GP73 nedreguleres i mavekræft og er forbundet med tumor differentiation

GP73 nedreguleres i mavekræft og er forbundet med tumor differentiering
Abstract
Baggrund
Golgi protein 73 (GP73) er en type II Golgi-transmembranprotein . Det er overudtrykt i flere kræftformer, herunder hepatocellulære carcinomer, galde rørledning carcinomer, lungekræft og prostatakræft. Men der er få rapporter om GP73 i gastrisk cancer. Denne undersøgelse har til formål at undersøge ekspressionen af ​​GP73 og dets forhold til klinisk patologiske tegn i mavekræft.
Metoder
GP73 mRNA-niveau blev bestemt ved kvantitativ real-time RT-PCR i 41 par matchede gastrisk tumorform væv og hosliggende ikke-tumor-slimhindevæv. Western blotting blev også udført for at påvise GP73 proteinniveauet. GP73 proteinekspression blev analyseret ved immunhistokemi i 52 klinisk karakteriseret mavecancerpatienter og 10 ikke-tumorform maveslimhinden kontrol væv.
Resultater
mRNA og protein niveau af GP73 var signifikant nedreguleret i gastrisk tumorform væv sammenlignet med den ikke-tumor-slimhindevæv. I ikke-tumorøse slimhinde, kan stærkt diffus cytoplasmatisk farvning ses i celler placeret ved overfladen af ​​den glandulære og foveolar rum; mens i tumor-væv, farvningen var meget svagere eller endog fraværende, og hovedsagelig i et semi-granulær prik-lignende farvningsmønster. Ekspressionsniveauet af GP73 protein blev associeret med patienternes køn og tumor differentiering.
Konklusioner
GP73 blev normalt udtrykkes i ikke-tumorøse gastrisk mucosa og nedreguleret i gastrisk cancer. Dens udtryk i mavekræft var korreleret med tumor differentiering.
Nøgleord
GP73 mavekræft Tumor differentiering Baggrund
GP73, også kendt som GOLM1 og GOLPH2, er en type II Golgi-transmembranprotein. Strukturelt indeholder GP73 en kort N-terminalt cytoplasmatisk domæne, et transmembrandomæne og et større luminal C-terminale domæne, som er sammensat af en spiralsnoet domæne og en syre hale. Den luminale C-terminale domæne er den væsentligste funktion domæne af GP73 [1-3]. Mus med en alvorlig trunkering af GP73 C-terminus viste nedsat overlevelse og alvorlige epiteliale abnormiteter i nyrerne og leveren [4]. Den coiled-coil domæne kunne interagere med både precursor og modne sCLU, hvilket indikerer, at GP73 kan hjælpe i post-translationel modifikation, transport og sekretion af sCLU [5]. En proproteinconvertase genkendelsessted R 52VRR 55 er placeret inden den C-terminale ektodomæne; PC-medieret spaltning af GP73 forvandler den intracellulære, Golgi-lokaliserede GP73 til et opløseligt, sekretorisk protein [6]. Men funktionen af ​​GP73 er ​​stadig uklar.
GP73 blev først identificeret fra et cDNA-bibliotek afledt fra leveren af ​​en patient med voksen giant-celle hepatitis. Det anses en epitelcelle-specifikt protein, som er overudtrykt i colon, mave, prostata og luftrøret hos normale, raske personer [1]. Leversygdom, såsom virus infektion og skrumpelever, kunne opregulere ekspressionen af ​​GP73 i hepatocytter [1, 7, 8]. Nylige undersøgelser viste, at GP73 var overudtrykt i flere kræftformer, såsom hepatocellulært karcinom [9-11], galde rørledning carcinomer [11], lunge adenocarcinomer [12], prostatakræft [13, 14] og seminomer [15]. Ekspressionen af ​​GP73 i nyrekræft er langt mere omfattende. Det blev rapporteret som nedreguleret i de fleste clear cell renal cell cancere (RCCS), men højt udtrykt i papillær og kromofobt nyrecarcinomer [16]. Serum GP73 har også fundet forhøjede i hepatocellulære carcinomer, galde rørledning carcinomer og lunge adenokarcinomer. Det viste selv en fordel i forhold α-fetoprotein (AFP) til at diagnosticere tidligt hepatocellulært karcinom [17, 18]. Også mRNA ekspression af GP73 i urin udkonkurrerede serum PSA i detektion af prostatacancer [13].
Mavekræft er en af ​​de mest almindelige cancere og den næststørste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan. Det har særligt høje frekvenser i Kina [19]. Indtil nu er de ætiologiske faktorer og patogenesen af ​​mavekræft er ikke fuldt forstået. I denne undersøgelse, vi sigter mod at undersøge ekspressionen af ​​GP73 og dets forhold til klinisk patologiske tegn i mavekræft ved at måle mRNA og protein udtryk niveau af GP73 i gastrisk tumorform og tilstødende ikke-tumorform slimhinde væv.
Metoder
Materialer og patienter
Fyrre-én par af matchede gastrisk tumorform og tilstødende ikke-tumorform slimhinde væv (> 5 cm fra kanten af ​​tumoren) blev opnået fra patienter med primær gastrisk kræft ved Zhejiang Provincial Folkets Hospital, Kina fra januar 2011 til december 2012. egenskaberne af 41 GCsare vist i tabel 1. Efter kirurgisk fjernelse, væv blev frosset øjeblikkeligt i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil use.Table 1 Resumé af clinicopathologic karakteristika mavecancerpatienter
Klinisk parametre
N (%)
Køn
mænd
27 (65,9)
kvinder
14 (34,1)
Størrelse
23 (56,1 )
< 20
18 (43,9)
≧ 20
Histologisk differentiering
Nå
3 (7.3)
Moderat
17 (41,5)
Dårligt
21 (51,2)
lymfatisk metastaser
Ingen
11 (26,8)
Ja
30 (73,2)
Distant metastase
Ingen
34 (82,9)
Ja
7 (17.1)
TNM stadie
jeg
8 (19,5)
II
17 (41,5)
III
10 (24,4)
IV
6 (14,6)
Fifty-to paraffin eksemplarer af mavekræft (GC) væv (43 hanner, 9 kvinder) blev erhvervet fra Zhejiang Provincial People Hospital, indsamlet fra 2010 til 2011. Alle tilfælde af gastrisk kræft blev klassificeret ifølge WHO klassificering og iscenesat ved hjælp af pTNM systemet [20]. Sagerne bestod af 22 patientsaged < 60 år, 30 patienter i alderen ≥60years; 20 patienter med tumor størrelse < 5 cm, 32 patienter med tumor størrelse ≥5cm; 22 patienter med moderat differentieret kræft, 30 patienter med dårligt differentieret kræft; 14 patienter med T1- eller T2 væg invasion, 38 patienter med T3 eller T4 væg invasion; 39 patienter med lymfeknudemetastaser og 13 patienter uden lymfeknudemetastaser; 10 patienter med fjernmetastaser og 42 patienter uden fjernmetastaser. Antallet af patienter, der er klassificeret af TNM fase var som følger: 18 var på TNM trin I eller II; 34 ved TNM stadium III eller IV. Patienterne var mellem 32 og 84 år, og der var ingen strålebehandling eller kemoterapi før operationen. Prøver er fastsat ved formalin og indstøbt i paraffin. Tennormal vævsprøver i maven fra patienter uden maligne tumorer blev også opnået ved endoskopi som kontrolgruppe.
Alle patienter billede informeret samtykke til anvendelsen af ​​deres væv før operation. Brugen af ​​alle prøver blev godkendt af den etiske komité i Zhejiang Provincial People Hospital.
Kvantitativ realtids-PCR
QRT-PCR blev udført for at bestemme mRNA niveauet af GP73. Kort beskrevet blev totalt RNA ekstraheret fra 40 par af matchede gastriske tumorform og tilstødende ikke-tumor-mucosal vævsprøver under anvendelse af Trizol (Invitrogen, Camarillo, USA) ifølge producentens anvisninger. cDNA-syntese blev udført med PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis kit (Takara, Dalian, Kina), under anvendelse af 1 ug af total RNA som template og oligodT primer under 65 ° C, 5 minutter, 42 ° C, 60 minutter og 70 ° C, 10 minutter af revers transkription. Det resulterende cDNA blev forstærket af qPCR hjælp af specifikke primere med SYBR Premix Ex Taq (Takara, Dalian, Kina). GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. Primere til GP73 var 5'-GCAAAGCAACATCTTCCCTA-3 '(sense) og 5'-CCACAACAAACTTGCCCTC-3' (antisense). Primere til GAPDH var 5'TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 '(sense) og 5'CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3' (antisense). PCR parametre var som følger: 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C for 10s, 60 ° C i 20s og 72 ° C i 20'erne. Ved slutningen af ​​PCR-cykler blev udført smeltekurveanalyse. Den relative ekspression af GP73 til GAPDH blev beregnet under anvendelse af 2 -ΔCT metode.
Western blotting
Western blotting blev udført for at undersøge GP73 proteinniveauet i 5 af 41 par af gastrisk tumorvævet og tilstødende ikke-tumorøse slimhindevævet. Protein blev isoleret fra væv prøver efter RNA-ekstraktion. Og ca. 30 ug protein blev separeret på 10% polyacrylamidgel i to timer. Efter at være blevet overført til en polyvinylidenedifluoride (PVDF) membran (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut, USA), blev prøverne undersøgt med primære antistoffer mod GP73 (1: 2.000, Sigma, St. Louis, MO, USA) og β-actin ( 1: 5000, Sigma, USA) ved 4 ° Covernight. Efter inkubering med sekundært antistof (1: 5000, CapitalBio, Beijing, Kina) i 2 timer, membranerne blev behandlet med elektro-(ECL) reagens (Generay, Shanghai, Kina) og udsat for autoradiographicfilms
immunhistokemisk farvning
immunhistokemisk. farvning blev udført ved standardmetoden. Kort fortalt blev 52 tilfælde af paraffinindlejrede gastriske tumorer væv og 10 tilfælde af hosliggende ikke-tumor-kontroller slimhindevæv skåret ved 5 um tykt og placeret på mikroskopiske objektglas og tørret i en 60 ° C ovn i 2 timer. Derefter blev snittene de-paraffinized i xylen, rehydreret under anvendelse af en gradient af ethanolkoncentrationer, microwaved i 10 mM citratpuffer i 15 minutter for at hente antigen, blokeret med 3% hydrogenperoxid i 10 minutter for at inhibere endogen peroxidaseaktivitet og inkuberet med 10 % gede ikke-immunt serum i 20 minutter for at reducere baggrund non-specifik farvning. Efter dette blev sektionerne inkuberet med kanin-anti-GP73 polyklonalt antistof (Abcam, Cambridge, UK) (1: 100 fortynding) ved 4 ° C natten over, derefter inkuberet med biotin-mærket sekundært antistof (Invitrogen, USA) ved stuetemperatur i 20 minutter, efterfulgt af inkubering med HRP-konjugeret streptavidin (Invitrogen, USA) ved stuetemperatur i 20 minutter. Derefter blev farveudvikling udført med en DAB Substrat Kit (Dako, Carlsbad, USA). Endelig blev snittene modfarvet med hematoxylin, dehydreret, klaret og monteret.
Evaluering af immunohistochemicalstainings
Den immunohistochemicalstainings af GP73 blev scoret af to patologer uafhængigt, baseret på intensiteten og andelen af ​​positivt farvede celler. Farvning intensitet blev evalueret med en fire-differentieret klassificeringssystem: 0 = negativ, 1 = svag, 2 = moderat og 3 = stærk. Procentdelen af ​​positive celler blev scoret som følger: 0 for ingen celle farves, 1 for 1% til 25% af cellerne farvet, 2 sig for 26 til 50% af cellerne farvet, 3 for 51 til 75% af celler farvet og 4 for mere end 75% af cellerne farvet. Scores for intensitet og procentdelen af ​​positive celler blev mangedoblet. Scores ≤3 blev anvendt til at definere tumorer med lav GP73 ekspression og scorer ≥4 med høj GP73 ekspression.
Statistisk analyse
Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS software 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Den parrede-prøver t-test blev anvendt til at analysere forskellene i GP73 mRNA-ekspression mellem tumor og ikke-tumor-væv. Chi-square test blev anvendt til vurdering af den statistiske signifikans af sammenhængen mellem GP73 ekspression og klinisk-patologiske parametre. P
< 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant
Resultater
GP73 udtryk niveau i gastrisk tumor og ikke-tumorvævet
GP73 mRNA-ekspression betydeligt faldt i gastrisk tumorvæv i forhold til den tilstødende ikke-tumorform. væv (33/41; 80,5%). Ekspressionsniveauerne af GP73 forhold til GAPDH var meget lavere i gastriske tumorform væv (0,259 ± 0,308) end i ikke-tumor-slimhindevæv (0,584 ± 0,523; P
< 0,01; figur 1). I overensstemmelse med RT-qPCR, GP73 proteinniveauet i gastriske tumorprøver var signifikant lavere end den for ikke-tumor-prøver, som blev testet ved Western blotting (figur 2). Figur 1 GP73 mRNA-ekspression i gastriske tumorform væv og tilstødende ikke-tumor-slimhindevæv.
Figur 2 GP73 proteinniveau i gastriske tumorform prøver og tilstødende ikke-tumor-mucosale prøver. A) GP73 proteinniveau i gastriske tumorform prøver og tilstødende ikke-tumor-mucosale prøver. B) GP73 mRNA-niveau i de samme gastrisk tumorform prøver og tilstødende ikke-tumorform slimhinde prøver. C) gastrisk cancer; N:. Normal)
Sammenhæng mellem GP73 proteinekspression og clinicopathologic parametre
IHC viste, at GP73 var stærkt udtrykt i tilstødende ikke-tumorøst slimhindevæv, men faldt eller endda fraværende i gastrisk tumorform væv. I ikke-tumorøse slimhinde, kunne stærk diffus cytoplasmatisk farvning ses i celler placeret ved overfladen af ​​den glandulære og foveolar rum (figur 3A). I tumorvæv blev GP73 ekspression hovedsagelig udtrykkes i et særskilt semi-granulære prik-lignende farvningsmønster (figur 3B, C). Kun få gastriske tumorvæv blev fundet med stærk ekspression af GP73 (figur 3D). Figur 3 GP73 proteinekspression i gastriske tumorform væv og tilstødende ikke-tumor-slimhindevæv. A) Stærk udtryk for GP73 i ikke-tumor-væv. B) Svag ekspression af GP73 i gastriske tumorform væv. C) Moderat ekspression af GP73 i gastriske tumorform væv. D) Kraftig ekspression af GP73 i gastriske tumorform væv. a, b, c, d: original forstørrelse 100 ×. A, B, C, D:. Oprindelig forstørrelse 200 ×
korrelation mellem ekspression af GP73 protein og kliniske variable er vist i tabel 2. GP73 ekspressionsniveau blev signifikant relateret til køn patienter (P
= 0,027) og differentiering (P
= 0,049). Ekspressionen af ​​GP73 i dårligt differentieret gastriske tumorer var meget lavere end den, moderat differentierede gastriske tumorer. I alt 21 ud af 30 dårligt differentierede gastrisk tumor tilfælde viste lav GP73 udtryk, mens der i moderat differentierede gastrisk tumor tilfælde var det kun 9/22. Også ekspressionen af ​​GP73 hos mandlige patienter blev nedreguleret hyppigere end hos kvindelige patienter. Der var ingen signifikant sammenhæng mellem GP73 udtryk og andre clinicopathologic parameters.Table 2 Forholdet af GP73 udtryk med patologiske parametre for tumor
Kliniske parametre
GOLPH2
P-værdi


lav
høj
Samlet antal
30
22
Køn
0,027
Mand
28
15
Female
2
7
Alder (år)
0,456
< 60
12
10
≥60
18
12
Tumor størrelse (cm2)
1,000
< 20
14
6
≥20
16
16
Differentiering
0,049
Moderat differentieret
9
13
Dårligt differentieret
21
9
Stage
0,390
I + II
12
6
III + IV
18
16
Dybde af væg invasion
1,000
T1 + T2
8
6
T3 + T4
22
16
lymfatisk metastase
0,757
Ingen
7
6
Ja
23
16
fjernmetastaser
0,725
Ingen
25
17
Ja
5
5
diskussion
nylig, flere undersøgelser vist, at GP73 er ​​overudtrykt i nogle kræftformer, herunder hepatocellulære carcinomer, galde rørledning carcinomer, lungekræft, prostatakræft og seminomer [ ,,,0],9-15]. I hepatocellulære karcinomer, blev høj ekspression af GP73 forbundet med tumorstørrelse, differentiering, kvalitet og vene invasion [7-9]. I galdegangsceller carcinomer, GP73 udtryk forbundet med patientens alder og overlevelse [11]. I lungekræft, blev GP73 udtryk forbundet med tumor histologi og patient køn; sit udtryk i adenocarcinom var betydeligt højere end i andre typer af lungekræft [12]. Men ingen korrelation med klinisk-patologiske parametre har vist sig, i prostatakræft og seminomer [13, 15]. GP73 har også vist sig nedreguleret i klare celle RCCS, som er den mest almindelige histologiske undertype af nyrecellecancer, mens dens ekspression i papillær og kromofobt RCC var stærk [18]. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at både GP73 mRNA og protein-niveauer blev højt udtrykt i ikke-tumor-gastriske slimhinder, som var modsat de fleste tidligere undersøgelser i andre cancere.
Kendskab til GP73 funktion er stadig begrænset. Indtil videre ved vi, at GP73 er ​​afgørende for lever og nyrer at opretholde en normal funktion og udseende. Det er også kendt, at GP73 kan fungere bistå i protein transport og sekretion. Et sådant protein, sCLU, er allerede blevet identificeret. sCLU kunne forhindre apoptose og er overudtrykt i forskellige cancerformer. GP73 kunne interagere med sCLU gennem coiled-coil domæne og bistå transport og sekretion af sCLU, hvilket kan forklare associationen mellem høje udtrykte GP73 og den aggressive opførsel af hepatocellulære carcinomer [3]. I hepatocellulært carcinom (HCC) blev overekspression af GP73 ikke kun fundet i kræft væv, men også i patienternes serum, hvilket indikerede den betydelige stigning i GP73 niveauer vil give en markør for tidlig påvisning. Nogle rapporter selv udtalt, at GP73 er ​​en bedre markør end AFP til diagnosticering HCC [10, 11, 18, 21]. Men hvad er den funktion af GP73 i maven og hvorfor skulle det være nedreguleret i gastrisk kræft? Det er stadig uklart. GP73 er ​​en epitelcelle-specifikt protein og stærkt udtrykt i talrige normale humane væv, især i tyktarmen og maven. Det er også overvejende udtrykkes i tyndtarmen, colon og mave af mus [22]. I overensstemmelse med disse undersøgelser, vi fandt også, at GP73 var stærkt udtrykt af celler placeret ved overfladen af ​​den glandulære og foveolar rum i normalt humant maveslimhinden. Eftersom den højeste ekspression af GP73 er ​​i epitelceller i fordøjelsesorganerne, er det rimeligt at antage, at det kan spille nogle vigtige, ukendte roller i fordøjelsessystemet.
Vi fandt også ekspressionen af ​​GP73 var forbundet med tumor differentiering. Ekspressionen af ​​GP73 i dårligt differentieret gastriske tumorer var meget lavere end den, moderat differentierede gastriske tumorer. Det blev rapporteret, knock-down af GP73 i HepG2.2.15-celler kan forårsage en reduktion i overfladeareal Golgi komplekset. Da størrelsen og udviklingen af ​​Golgi komplekset er positivt korreleret med tumor differentiering, nogle forskere hypotese, at GP73 ekspression kan være forbundet med at opretholde den strukturelle integritet af Golgi-komplekset under onkogenese [23, 24]. Nylige undersøgelser viste, at tabet af GP73 forårsaget opregulering af WT1, som kan fremme glomus dannelse og hæmme pronephric tubulus differentiering. Det foreslås, at GP73 spiller en vigtig rolle i pronephros udvikling og differentiering [25]. I hepatocellulært carcinom, blev GP73 protein stærkt forbundet med tumorstørrelse, vene invasion og tumor differentiering, hvilket tyder GP73 ekspression er korreleret med den aggressive opførsel af cancer [10]. Endvidere blev ekspressionen af ​​GP73 også forbundet med patienten køn. Mandlige patienter udviste lav GP73 udtryk oftere end kvindelige patienter. Et lignende fænomen er også blevet rapporteret i lungekræft. Kvindelige patienter havde en højere udtryk for GP73 end mandlige patienter [12]. Det er også rapporteret, at fænotypiske ændringer observeret i mus med afkortede GP73 C-terminalen er køn-afhængige [4]. En forklaring er, at GP73 mRNA reguleres af østrogener og calcitriol [26]. Vores arbejde igen bekræftet hypotesen om, at GP73 ekspression er under hormonal kontrol.
Konklusion
Afslutningsvis fandt vi, at både GP73 mRNA og proteinniveauet var signifikant nedreguleret i gastriske tumorform væv sammenlignet med den ikke-tumorøse slimhinde , og ekspressionen af ​​GP73 var forbundet med tumor differentiering og patientens køn. Vores videre arbejde vil fokusere på at undersøge funktionen og reguleringen mekanisme GP73 i maven
Forkortelser
AFP:.
Α-fetoprotein
ECL :
elektrokemiluminescensen
GC:
mavekræft
GP73:
Golgi protein 73

HCC:
Hepatocellulært karcinom
PSA:
Prostata specifikt antigen
PVDF:
Polyvinylidenedifluoride
RCC:.
Renal celle kræft
erklæringer
Tak
Dette arbejde blev støttet af Zhejiang Provincial Program til dyrkning af højt niveau Innovative Health Talenter.
forfatternes oprindelige indsendt filer til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder. 12957_2012_1362_MOESM1_ESM.tif Forfatternes oprindelige fil til figur 1 12957_2012_1362_MOESM2_ESM.tif Forfatternes oprindelige fil til figur 2 12957_2012_1362_MOESM3_ESM.tif Forfatternes oprindelige fil til figur 3 konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Forfattere ' bidrag
LGC og HJW var involveret i udformningen af ​​undersøgelsen, udført QRT-PCR, Western bolte og immunhistokemisk farvning analyse og udarbejdet manuskriptet. ZYY og VKN var involveret i udformningen af ​​undersøgelsen og overvåget undersøgelsen. HBY, FW og TPG indsamlede data og hjalp til at udarbejde manuskriptet. XJH og yym forudsat generel støtte og været med til at udarbejde manuskriptet. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Marginal uklar band og lyseblå våbenskjold, skilte observeret i forstørrelsesglas smalbåndet imaging endoskopi, er tegn på gastrisk tarm metaplasi
• Flere primære malign sygdom og primær sporadisk kolorektal cancer i Japan: forekomst af mavekræft med kolorektal kræftpatienter kan være højere end tidligere indregnet