Syvä sekvensointi mahakarsinooman paljastaa somaattiset mutaatiot liittyvät henkilökohtaista medicine

Deep sekvensointi mahakarsinooman paljastaa somaattiset mutaatiot merkitystä henkilökohtaisen lääketieteen
tiivistelmä
tausta
Maailmanlaajuisesti mahasyöpä on toiseksi yleisin syy syöpään liittyvät kuolemat , jossa suurin osa terveydenhuollon taakka taloudellisesti vähemmän kehittyneiden maiden. Tool menetelmät
Täällä raportoimme geneettinen luonnehdinta 50 mahalaukun adenokarsinooman näytettä, käyttäen Affymetrix SNP paneelit ja Illumina mRNA ilmaisun paneelit sekä Illumina sekvensointi koodaavien alueiden 384 kuuluvien geenien eri reittien tiedetään muuttaa muita syöpiä.
tulokset
Genetic muutoksia havaittiin WNT, Hedgehog, solusyklin, DNA-vaurioita ja epiteelin-to-mesenkymaalisten-siirtymän reittejä .
Johtopäätökset
tiedot ehdotetaan kohdennettuja hoitomuotojen hyväksytty tai kliinisessä vaiheessa varten mahakarsinoo- olisi hyötyä ~ 22%: lla tutkituista potilaista. Lisäksi uudet mutaatiot havaitaan tässä, ovat omiaan vaikuttamaan kliinisen vasteen ja ehdottaa uusia tavoitteita lääkekehityksen.
Tausta
Huolimatta viimeaikaisista laskua kuolleisuuden mahasyöpä Pohjois-Amerikassa ja suurimmassa osassa Pohjois- ja Länsi-Euroopassa , mahasyöpä edelleen yksi merkittävimpiä kuolinsyitä maailmassa ja on yleinen Japanissa, Koreassa, Chilessä, Costa Ricassa, Venäjä ja muissa maissa entisen Neuvostoliiton [1]. Huolimatta parannuksista hoitomuodot ja seulonta, ennuste potilaiden mahalaukun adenokarsinoomaa edelleen heikko [2]. Ymmärtää synnyssä ja kehittää uusia terapeuttisia strategioita, on tärkeää leikellä molekyylitason mekanismeja, jotka säätelevät etenemistä syöpään. Erityisesti onkogeenisel- mekanismeja voidaan kohdistaa henkilökohtaista lääketiedettä.
Termi "onkogeenin riippuvuus" kuvaamaan syöpäsoluja erittäin riippuvainen tietystä onkogeeni tai onkogeenisten polku otettiin käyttöön Weinstein [3, 4]. Käsite korostaa kehittämiseen kohdennettujen hoitomuodot, jotka pyrkivät inaktivoimaan onkogeenin, kriittinen selviytymisen syöpäsolujen samalla säästävät normaalit solut, jotka eivät ole samalla tavalla riippuvaisia.
Useita onkogeenien aktivoitu korkealla taajuudella muissa syövissä on myös osoitettu olevan mutatoitunut mahasyövän. Tästä seuraa, että kaupan terapeuttiset kohdentamalla onkogeenien olisi tehokkaasti hoitaa osuuden mahakarsinoomat, joko yksittäisinä aineina tai yhdistelmänä. Tammikuussa 2010 trastutsumabi hyväksyttiin yhdistettynä kemoterapiaa ensilinjan hoitoon ErbB2
positiivisten kehittynyt ja metastaattinen mahasyövässä. Trastutsumabi on ensimmäinen suunnattu aine on hyväksytty hoitoon mahalaukun syöpä ja se kasvoi 12,8% hoitovaste havaittiin lisäämällä trastutsumabi kemoterapiaan vuonna ErbB2
positiivinen mahalaukun adenokarsinooman [5, 6]. On arvioitu, että 2-27% mahasyövistä satama ErbB2
monistukset ja voidaan käsitellä ErbB2 estäjiä [7, 8]. Vastaavasti yli-ilmentyminen toinen reseptori tyrosiinikinaasin (RTK) EGFR
, on havaittu mahasyövän ja useita kokeita EGFR
estäjien Tämän syöpätyypin ovat käynnissä (katsaus [9, 10]). Lisäksi joissakin syöpien satamaan DNA: n monistuksen tai yliekspressio RTK MET
[11, 12] ja sen paralogi MST1R
[13], ja voidaan käsitellä MET
tai MST1R
inhibiittorit [14-20 ]. Lopuksi FGFR2
yli ilmaisun ja vahvistus on havaittu pieni osa mahasyöpä (scirrhous) [21] ja inhibiittorit ovat osoittaneet jonkin verran tehoa klinikalla [22].
Alavirtaan RTK, KRAS
villityypin vahvistusta ja mutaatio on löydetty myös noin 9-15% mahasyövistä [23, 24] ja sitä voidaan tehokkaasti hoitaa MEK estäjiä [25, 26]. Aktivointi PI3K /AKT /mTOR-reitin havaittu myös 4-16% mahasyövän [27-30], ja niin voi olla herkkä PI3K-estäjien [31-34]. Vastaavasti, solusyklin kinaasin AURKA
on osoitettu aktivoidaan mahasyövän [35, 36] ja AURKA estäjillä kliinisessä kehityksessä [37] voi olla kliinistä hyötyä.
Raportit taajuuden eri onkogeenisten aktivointi ja niiden yhteistyö esiintyminen ovat rajalliset. Toisin kuin gastrointestinonal stroomakasvaimet (GIST), joille on tunnusomaista suuri taajuus KIT
ja PDGFRA
aktivointi [38], ja näin ollen hoitaa tehokkaasti useimmissa jonka imitanib ja sunitinibille [39, 40], mahalaukun adenokarsinooman näkyviin olevan molekyylitasolla heterogeeninen sairaus ilman korkean taajuuden onkogeenisiä perturbation löydetty toistaiseksi. Tätä kuvaa tuoreen tutkimuksen somaattisten mutaation kinaasi koodaus geenien poikki 14 mahasyövässä solulinjoissa ja kolme mahasyövän kudoksia, jotka löydettiin yli 300 novel kinaasi yhden nukleotidin muunnelmia ja kinaasi liittyviä rakenteellisia variantteja. Ei kuitenkaan kovin usein toistuva mutaatio tai mutantit kinaasi paljastui [41].
Koska tarkoituksena on valaisemaan mahdollisia hoitoon mahakarsinooman kohdennettuja hoitomuotojen joko markkinoilla, kehittymiseen tai löytäjäänsä, olemme tunnettu kliininen mahakarsinoo- näytteiden havaitsemiseksi onkogeenin aktivaation.
Otimme maailmanlaajuinen lähestymistapa analysoimalla näytteet Affymetrix SNP paneelit ja Illumina mRNA ilmaisun taulukot. Nämä tekniikat ovat hyvin validoitu havaitsemiseen genotyypin, DNA kopioluvun vaihtelua ja mRNA: n ilmentymisen profiilin. Ne ovat sopivia heterogeenisia kliinisistä näytteistä. Näytteet myös kuulustelivat toisen sukupolven (Illumina) sekvensointi. Suhteellisen uusi toisen sukupolven sekvensointiteknologioihin tarjota sekä lisääntynyt läpimeno ja syvä sekvensointi kapasiteettia. Jälkimmäinen on erityisen tärkeää luonteenomaiset syövän näytteet, jotka kuuluvat yleensä seoksen solutyyppejä, mukaan lukien tunkeutumisatmosfäärin normaalit solut, verisuoniston ja kasvainsolun eri genotyyppien. Tässä tutkimuksessa käytettiin tavoite rikastamiseen ja Illumina sekvensointitekniikan sekvensoida koodausalueissa 384 geenejä. Päätimme suosia kattavuutta yli laajemman kattavuuden, jotta kaapata mutaatioiden läsnä osapopulaatioiden sisällä kasvaimia. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, syövät yleensä satama monia mutaatioita harvempiin signalointipolkujen [42, 43] siksi keskityimme geenejä näillä reittejä. Olemme myös geenejä, jotka koodaavat proteiineja aiemmin osoitettu vaikuttavan vastauksena kohdennettuja hoitomuotojen ja todennäköisemmin onnistuneesti kohteena pienimolekyylisiä interventio, ja tavoitteemme on löytää tehokkaampia ja uusia tapoja käsitellä mahakarsinooman. Tool Menetelmät
kudosnäytteitä
DNA- ja RNA-näytteet saatiin sairaaloille Venäjällä ja Vietnamissa mukaan IRB hyväksyttyjen käytäntöjen ja IRB hyväksytty suostumuslomakkeet molekyylien ja geneettinen analyysi. Lääkärikeskuksissa itse on myös sisäinen eettisten komiteoiden kanssa tarkistetaan protokollan ja ICFs. Näytteet peräisin läpi Tissue Solutions Ltd http: //www. Kudos-ratkaisuja. Com /. Näytteen ominaisuudet katso lisätiedosto 1 taulukossa S1
Taulukot
genotyypit ja kopioluvun profiilit luodaan jokaista näytteitä 1 ug DNA: ta ajaa Affymetrix SNP V6 taulukoihin käyttäen Affymetrix protokollia. Kopioi numero vaihtelu analysoitiin puitteissa ArrayStudio ohjelmisto http: //www. Omicsoft. Com. Data normalisoitiin käyttäen Affymetrix algoritmia ja segmentoida avulla CBS. Kirjoitus profiili luotiin kullekin näytteelle käyttäen 1 ug kokonais-RNA ajaa Illumnia HG-12 RNA ilmentymisen paneelit jälkeen Illumina protokollia. Data analysoitiin sisällä Illumina GenomeStudio ohjelmisto http: //www. Illumina. Com /ohjelmisto /genomestudio_ ohjelmisto. Ilmn. Koska data esikäsitte.lyproseduuria, koetin setti oli vain voimassa, jos on "läsnä" (eli kahden keskihajonnan yli taustan) soittaa ainakin yksi näytteistä. Signaalin arvot jäljellä koetinsarjojen muunnettiin 2-pohjainen logaritmi mittakaavassa ja quantile normalisointi suoritettiin. DNA-kopion ja RNA ekspressiotasoja integroitiin geeni- tasolla sisällä ArrayStudio ohjelmisto http: //www. Omicsoft. Com. Pathway rikastamiseen analyysi tehtiin sisällä GeneGO metacore analyysi Suite http: //www. Genego. Com /. Kaikki array tästä tutkimuksesta on saatavana GEO http: //www. NCBI. NLM. NIH. Gov /geo /Sarjan hakunumerolla GSE29999.
Kohdennettu syvä DNA sekvensointi
5 ug DNA PCR-rikastettu varten koodaus eksonit kaikista tunnetuista transkriptio 384 kiinnostavia geenejä (lisätiedosto 2 taulukko S2) käyttäen Raindance alustan http: //www. raindancetechnol giaa. com /.
tuloksena tavoite kirjastot sekvensoitiin Illumnia GAII klo luku pituus 54 nt. Sequence lukee kartoitettiin vertailutasoon genomin (hg18) käyttäen BWA ohjelmaa [44]. Emäkset ulkopuolella kohdealueilla oli huomioida yhteenveto kattavuutta tilastoja ja variantti puhelut. SAMtools käytettiin jäsentää linjaukset ja tehdä genotyyppi puheluja [45], ja kaikki puhelun, joka poikkeaa viittaus emäs pidetä mahdollisena variantti. SAMtools paketti tuottaa konsensuksen laatua ja variantti laadun arvioiden luonnehtia genotyypin puhelut. Tarkkuus genotyypin puheluiden arvioitiin konkordanssin genotyypin puheluita Affymetrix 6,0 SNP mikrosirun. Konkordanssin matriisit näytteiden perustuu sekä SNP ja sekvenssitiedot luotiin tarkistaa näytteen virhemerkintöjen (lisätiedosto 3 kuva S1). Konkordanssin ja määrä genotyypin puhelua taulukoida kynnysarvojen konsensuksen laatua, variantti laatu ja syvyys. Lopullinen joukko variantin puheluiden tunnistettiin käyttämällä konsensus laatu suurempi tai yhtä suuri kuin 50 ja muunnoksen laatu suurempi kuin 0. Jos yksinomaan tunnistaa somaattisten muutoksia, ainoastaan ​​mutaatiot läsnä syöpä näytteen ja ei havaittu missään tavanomaisessa näytteet olivat säilyneet. Ylimääräisenä suodatin ituradan variantteja, kaikki variantit läsnä dbSNP 1000 genomin polymorfismi aineistoja poistettiin.
Q-PCR
Q-PCR suoritettiin kautta standardin protokollan Fluidigm 48 * 48 dynaaminen taulukko. Ensinnäkin, validointi ajo suoritettiin käyttäen yhdistettyä ohjaus RNA kolme yksilöä. Neljä RNA-määriä testattiin (125 ng, 250 ng, 375 ng ja 500 ng). Kolmena kappaleena datapisteet saatiin sittemmin 10 pisteen sarjalaimennokselle kohden kunnossa koetta kohti. Paras kokonaistulokset olivat 250 tai 500 ng, joka tuotti hyötysuhdearvoja ~ 85%. Siksi 250 ng panos määrä koenäytteiden. Tiedot tuotettiin kolmena kappaleena ja tarkoittavat yhdistettynä. CT-arvot muutettiin runsautta tavallisilla kaavan runsaus = 10 (40-CT /3,5). Testituloksia normalisoitiin taloudenhoitajan käyttäen analyysiä kovarianssi menetelmän, jossa kaksi emännät (GAPDH ja beeta-aktiini) käytettiin laskemaan vankka pisteet ja pisteet käytettiin kovariaattina säätää muita geenejä. Data-analyysi suoritettiin Arraystudio ohjelmiston.
Sanger sekvensointi
Genominen DNA PCR-alukkeet tilattiin IDT (Integrated DNA Technologies Inc, Coralville, Iowa). PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen Invitrogen Platnium polymeraasia (Invitrogen, Carlsbad, CA). 50 ng genomista DNA: ta monistettiin 35 syklin ajan 94 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, 58 ° C: ssa 30 sekunnin ajan ja 68 ° C: ssa 45 sekunnin ajan. PCR-tuotteet puhdistettiin käyttämällä Agencourt AmPure (Agencourt Bioscience Corporation, Beverly, MA). Suora sekvensointi puhdistettiin PCR-tuotteiden sekvensointi alukkeilla suoritettiin AB v3.1 BigDye-terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) ja sekvensointi reaktiot puhdistettiin käyttäen Agencourt CleanSeq (Agencourt Bioscience Corporation, Beverly, MA). Sekvensointireaktiot analysoitiin käyttämällä Genetic Analyzer 3730XL (Applied Biosystems, Foster City, CA). Kaikki sekvenssin tulokset tiedot koottiin ja analysoitiin käyttäen Kodonissa koodi aligner (CodonCode Corporation, Dedham, MA).
Tulokset
DNA: n ja RNA: n monistusta kuviot koko näytteet ovat yhdenmukaisia ​​aikaisempien tutkimusten
Yhdenmukaisesti useimmat muut ihmisen syövissä, kopioluvun muutoksia tapahtunut koko genomit 50 mahasyövän näytettä verrattuna vastaaviin normaaleihin näytteet (kuvio 1). Suuret alueet usein vahvistus havaittiin kromosomialueita 8q, 13q, 20q, ja 20p. Tunnetut onkogeenien MYC
ja CCNE1
sijaitsevat 8q ja 20p amplikonien vastaavasti ja todennäköisesti edistää kasvua etuihin, joita vahvistusta. Nämä monistukset on nähty ennen tutkimuksissa mahasyövän yhdessä monistamisen 20p joille ZNF217
ja TNFRSF6B
on ehdotettu Hakijan geenejä [46]. Kuvio 1 Näkymä CNV poikkeavuuksien kaikissa 50 mahasyöpä näytettä, kunkin autosomi. Y-akseli vastaa summaa useita positiivisia tai negatiivisia muutoksia tietyn segmentin kanssa log2 suhde näiden muutoksen. Alueet, joilla on lisääntynyt tai vähentynyt kopioluvun johdonmukainen koko kaikki näytteet analysoitiin tai hyvin suuria muutoksia muutamia näytteitä näyttää suuria positiivisia ja negatiivisia muutoksia koossa. Jokainen piste tai segmentti kuvassa värittää näyte. Värikoodi on mielivaltainen kuhunkin 50 syövän näytteiden määritetty väri. Amplified segmentit sisältävät kromosomissa 8q, 20q, 20p, 3Q, 7p, ja 1q.
Concordance välillä DNA kopiomäärä voitto ja RNA ilmaisun joukossa syöpä näytteet arvioitiin ja top 200 geenien sisällä alue usein korkean DNA kappaleena syöpänäytteissä ja joka oli korkea-mRNA-tasot (verrattuna vastaaviin normaaleihin kudosta) on taulukoitu lisätiedosto 4 taulukossa S3. Suurin osa geeneistä tällä listalla ovat kromosomialueita 20q ja 8q, mikä viittaa siihen, että nämä monistuksissa on eniten vaikutusta mRNA-tasoja, vähemmistönä ovat geenit 20p, 3Q, 7p, ja 1q. Kuvio 2 esittää RNA profiilit mitattiin Q-PCR esikuvana geenin kullekin alueelle, joka esittää yleisesti yli-ilmentymisen mahasyövän, erityisesti tiettyjen näytteiden. Paitsi MYC
ja CCNE1
, on useita geenejä näillä alueilla, mikä voi edistää kasvua etu syöpäsolun. Biologinen reitit merkittävimmin rikastettu monistettujen ja yli-ilmentyy geenit osallistuvat säätelyyn kääntämisen (p = 0,000015) ja DNA-vaurioiden korjaus (p = 0,003). Näytteitä, joiden monistukset näillä genomialuetta ovat selityksin kuvassa 3. Ei ole havaittavissa taipumusta monistuksia näillä alueilla yhteistyössä tapahtua tai olla yksin. Vuonna sopimukseen aiemman tutkimuksen [47] mukaan PERLD1
lokus monistettiin (puitteissa erbB2
amplikoni) näytteen 08280 ja MMP-9
yliekspressoitui mutta ei havaittavasti täydennetty. Myös kuvassa 3 polttoväli DNA monistamisia yhtäpitävät RNA geenien ilmentymisen todennäköisesti vaikuttavat vastaus kohdennettuja hoitoja merkitään esimerkiksi olevia tietoja katso lisätiedosto 5 kuvassa S2. Kuvio 2 ilmentäminen esimerkiksi geenien kultakin monistettiin geenivirhe poikki tutkittavat näytteet varmistettiin Q-PCR: llä. Punaisia ​​pisteitä tarkoittavat syövän näytteitä ja valkoisia pisteitä merkitsevät normaalia näytteitä. Y-akseli kuvaa mRNA: n runsaudesta.
Kuvioon 3 Mutaatiotutkimukset profiilia näytteitä. Kudosnäytteitä näkyvät yläosassa ja merkinnät koske heitä ovat sarakkeissa alla. Punainen laatikot tarkoittavat DNA: n monistuksen ja yhdenmukaisia ​​mRNA yli-ilmentymisen, oranssi laatikot tarkoittavat RNA yliekspressio ilman viitteitä DNA vahvistus, punaisia ​​pisteitä tarkoittavat DNA: n häviäminen. Siniset laatikot merkitsevät somaattinen nonsynonymous mutaatio validoitu Sangerin sekvensoinnilla ja violetti laatikot merkitsevät nonsynonymous somaattisista mutaatioista, havaittiin Illumina tietoja ei yritä vahvistaa Sangerin sekvensoinnilla. Amino muutokset on merkitty laatikoihin ja muutokset johtavat menetykseen tai voitto lopetuskodonin ovat punainen teksti.
Sekvensointitiedot osoittaa korkea yhteensopivuutta genotyypityksen
Sequencing kirjasto valmistelu epäonnistui kuuden alkuperäisen 50 syöpänäytteissä ja neljätoista alkuperäisen vastaaviin normaaleihin näytteitä. Siksi kaksi pareittain lisättiin analyysin tuloksena aineisto 44 syöpänäytteissä, 36 Hyväksytty normaali parit (lisätiedosto 1 taulukko S1). Kohdealueella sisältyi 3,28 MB poikki 6547 ainutlaatuinen eksonien 384 geeneistä (lisätiedosto 2 taulukko S2). Mediaani kattavuus kaikissa näytteissä oli 88,3% ja laski 74%, kun ne vaativat vähintään kattavuus 20. Kaikki sekvensointi suorittaa vähintään 110x keskimääräinen luku kattavuus poikki rikastetun genomialuetta jokaisesta näytteestä. Lukuoperaatioista linjattu vastaan ​​Ihmisen genomin ja varianttien viite genomista kutsuttiin. Kontrollina analyysi vertailla genotyyppi puhelut Affymetrix V6 SNP paneelit ja Illumina sekvensointi suoritettiin. Alueet suunnattu sekvensointiin sisälsi 1005 loci kuulu Affymetrix V6 SNP taulukot. Joilla ei suodatus sekvensointi variantin vaatii laadun mittareita, mediaani välisen genotyypityksen ja sekvensoinnin tuloksista oli 97,8% vaihteluväli 65-99% (lisätiedosto 6a, kuva S3a). Raaka yleinen genotyyppi puhelu konkordanssin oli 96,8%. Laatumittoja valittiin maksimoimaan välinen sopimus genotyypityksen ja sekvensoinnin puhelut minimoiden vääriä negatiivisia. Kaikkein informatiivinen metristä konsensus laatu ja cut-off ≥50 johti tappiota noin 10%: n yhteinen genotyyppien mutta yleinen 2% lisäys yhdenmukaiset 98,7% (lisätiedosto 6b, kuva S3b). Variant genotyyppi vaatii eristettiin edelleen konkordanssia analyysiä. Tässä kokoonpanossa, variantti laatu kynnyksen > 0 lisääntynyt tarkkuus variantin genotyypin puhelut 98,9% (lisätiedosto 6c, kuva S3C). Kun molemmat laatu kynnysarvot levitettiin mediaani näyte concordance on 99,5% (lisätiedosto 6d kuvassa S3D), joka on alueella genotyypityksen array virhe. Kuusi näytettä (08362T1, 08373T2, 336MHAXA, 08337T1, 89362T2, DV41BNOH) oli konkordanssin < 98% ja kaksi näistä (08393T2 ja DV41BNOH) oli konkordanssin 82% ja 88% vastaavasti. Siksi kanssa yhteisymmärrykseen laatu ≥ 50 ja variantti laatu > 0, väärien positiivisten oli 0,5% ja 1,6% viitteeksi genotyyppien ja variantti genotyyppejä, vastaavasti (lisätiedosto 6e kuvassa S3e).
Kaikista yhden nukleotidin muutokset kulkee edellä kynnysarvot, kaikki vaihtoehdot läsnä missään tavanomaisessa näytteiden tai polymorfismin tietokantoihin dbSNP (v130) tai 1000 genomien oletettiin olevan ituradan variantteja ja heitettiin pois. Vaihtoehdot läsnä vain eksonit syövän näytteiden oletettiin olevan somaattisten ja säilytetään. 18549 somaattiset variantit havaittiin yhteensä kaikissa 44 näytettä (lisätiedosto 7 Taulukko S4), 3357 ennustettiin olevan eksoni ja nonsynonymous. Priorisoida mutaatioiden kanssa toiminnallisia vaikutuksia me keskittää kaikki edelleen analyysejä nonsynonymous mutaatioiden ja korosti mutaatioita mikä johtaa tai voitto lopetuskodoneja. Olemme soveltaneet SEULOA algoritmi [48] ennustaa aminohapon muutoksia, joita ei suvaita evoluution ja niin ovat todennäköisesti vaikuttaa proteiinin toimintaa, 1509 somaattisten nonsynonymous mutaatiot ovat SEULOA pisteet < 0,05. Nopeus mutaatioiden kanssa SEULOA pisteet < 0,05 per geeni, korjattuna CDS pituus laskettiin (4). Kuvio 4 esittää, geenit, joilla on korkein pitoisuus alhainen SIFT teki mutaatiot olivat S1PR2
, LPAR2
, SSTR1
, TP53
, GPR78
ja RET
, jossa S1PR2 on eniten äärimmäinen. On viisitoista mutaatiot SEULOA pisteet < 0,05 poikki 353aa CDS on S1PR2
, keskittynyt yhdeksää näytettä. S1PR2
tunnetaan myös EDG5
koodaa G-proteiiniin kytkeytynyt reseptori S1P ja aktivoi RhoGEF, Larg
[49]. Tiedetään vähän sen roolia syövän ja somaattisista mutaatioista ei ole havaittu 44 kudoksissa sekvensoitiin S1PR2
kosmisessa tietokantaan [50]. Kuva 4 Pylväsdiagrammi nopeuden vahingollisten mutaatioiden poikki geeni sekvensoitiin. Geenit sekvensoitiin näkyvät x-akselilla. Määrä vahingollisia somaattisten nonsynonymous mutaatioita todettiin kummassakin geenissä /aminohappojen lukumäärän kussakin CDS piirretään.
Sekvensointitiedot vahvistetaan Sangerin sekvensoinnilla
Jotkut nonsynonymous somaattiset mutaatiot valittiin vahvistavan Sangerin sekvensoinnilla. Kaikki mutaatiot raportoitu sinisellä kuvassa 3 varmistettiin Sangerin sekvensoinnin ja vahvistettiin myös olevan somaattisten sekvensoimalla villityyppisen sekvenssin sovitetussa normaalia kudosta (katso lisätiedosto 8 Kuva S4 esimerkiksi sekvensointi jälkiä). Vaikka 74% vahvistettiin, jotkut mutaatiot havaitaan Illumnia sekvensointi ei vahvistettu somaattiset mutaatiot Sangerin sekvensoinnilla. Kuusitoista 68 (24%) mutaatioita yritimme vahvistaa olivat läsnä normaalissa ja syöpä näyte, nämä ovat ituradan mutaatioita, mutta ei havaittu missään tavanomaisessa näytteiden Illumina sekvensointi ja myöskään edustettuina dbSNP tai 1000 genomien tietoja. Viisi kuudestatoista ituradan mutaatioista olivat syöpään näytteiden Ei hyväksyttyjä normaalia kudosta sisällytetty aineisto, muut yksitoista tuli syöpänäytteissä Hyväksytty normaalia kudosta sekvenssi sisältyy aineisto. Tämä todistaa nopeudella ituradan saastuminen ei poista sovitetun normaalin valvonnan tai verrattuna tunnettu polymorfismi tietokantoihin. Saattaa olla, että kattavuus vaihdot normaalissa kudoksessa sattuu olemaan alhaisempi kuin syöpä näytteen ja niin jotkut ituradan mutaatioita huolimatta jäljelle jää somaattisen suodattimia. Kaksi 68 (3%) mutaatioita yritimme vahvistaa eivät olleet normaalissa tai syöpä näyte Sangerin sekvensoinnilla. Yksi syy voisi olla vääriä positiivisia että Illumnia tietojen takia tekotuote; kuitenkin lisätiedosto 6 Kuva S3 esittää vääriä positiivisia vähäiseksi ainakin niille varianttien edustettuna Affymetrix V6 taulukot. Toinen mahdollisuus on, että nämä ovat läsnä osajoukko näytteen alapuolella herkkyys Sanger menetelmää, mutta havaitsee Illumina sekvensoinnilla. Siksi mutaatiot raportoitu Illumina sekvensointi on myös esitetty violetti kuvassa 3, jotkut on varovaisuus Tuloksia tulkittaessa, koska ne voivat olla ituradan polymorfismien tai läsnä vain osajoukko kasvaimen näytteen.
Muutokset RAS /RAF /MEK /ERK-reitin
Kolme kasvaimen näytteillä oli KRAS
geneettisiä muutoksia (kuvio 3), mikä viittaa terapeuttisen mahdollisuuden hoidon MEK-inhibiittoreita. Yksi näistä muutoksista on G12D mutaatio. KRAS
G12D mutaatioita on osoitettu aloittaa karsinogeneesiin ja tuumorin eloonjäännin kannalta [51]. Vahvistusta ja yli-ilmentyminen villityypin KRAS
nähtiin muissa 2 näytettä. KRAS
vahvistus on havaittu aikaisemmin 5% ensisijaisen syöpien. Mahasyövän solulinjoja villityyppiseen KRAS
vahvistus näytä konstitutiivisen KRAS
aktivaation ja herkkyys KRAS
RNAi Knockdown [24]. Romaani mutaatio KRAS
havaittiin myös; (Näytteessä 08393) toiminnallinen seurauksena on tuntematon.
PIK3CA
mutaation kanssa samanaikaisesti esiintyvien KRAS
G12D, tiedetään vaikuttavan herkkyys MEK-inhibiittoreita [25]; Lisäksi uusia mutaatioita tässä tutkimuksessa havaitut saattaa myös olla vaikutuksia samaan luokkaan terapeuttisten. Esimerkiksi: ksr2
toimii molekyyli tukirakenne edistää ERK signalointi [52, 53]. Siksi mutaatiot ksr2
kuten nähdään seitsemän näytteet voivat vaikuttaa herkkyyttä MEK estäjiä. Toinen esimerkki on ULK1
, joka positiivisesti ohjaa autophagy alavirtaan mTOR [54] ja se on mutatoitunut neljätoista näytteissä. Autophagy nostetaan yhdessä ERK-fosforylaation kun mahasyövän soluja käsitellään proteasomin estäjä [55], siis mutaatiot ULK1
voi vaikuttaa herkkyys proteasomaalisten estäjä hoitojen, kuten bortetsomibihoitoon yksittäisenä aineena tai yhdistelmänä MEK estäjien.
Muutokset PI3K /AKT-reitin
oli huomattavaa järjestyksessä häiriöitä fosfoinositidi-3-kinaasi (PI3K) reitin geenit näytteessä asetettu. On olemassa useita PI3K /AKT /mTOR-estäjät, kliinisessä vaiheessa ja potilaat on aktivoivia mutaatioita koulutusjakson ovat ehdokkaita hoitoon [56]. PIK3CA
mutaatioita tunnettuja onkogeenisuustutkimuksessa löytyi neljä näytettä. Tämä johtaa usein PIK3CA
hotspot mutaatio 9%, mikä on hieman suurempi kuin aikaisemmissa arviot 6% (12/185) [27] ja 4,3% (4/94) [57]. Yhteinen PIK3CA hotspot mutaatioita tunnettujen onkogeenisuustutkimuksessa (E545K ja H1047R) [58] havaittiin kaksi kertaa. Toinen mutaatio PIK3CA
K111E, joka on havaittu myös aiemmin neljä näytettä KOSMINEN, havaittiin kerran ja mahdollisesti uusia somaattiset mutaatiot havaittiin kaksi näytettä.
Viisi nonsynonymous AKT1
mutaatioita havaittiin. Vaikka AKT1
mutaatioita esiintyy noin 2% kaikista syövistä, he lähinnä esiintyvät aminohapon 15 ja toiminnallinen merkitys mutaation muissa kohdissa on tuntematon. Toinen nonsynonymous mutaatio AKT2
havaittiin näytteessä 08407. AKT2
mutaatiot ovat paljon harvinaisempia kuin AKT1
mutaatioita, vaikka AKT2
mutaatio on havaittu aikaisemmin mahasyöpä kello 2% taajuus [ ,,,0],59]. Lopuksi mutaation PTEN
tai mTOR
voivat vaikuttaa vastaus polkuun estäjiä. Useat PTEN
mutaatiot ovat huomattava ja mTOR
mutaatiot ovat yleisiä.
Muutokset Reseptorityrosiinikinaasit
reseptorityrosiinikinaasit (RTK: t) ja huumeiden tavoitteet EGFR
, erbB2:
ja MET
olivat kukin monistettiin (log2 > 0,6) ja yli-ilmentyy RNA-tasolla yhdessä syövän näytteessä. Tästä seuraa, että kasvaimet voivat olla herkkiä inhibiittorit monistetun RTK: iden. Lisäksi, useita nonsynonymous mutaatiot havaitaan niiden koodaavat alueet. Loppupään mutaatioiden voisi odottaa vaikuttavan vasteen. Esimerkiksi MET
monistettu näyte Typistävä mutaatio AKT3
voi vaikuttaa herkkyys MET estäjiä.
FGFR2
vahvistetaan ja RNA yli-ilmentynyt kaksi näytettä, on olemassa myös useita mutaatioita FGFR1
-4. Laaja valikoima RTK-estäjien, joiden kohteena ovat FGFR: ää muun kinaasien, voi olla tehokas näillä potilailla [60, 61].
Alterations in Cell Cycle proteiinit
viruksen onkogeeni homologin SRC
on mutatoitu neljä tuumorin näytteet, kaksi mutaatioiden ennustetaan vaikuttavan haitallisesti, mukaan lukien käyttöönotto lopetuskodonin. Tämä voi counter-osoittaa SRC estäjiä. MET
vahvistus on myös tunnettu resistenssimarkkeri anti-SRC terapeuttisten kuten dasatanib [62, 63]. Solusyklin liittyvä kinaasi, AURKA
monistettiin ja yli-ilmentynyt yksi näyte. AURKA inhibiittorit ovat kehitteillä kiinteisiin kasvaimiin [37] ja voidaan ilmoittaa tässä tapauksessa. CCNE1
monistettiin kahdessa näytteessä (08390 ja 08357). Korkea CCNE1
on osoitettu olevan liittyy usein varhainen ja mahalaukun syövän etäpesäkkeiden mutta ekspressiotasot eivät korreloi selviytymisen [64, 65]. Korkea CCNE1
tasolla on ehdotettu herkkyys markkeri-geenin suunnattu pro-drug entsyymi-aktivoitu hoitojen [66]
aktivointi wnt-reitti on yleinen karsinoomanäytteistä
Mutaatiot havaittu APC
geenin 22 näytettä. APC on tuumorisuppressorina tiedetään aktivoivan CTNNB1 ja Wnt-reitin signalointi muun vaikutukset [67]. Wnt-polku on aiemmin havaittu olevan usein aktivoida mahasyövässä [68]. Käytimme transkription allekirjoituksen, aikaisemmista tutkimuksista saadut [69, 70] ja saatavilla Broad-instituutin MSigDB tietokanta luokitella tutkittavat näytteet niiden Wnt transkription allekirjoitukset. Kuvio 5A esittää lämpöä kartta transkription tasot WNT allekirjoituksen geenit aineistot. Aktivaatio tämä reitti on suurempi lähes kaikki syövän näytteet verrattuna normaaliin näytteitä. Wnt-inhibiittorit ovat kiivaasti tutkimuksen lääketeollisuuden ja akateemisen tutkimuksen [71-73]. Nämä tulokset viittaavat siihen, heillä maininta mahasyövän sekä monia muita syöpiä. Kuva 5 Transkription allekirjoituksia poikki näytteitä. Klusteroitu heatmap osoittaa ilmaus Wnt- allekirjoitus geenien ja B siili allekirjoitus geenit, poikki näytteitä tutkimuksessa. Kaikki ilme arvot ovat Zscore normalisoitu. Zscore < -1 ovat sinisiä, Z-score > 1 ovat punaisia ​​asteittaisella väritys läpi valkoisen 0. Näyte nimet ovat x-akselin, ne ryhmitellään ekspressiokuviota ja näytteet, joilla on suuri allekirjoitus tulokset ovat oikealle. Näytteet, joissa somaattiset nonsynonymous APC mutaatioita (A) tai PTCH1 mutaatioita (B) ja merkitty tähdellä yläpuolelle lämpökarttoja. WNT allekirjoitus geenit (ylhäältä alas): FSTL1, DACT1, CD99, LMNA, SERPINE1, TNFAIP3, GNAI2, ID2, MVP, ACTN4, CAPN1, LUZP1, MTA1, RPS19, PTPRE, AXIN2, NKD2, SFRS6, CCND1, SCAP, CPSF4 , SENP2, DKK1, PRKCSH, SLC1A5, HDGF, CBX3, SCML1, PCNA, RPS11, SNRPA1, TGM2, LY6E, IFITM1, NSMAF, TCF20, BCAP31, AXIN1, AGRN, PLEKHA1, SLC2A1, CTNNB1, EIF5A, IMPDH2, GSK3b, PFN1 , UBE, MAP3K11, ARHGDIA, HNRPUL1, FLOT2, GYPC, NCOA3, CENTB1, SYK, POLR2A, KRT5, DHX36, ELF1, SMG2, FGD6, MAPKAP1, LOC389435, RPL27A, SRP19, RPL39L, SFRS2IP, FUSIP1
; Hedgehog allekirjoitus geenit (ylhäältä alas): LRFN4, JAG2, RPL29, WNT5A, SNAI2, FST, MYCN, BMP4, CCND1, BMI1, CFLAR, PRDM1, GREM1, FOXF1, CCND2, CD44
.
Aktivointi hedgehog-reitti on myös yleinen karsinoomanäytteistä
PTCH1
on tuumorisuppressori ja toimii reseptorina hedgehog-ligandien ja estää toiminnan smoothened. Kun tasoitetaan on vapautettu, se signaalit solunsisäisesti johtaa aktivoinnin GLI transkriptiotekijöiden [74]. Useita somaattiset mutaatiot PTCH1
kirjataan COSMIC, sopusoinnussa sen kasvaimia estävä rooli.

• Downregulation SPARC ilmaisun pienenee mahasyövässä solujen invaasiota ja selviytymisen
• BRCAA1 monoklonaalinen vasta-aine on konjugoitu fluoresoiva magneettisia nanohiukkasia in vivo kohdennettujen magnetofluorescent kuvantamiseen mahasyöpä