tokyo, Japan). Cellerna odlas enligt leverantörens specifikationer. MDA-MB-468-celler odlades såsom beskrivits tidigare [27].
Förberedelse och cellräkning Review, en 7,5-ml prov av perifert ven blod Prov erhölls från varje patient före operation och från varje frivillig. Proven drogs i rör innehållande citronsyra, fosforsyra, och dextros, och lagrades vid 4 ° C. Analysen startades inom 48 h.
Proven centrifugerades under 5 min vid 540 g och plasman fasen avlägsnades. Cellerna tvättades sedan fyra gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och två gånger med Roswell Park Memorial Institute medium. Proverna infekterades med 4 x 10 8 plackbildande enheter (PFU) av OBP-401 virus genom inkubation i mediet i 24 timmar vid 37 ° C.
Efter döda cellfärgning av den röda-fluorescerande reaktiv färgämne L23102 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA), OBP-401 virus inaktiverades och cellerna fixerades med 2% paraformaldehyd (PFA) under 20 min vid rumstemperatur.
proverna behandlades med ett ytaktivt medel (Emalgen 2025 G; Kao Chemicals, Tokyo, Japan) under 10 min vid 40 ° C för att bryta ned röda blodkroppar. Slutligen tillsattes 7,5 ml blod som används för att skapa två glasskiva prover för mikroskopisk analys. Alla GFP-positiva celler på de två objektglas räknades, med användning av en datorstyrd fluorescensmikroskop (IX71; Olympus, Tokyo, Japan) och en prövare förblindade till prov detaljer. Den totala analystiden var 27,5 timmar (figur 1). Figur 1 Protokoll och procedur för "GFP-CTC-analys". Varje 7,5 ml prov av perifert ven blod erhölls från patienter före operation och från frivilliga. Proven drogs i rör innehållande citronsyra, fosforsyra och dextros. Proverna centrifugerades och plasman fasen avlägsnades. Efter celltvätt genom användning av PBS och Roswell Park Memorial Institute medium, proverna infekterade med 4 x 108 PFU av OBP-401-virus. OBP-401-viruset inaktiverades och cellerna fixerades med 2% paraformaldehyd (PFA). Proven behandlades med ett ytaktivt medel för att bryta ned röda och vita blodkroppar. Två glasskiva prover från 7,5 ml blod bereddes för mikroskopisk analys. Alla GFP-positiva celler på de två objektglas räknades med användning av ett datorstyrt fluorescerande mikroskop.
Bestämning av GFP fluorescens intensitetströskel
Tröskeln för GFP fluorescensintensitet bestämdes enligt följande. Cirka 30000 odlade celler spikades i 7,5-ml blodprover från friska frivilliga, vilka spetsades med olika cancercellinjer: A549, HepG2, HEC-1, KATO-III, SBC-3, LNCaP, MDA-MB-MB468 och OVCAR -3. Blodprover utsattes för CTC detektionsanalys, och sedan detekterbara celler räknades med fluorescensmikroskopi. Mer än 100 celler analyserades i varje prov. Vi bestämde 2,85 × 10 7 betyda ekvivalent fluorokrom att vara tröskelvärdet för GFP-signal intensitet från den minimala GFP intensitetsnivån observerades i blodet prover spetsade med cellinjerna (figur 2). Data rapporteras som antalet GFP-positiva CTCs per 7,5 ml perifert blodprov. Figur 2 GFP signalintensiteter från olika cancercellinjer. Botten och toppen av lådan är de nedre och övre kvartiler, och bandet av lådan är medianen. Linjerna på slutet av whiskers är minimum och maximum. Y-axeln representerar GFP signalintensitet på en log-skala
Immunfärgning
Phycoerythrin-märkt anti-human CD45-antikropp (BioLegend, San Diego, CA, USA) späddes 1:. 5 och Pacific Blue-märkt anti-human CD326 (EpCAM) antikropp (BioLegend) späddes 1:10 i PBS innehållande 2% fetalt bovint serum. Celler inkuberades med utspädda antikroppar under 30 min vid 25 ° C. Efter tvättning med PBS innehållande 2% fetalt bovint serum, ades celler monterade på objektglas och analyserades med användning av ett fluorescensmikroskop. (IX71; Olympus) Review Statistisk analys
Statistisk analys utfördes med användning av JMP Statistisk Discovery 9.0.2 (SAS Institute, Cary, NC, USA). För att bestämma tröskelvärdet för cellen diameter, de detekterade GFP-positiva CTC analyseras med hjälp av en mottagare som arbetar karakteristiska (ROC) kurvan mellan proverna från mag cancerpatienter och de från frivilliga. För flera gruppjämförelser, var homogenitet av varians bedömas av Levene-test. För parametriska jämförelser använde vi variansanalys, och för icke-parametriska jämförelser vi använt Wilcoxon och Kruskal-Wallis test. Vi använde Fishers exakta och χ
2 tester med en 2 x 2 och en 4 x 2 bord, respektive, att jämföra kliniskt patologiska tecken i patientgruppen. Kaplan-Meier kurvor för beräknad sjukdomsfri överlevnad och total överlevnad genererades, och jämförelser mellan grupperna utfördes med användning av en dubbelsidig log-rank test. P
värden ≤0.05 ansågs statistiskt signifikant.
Studien godkändes av Institutional Review Board i Showa University, Norra Yokohama sjukhus. Vi förklarade studieprotokollet till patienter och frivilliga innan de gav skriftligt informerat samtycke. Denna studie registrerades med University Hospital Medical Information Network i Japan, nummer 000002018.
Resultat
Deltagare egenskaper sälja Sextiofem patienter med magcancer (46 män och 19 kvinnor, medelålder 58,8 år, intervall 33 -76 år) som genomgick kirurgi vid Digestive Disease Center i Showa University Northern Yokohama Sjukhuset mellan september 2009 och maj 2011 ingick i denna studie. Tjugonio hade distala gastrektomi, 32 hade total gastrektomi, och fyra hade explorativ laparotomi. Patienternas egenskaper sammanfattas i tabell 1. Tjugoåtta av de 65 patienter fick kemoterapi efter kirurgi. Kontrollgruppen bestod av 10 friska volunteers.Table 1 Patient egenskaper och patologiska fynd
Parametrar
Antal patienter
Sex
Man
46
Kvinna
19
Age (medelvärde, intervall) katalog 58,8, 33-76
Gastrectomy
Distal
29
Totalt
32
Inga 4
Kirurgisk tillvägagångssätt
laparoskopi
54
Öppna laparotomi
11
härdbarhet
R0
57
R1
0
R2
8
TNM stadium
i
40
II
6
III
10
IV
9
tumör~~POS=TRUNC invasion
T1
36
T2
8
T3
9
T4
12
Lymfkörtel metastaser
N0
39
N1
5
N2
6
N3
15
fjärrmetastaser
M0
56
M1
9
Huvud histologiska typ †
differentierade
25
Odifferentierad
40
lymfatiska invasion
LX 4
L0
35
L1
26
Venös invasion
VX 4
V0
35
V1-2
26
† väl eller måttligt differentierade adenokarcinom och papillär adenokarcinom kategoriserades som differentierade typ. Signet-ring cellscancer, dåligt differentierade adenokarcinom och mucinöst adenokarcinom kategoriserades som odifferentierad typ.
GFP-positiva CTCs i perifert blod
Med användning av en fluorescensmikroskop, celler med fluorescensemissioner ≥2.85 × 10 7 betyder ekvivalent fluorokrom räknades som GFP-positiva celler
Olika storlekar av GFP-positiva celler observerades i varje prov. Därför var det svårt att identifiera en representativ cell bland de GFP-positiva celler för jämförelse mellan patienter och friska försökspersoner. Därför, för att undvika att använda ett godtyckligt värde, vi bestämde oss för att använda den optimala tröskeln härrör från ROC analys baserad på cellstorlek, det vill säga 7,735 pm, eftersom tröskeln för att definiera GFP-positiva CTC (Figur 3). Figur 3 Jämförelse av celldiameter mellan patienter och frivilliga. För att bestämma tröskelvärdet, jämförde vi diametrarna hos celler från gastric cancerpatienter och kontroller ROC-analys. Det fanns en signifikant skillnad mellan de gastric cancerpatienter och kontrollerna (p Hotel < 0,001; arean under kurvan = 0,57; 95% konfidensintervall = 0,54-0,60) Musik av immunhistokemisk färgning med användning av anti-EpCAM och. anti-CD45-antikroppar, bekräftade vi att GFP-positiva CTCs var EpCAM-positiva och CD45-negativa (Figur 4). Figur 4 Exempel på mikroskopiska bilder. Bilderna från två magcancer prover av GFP-positiva CTCs och immunocytokemisk analys av anti-EpCAM- och anti-CD45-positiva celler. Celler räknades med användning av ett datorstyrt fluorescensmikroskop av en examinator förblindade till provstatus. Skala bar, 10 mikrometer.
Antalet GFP-positiva CTCs i de perifera blodprover visas i figur 5. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan de upptäckt andelen GFP-positiva CTCs i proven som representerar varje cancer stadium. Figur 5 Antal GFP-positiva celler. Prickarna är antalet GFP-positiva CTCs i patientprover. Botten och toppen av lådan representerar de nedre och övre kvartiler, och bandet över rutan visar medianen. De nedre och övre stänger vid ändarna av morrhåren visar lägsta datapunkt inom 1,5 interkvartila intervall av lägre kvartilen, och den högsta datapunkt inom 1,5 interkvartila intervall i den övre kvartilen, respektive. De gröna staplarna anger medelvärdet.
Association of GFP-positiva CTCs med överlevnad
genomsnittliga antalet GFP-positiva CTCs i proverna från 10 friska frivilliga försökspersoner var 4,8. Vi delade patienterna i två grupper baserat på antalet GFP-positiva CTC: 0-4 och ≥5. De kliniskt patologiska egenskaper hos de två grupperna är sammanfattade i tabell 2. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan de två grupperna, förutom att det fanns bara en kategori av lymfatiska metastasis.Table 2 kliniskt patologiska tecken av två patientgrupper med antalet CTCs
Antal CTCs
0-4
5 ≤
P
värde
Antal försöks
41

24
TNM: Stage
0,1586
Steg I
29 11
Steg II 4
2 Review Steg III
4
6
Steg IV 4
5
TNM: T kategori
0,2753
T1
26
10
T2

5 3
T3
5 4
T4
5
7
TNM: N kategori
0,0257 *
N0
27
12
N1
5
0
N2
4 2
N3
5
10
TNM: M kategori
0,2121
M0
37
19
M1
4 5
Huvud histologiska typ
0,6844
Differentierad typ
15
10
odifferentierad typ
26
14
lymfatiska invasion
0,3177
Lx
2 2
L0
25
10
L1

14 12
Venös invasion
0,1293
Vx 2
2 Review V0
26 9
V1-2
13
13
kirurgi
0,2124
kurativ resektion
38 19
Icke-läkande resektion 1
3
Ingen resektion 2
2 Review Postoperativ kemoterapi
0,1672
närvaro
15
13
Frånvaro
26
11
* * Signifikant skillnad.
Figur 6a visar Kaplan -Meier kurvor för total överlevnad i två grupper: patienter med 0-4 CTCs och de med ≥5. Det fanns en signifikant skillnad mellan de två grupperna (p
= 0,0021). Vidare i de avancerade gastric patienter med stadium II-IV sjukdom cancer, det fanns en signifikant skillnad mellan de två grupperna (p
= 0,0126) (Figur 6b). Figur 6 Total överlevnad. (A) Överlevnad av alla patienter. (B) Total överlevnad av patienter med stadium II-IV sjukdom. Överlevnad jämfördes i enlighet med antalet av CTCs som använder Kaplan-Meier-analys och de log-rank-statistik. ** P Hotel < 0,01, * p Hotel < 0.05.
Association of GFP-positiva CTCs med patologiska index
Det fanns inget signifikant samband mellan antalet GFP-positiva CTCs och cancer stadium (p
= 0,2313) (Figur 5). Även om ingen statistisk signifikans observerades antalet GFP-positiva CTC tenderade att öka med utvecklingen av den primära tumören (p
= 0,1521) (Figur 7a). Antalet CTCs i proven från Nod-positiva patienter var större än den i nod-negativa patienter (p
= 0,1752) (figur 7b). Jämfört med patienter utan metastaser, de med fjärrmetastaser hade liknande antal GFP-positiva CTC (p
= 0,5655) (Figur 7C). Det var inte en signifikant skillnad mellan den differentierade och odifferentierade typ (p
= 0,8387) (Figur 7d). Antalet CTCs liknade i proverna från patienter med och utan lymfatisk invasion (p
= 0,2054) (Figur 7e). För venös invasion, antalet CTCs i proverna från patienter med invasion var betydligt högre än hos patienter utan invasion (p
= 0,0351) (Figur 7F). Figur 7 Förhållande mellan antal GFP-positiva CTCs i ett 7,5-ml blodprov från gastric cancerpatienter och patologiska fynd i patienterna. Prickarna är antalet GFP-positiva CTCs i patientprover. Botten och toppen av lådan representerar de nedre och övre kvartiler, och bandet över rutan visar medianen. De nedre och övre stänger vid ändarna av morrhåren visar lägsta datapunkt inom 1,5 interkvartila intervall av lägre kvartilen, och den högsta datapunkt inom 1,5 interkvartila intervall i den övre kvartilen, respektive. a, tumör- invasion djup (T1-T4 indikerar ökande djup). B, lymfatisk metastas (N0 = negativt, N1-3 = positiv). c, fjärrmetastaser (M0 = negativt, M1 = positiv). d, Histologisk typ (differentierad typ och odifferentierad typ). e, lymfatisk invasion (L0 = negativt, L1 = positiv). f, venös invasion (V0 = negativt, V1 = positiv), * p Hotel < 0,05. Även om endast venös invasion visade en statistiskt signifikant skillnad fanns det vissa tendenser till en ökning av CTC antal med ökande sjukdomsprogression.
Diskussion Review, är detta papper rapporterar korrelationen mellan CTC och magcancer, som är den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i världen. Nyttan av att upptäcka CTCs vid diagnos, uppskattning av prognosen, och utvärdering av behandlingseffekter har redan rapporterats för bröst [27, 33], prostata [34], lunga [35] och mag-tarmkanalen [11, 36, 37 ] cancrar. Denna studie visar att det är också användbart för magcancer.
En stor resultatet av vår studie var en signifikant samband mellan antalet CTCs och prognos. Även om vi använde en kort uppföljningsperiod, prognosen för patienter som hade ≥5 CTCs i sina 7,5 ml perifera blodprover var dålig. Patienter med tidiga sjukdomsstadier har i allmänhet en lägre återfallsfrekvens [38], och de med steg I sjukdom hade faktiskt ingen återfall i vår studie. Vi räknade också överlevnaden hos patienter med avancerad magsäckscancer med stadium II-IV sjukdom, och visade att dessa patienter hade en liknande överlevnadsmönster dem med stadium I-IV sjukdom. Dessa resultat tyder på att preoperativ kemoterapi eller omfattande behandling är lämplig för patienter framskriden sjukdom som har många CTCs i förbehandlings prover på grund av deras dålig prognos.
Bland våra patologiska fynd, endast venös invasion hade ett signifikant samband med antalet CTCs. Detta tyder på avtal mellan traditionell patologi och modern molekylärteknik. Vi tror att avsaknaden av en betydande skillnad mellan antalet CTCs upptäckts av vår analys och andra patologiska index kan förklaras av metodfrågor såsom litet urval. Vår teknik fungerade väl som en prognostisk utvärderingsverktyg - att ge information om behovet av postoperativ adjuvant terapi - och det kan ge ett användbart hjälpverktyg för patologi-baserad klassificering
Det är inte klart om alla upptäckta CTC har metastatisk potential.. Livskraftiga CTCs upptäcktes i proven från cancerpatienter tidigt skede i den aktuella studien, men nästan alla grupp patienter steg I överlevde utan återfall [38]. Vi har för avsikt att bekräfta om resistenta cancerceller, som cancerstamceller, var närvarande i de detekterade GFP-positiva celler. Dessutom kommer vi att analysera funktioner livskraftiga CTC individuellt efter cellsortering, och identifiera CTC med metastatisk potential genom att använda ytterligare verktyg såsom DNA ploidi analys [39, 40]. Dessutom kommer profilering av genuttryck hos livskraftiga CTCs, döda celler, primära tumörer och metastatiska tumörer avslöjar viktig information om mekanismerna för cancermetastaser.
Våra resultat ska tolkas med viss försiktighet, med tanke på de begränsningar av denna studie. Först, antalet CTCs varierade kraftigt mellan individer, inklusive patienter och friska försökspersoner. Dessutom var det inte påverkas av tumörstadium eller närvaron av kliniskt detekterbara metastaser. Likaså fanns det inget samband mellan förekomsten av metastaser (lymfkörtel eller avlägsen) eller invasion och antalet CTCs, vilket innebär ett ifrågasättande av användning av CTCs att förutsäga metastaserande potential. Det är emellertid möjligt att det relativt lilla urvalet begränsat potentialen att urskilja verkliga skillnader mellan dessa grupper av patienter. Slutligen måste det erkännas att våra resultat är endast för preoperativ, behandlingsnaiva magsäckscancer och bör inte generaliseras till andra typer av cancer.
Uppenbart att fler studier i en större population av patienter, och med olika cancertyper , behövs för att klargöra den kliniska tillämpbarheten CTC detektering. Vi förbereder nu en studie för att undersöka effekterna av magcancer behandling om antalet CTCs, vilket bör bidra till att fastställa deras relation med framtida sjukdomsprogression och om CTC räkna kan hjälpa guidetherapy val.
Slutsatser Review Det fanns en signifikant skillnad i överlevnad mellan patienter med 0-4 CTCs och de med ≥5. Det är dock oklart om alla CTC har sann metastatisk potential, och ytterligare studier behövs.
Förklaringar
Bekräftelser
Denna forskning stöds delvis av en Grant-i-Stöd för utmanande Exploratory Research (23659308) från Japan Society för främjande av Science (JSPS). Finansieringsorganet spelade någon roll i studiedesign, i insamling, analys eller tolkning av data; i skrivandet av manuskriptet; eller i beslutet att lämna in manuskriptet för publicering. Vi är tacksamma för alla patienter och frivilliga som donerade blod till denna studie. Vi vill tacka professor Toshiyoshi Fujiwara (Okayama University Graduate School of Medicine, Okayama, Japan) för att tillhandahålla värdefulla kommentarer och förslag, Herr Yasuo Urata (Oncolys BioPharma, Tokyo, Japan) för att tillföra OBP-401; Dr Yukio Tsujino, dr Toshiyuki Ozawa och Dr Akinori Masago (Sysmex Corporation, Kobe, Japan) för deras hjälp stöd; och Dr Rebecca Devon (Genetics Unit och University of Edinburgh, Edinburgh, UK) för kritisk granskning och redigering av manuskriptet. Vi är också mycket tacksamma för klinisk personal.
Författarnas ursprungliga inlämnade handlingarna Images of Nedan finns länkar till författarnas ursprungliga inlämnade filer för bilder. 12885_2012_3365_MOESM1_ESM.tiff Författaroriginalfilen för figur 1 12885_2012_3365_MOESM2_ESM.tiff Författaroriginalfilen för figur 2 12885_2012_3365_MOESM3_ESM.pdf Författaroriginalfilen för figur 3 12885_2012_3365_MOESM4_ESM.pdf Författaroriginalfilen för figur 4 12885_2012_3365_MOESM5_ESM.tiff Författaroriginalfilen för figur 5 Alla författare har läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• Terapeutiska potentialen hos PRL-3 inriktning och kliniska betydelsen av PRL-3 genomisk amplifiering i magcancer
• Familj historia av cancer och gastroesofageal sjukdomar och risk för esofagus och mag adenokarcinom: en fall-kontrollstudie