spécifique du virus de la méthylation des gènes humains dans des cellules de cancer de l'estomac d'Epstein-Barr

Epstein-Barr virus-méthylation spécifique des gènes humains dans des cellules de cancer gastrique
Résumé de l'arrière-plan
virus Epstein-Barr (EBV) se trouve dans 10% de tous les adénocarcinomes gastriques, mais son rôle dans le développement des tumeurs et des restes d'entretien pas clair. L'objectif de cette étude était d'examiner dysrégulation EBV médiée des facteurs cellulaires impliqués dans la carcinogenèse gastrique.
Méthodes
Gene expression patterns ont été examinés dans EBV-négatif et les cellules gastriques AGS EBV positives épithéliales en utilisant une puce à faible densité, PCR inverse de la transcription, colorants histochimiques et le séquençage d'ADN spécifique de la méthylation. Résultats de l'expression de PTGS2 (COX2) a été mesurée dans les cellules AGS et dans les tissus d'adénocarcinome gastrique primaire.
Dans les études de tableau, près de la moitié des 96 gènes humains testés, ce qui représente 15 voies de transduction du signal liées au cancer différents, ont été dérégulé après l'infection par EBV. La transcription inverse PCR a confirmé impact significatif sur les facteurs ayant diverses fonctions telles que la régulation du cycle cellulaire (IGFBP3
, CDKN2A, CCND1, HSP70, ID2, ID4)
, réparation de l'ADN (BRCA1, TFF1
), l'adhésion cellulaire ( ICAM1
), l'inflammation (COX2
), et de l'angiogenèse (HIF1A
). Déméthylation à l'aide de 5-aza-2'-désoxycytidine a inversé la dysrégulation à médiation par EBV pour l'ensemble des 11 gènes énumérés ici. Pour certaines séquences de promoteur, des îlots CpG méthylation et la déméthylation se sont produites dans un motif spécifique au VEB comme représenté par séquençage d'ADN au bisulfite. Immunohistochimie était moins sensible que était western blot pour détecter la régulation négative de COX2 lors de l'infection par l'EBV. Conclusions dysrégulation liées au Virus-niveaux COX2 in vitro
n'a pas été récapitulés in vivo
parmi les tissus de cancer gastrique infectés naturellement. de s EBV modifie l'expression du gène humain de manière qui pourraient contribuer à la pathobiologie unique de virus cancer -Associated. En outre, la fréquence et la réversibilité des altérations de la transcription liés à la méthylation suggèrent que les agents déméthylation ont un potentiel thérapeutique pour la gestion de cancer lié à l'EBV.
Contexte
Le cancer gastrique est le quatrième type le plus commun de cancer et la deuxième cause de cancer décès dans le monde [1]. Une variété de modifications génétiques, ainsi que des agents infectieux et d'autres facteurs environnementaux semblent être des facteurs dans la cancérogenèse gastrique. le virus d'Epstein-Barr (VEB), un gammaherpesvirus d'ADN double brin, se trouve dans les cellules malignes dans 10% des adénocarcinomes gastriques, et l'infection semble précéder la transformation maligne [2]. observations fondamentales et cliniques suggèrent que les cancers gastriques associés à l'EBV ont un pathobiology différent de cancers gastriques EBV négative [3-8]. Conception rationnelle de la thérapie virale dirigée nécessite une meilleure compréhension du rôle pathogène de l'EBV dans la carcinogenèse gastrique.
Des études antérieures ont montré une perte de trois produits critiques du gène suppresseur de tumeur, CDH1 (E-cadhérine), p73, et CDKN2A (p16 ), dans les cancers gastriques infectées par l'EBV [9-18]. Associée au virus de la méthylation de ces gènes, ainsi que la preuve de la méthylation globale de l'ADN dans les cancers du EBV-positifs, donne à penser que les cancers gastriques liées à l'EBV sont un sous-ensemble d'îlots CpG methylator phénotype (PSEC), les cancers [4, 11, 19-26]. Un médiateur potentiel est l'ADN méthyltransférase 1 (DNMT1)
qui est régulée à la hausse dans les cancers gastriques naturellement infectés et pourraient aider à établir les profils de méthylation propagées aux cellules filles lors de la division cellulaire [21, 27-29]. Les études en cours visent à comprendre le rôle de l'infection EBV et Helicobacter pylori dans l'inflammation et hypermethylation globale associée au développement du cancer gastrique [22].
Dans les modèles de lignées cellulaires, DNMT1 surexpression est médiée par EBV LMP1 et LMP2 [21, 28 -31]. VEB semble employer des mécanismes épigénétiques pour contrôler le transcriptome hôte et aussi pour contrôler l'expression de ses propres gènes codés par le virus [11, 12, 14, 15, 19, 21, 24, 29, 32, 33]. Lors de l'infection initiale d'une cellule, le génome viral non méthyle peut subir une réplication virale avec une nouvelle production de virions, tandis qu'un sous-ensemble de cellules infectées acquérir un génome viral hautement méthylée qui squelches l'expression de protéines étrangères et médie la persistance virale à long terme par l'intermédiaire d'une infection latente [23, 34]. Les tumeurs infectées ont tendance à avoir un ADN VEB hautement méthylée, et le silençage liés à la méthylation des gènes viraux permet d'expliquer comment les tumeurs infectées échapper à la destruction immunitaire.
Bien que la méthylation des promoteurs de gènes est typiquement associée à une régulation négative de la transcription
via la liaison sélective des protéines répresseurs , la première protéine jamais montré pour lier et activer
un promoteur méthylé était EBV BZLF1, le facteur clé contrôlant le passage de latente aux formes réplicatives d'infection virale [35]. Il semble que le virus a habilement évolué un moyen de surmonter la méthylation du promoteur à son avantage [34, 35]. stratégies antivirales sont explorées pour leur potentiel antinéoplasique. Fait intéressant, les agents les plus couramment utilisés antiviraux, l'acyclovir et le ganciclovir, sont efficaces pour arrêter la réplication virale, mais ils ne suppriment pas l'expression des gènes viraux lytiques latents et précoces comme LMP1, LMP2 et BZLF1.
Les implications cliniques de l'EBV méthylation lié du génome du cancer gastrique sont immenses. Tout d'abord, les données émergentes montre le potentiel pour améliorer le diagnostic du cancer gastrique en testant les lavages gastriques pour les profils de méthylation spécifiques du cancer, peut-être conjointement avec des tests pour identifier VEB le sous-ensemble infecté par le virus de cancers [36-40]. Différents schémas de méthylation de promoteur dans le virus positif par rapport aux cellules de type virus négatif [11, 21, 24] insistent sur la nécessité de caractériser les profils de méthylation d'une manière qui maximise la sensibilité du dosage pour la détection du cancer. L'infection et l'ADN modifié méthylation semblent être les événements précoces de la cancérogenèse [2, 41], la détection potentiellement faciliter des lésions précancéreuses dans le jus de l'estomac.
Une deuxième implication clinique est le potentiel d'amélioration de traitement du cancer à l'aide de médicaments gastriques qui inversent la effet de promoteur hypermethylation [42, 43]. En particulier, les agents déméthylation qui inhibent l'ADN méthyltransférase et inverser suppresseur de tumeur silençage génique ou l'activation des oncogènes sont des stratégies antinéoplasiques potentiels [43]. Il faut tenir compte des différences possibles dans l'effet des agents de déméthylation dans le virus positif par rapport
virus négatif tumeurs [43-45]. Nous et d'autres ont montré que les cancers gastriques naturellement infectés ont CDKN2A inférieur (p16) expression [14, 15]. Dans un essai clinique de fluorouracile (5FU) pour le cancer gastrique, le statut de méthylation du promoteur de CDKN2A était un facteur prédictif indépendant de la survie [46]. La justification de l'utilisation d'agents de déméthylation comme 5-aza-2'-désoxycytidine dans les essais cliniques repose sur des preuves scientifiques que la déméthylation thérapie modifie les propriétés tumorigènes des cellules cancéreuses.
Plusieurs chercheurs ont des lignées de cellules épithéliales avec succès infectés par l'EBV dans
vitro
[47, 48]. Dans l'étude actuelle, EBV-positifs et les cellules cancéreuses gastriques AGS EBV-négatifs ont été examinés pour des différences dans les profils d'expression de gènes en utilisant une analyse de puces à ADN de faible densité et de transcription inverse réaction en chaîne par polymérase (rtPCR). AGS est une lignée cellulaire qui a été initialement cultivées à partir de tissu adénocarcinome gastrique et est maintenant largement utilisé comme modèle de cancer gastrique. Le rôle de la méthylation de l'ADN dans la médiation des effets sélectionnés a été étudiée par séquençage d'ADN au bisulfite et en testant la capacité d'un agent de déméthylation pour inverser l'effet de l'EBV sur le silençage génique. Les résultats ont révélé une vaste dysrégulation de gènes lors de l'infection par l'EBV dans les cellules AGS avec la preuve que la méthylation du promoteur est responsable, au moins en partie. Inversion des effets de transcription associés au virus suggère que les agents déméthylation devraient être explorées pour leur potentiel pour contrôler la croissance des tumeurs malignes liées à l'EBV
. Méthodes
cellulaires __gVirt_NP_NNS_NNPS<__ Lines cancer gastrique
La lignée cellulaire de cancer gastrique AGS (ATCC CRL 1739) a été cultivée dans le milieu de Eagle modifié par Dulbecco contenant du sérum bovin fœtal à 10% (inactivé à la chaleur pendant 20 minutes à 65 ° C) et 1% de pénicilline-streptomycine (10000 unités de pénicilline, 10 000 ug /ml de streptomycine, Gibco, Carlsbad, CA) . Les cellules ont été infectées par une souche de EBV recombinant (un don du Dr Henri J. Delecluse) [33, 49, 50] qui a été conçu pour exprimer la protéine verte fluorescente (GFP) et la résistance à l'hygromycine B par clonage de ces gènes dans le B95 prototypique .8 souche de EBV où la deuxième copie de oriLyt réside normalement. Avant l'infection, les cellules AGS ont été transfectées avec 1 pg d'un codage CD21 vecteur d'expression (le récepteur EBV) et un gène de résistance à la puromycine en utilisant Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN) comme décrit précédemment [51]. A 48 heures après la transfection, les cellules contenant CD21 ont été sélectionnées positivement à l'aide de 0,5 pg /ml de puromycine-HCl (Roche). Les stocks viraux recombinants de l'EBV ont été générés dans des cellules 293 de rein humain, une lignée de cellules épithéliales embryonnaires, en induisant la replication lytique en utilisant 20 ng /ml de phorbol-12-acétate tétradécanoate 13 mM de butyrate 3. On a récolté les surnageants de 3 jours après l'induction, on filtre (0,8 pm) et congelées à -80 ° C jusqu'à utilisation. les cellules AGS résistant à la puromycine ont été étalées à raison de 50% de la densité maximale de 60 mm dans des boîtes de culture tissulaire et co-incubées avec 1 ml de la virions. Quatre jours plus tard, les cellules AGS infectées par l'EBV (maintenant appelé AGS-B95-hygB) ont été sélectionnées positivement avec 100 pg /ml d'hygromycine B (Roche).
Empreintes génétiques a confirmé que les cellules AGS utilisées dans cette étude correspondent le génotype les cellules AGS de la American type Culture Collection. Dactyloscopie a été fait en utilisant le kit PowerPlex 1.2 STR (Promega), suivie par électrophorèse sur un 310 capillaire instrument d'électrophorèse sur gel ABI (Applied Biosystems).
Gene Expression par Taches de histochimiques Les blocs de paraffine ont été préparés à partir de AGS et AGS-B95- lignées cellulaires hygB, et des blocs de paraffine de adénocarcinome gastrique primaire ont été récupérées à partir des archives cliniques. Les échantillons cliniques résiduels représentent tous les cancers disponibles EBV positifs gastriques (n = 9) et une sélection aléatoire des cancers gastriques EBV-négatif (n = 9). colorants histochimiques ont été appliquées à des sections de paraffine pour confirmer l'infection et d'évaluer l'expression génique. Pour préparer des blocs, des cellules cultivées ont d'abord été rincées dans un tampon phosphate solution saline de Dulbecco (Gibco, Invitrogen), récolté avec 0,25% de trypsine (Gibco, Invitrogen), empêtré dans un caillot en utilisant Dade Ci-Trol Coagulation Control (citraté) -Level 1 (Dade Behring, Marburg, Allemagne) et la thrombine 200 (Pacific Hémostase, Middletown, VA), fixé à 10% de formaline tamponnée, noyé dans de la paraffine et sectionnée sur des lames revêtues.
EBER
hybridation in situ de a été réalisée utilisant EBER
sonde marquée à la fluorescéine et de la sonde oligo (d) de contrôle de T sur un indice de référence du système d'hybridation de situ (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) dans. immunohistochimiques pour les protéines d'EBV LMP1 et LMP2 ont été effectuées comme décrit précédemment [52] en utilisant la récupération du citrate de l'antigène et le cocktail CS1-4 d'anticorps monoclonaux de souris contre LMP1 (1: 100, Dako, capinteria, CA) et l'anticorps E411 monoclonal de rat contre le LMP2 (1 mg /ml, Asencion, Munich, Allemagne). sections de paraffine de lié à l'EBV lymphome de Hodgkin et syndrome lymphoprolifératif post-transplantation ont servi de témoins positifs
L'analyse immunohistochimique des protéines réplicatives EBV BMRF1 et BZLF1 a été réalisée à l'aide-E31 G3 (1 anti-BMRF1 clone:. 200 dilution, Research Diagnostics , Inc., Flanders, NJ) et anti-BZLF1 clone BZ.1 (01h25 dilution, Dako, Carpinteria, CA), tandis que PTGS2 humaine (familièrement appelé cyclooxygénase-2, COX2) a été analysée en utilisant un anticorps monoclonal anti-COX2 ( dilution 1: 200, Cayman Chemical). Les sections ont été incubées avec l'anticorps primaire pendant 30 minutes à 37 ° C pour les cibles EBV, ou à 4 ° C pendant une nuit pour la COX-2, en utilisant les protocoles de détection et de blocage dans le kit Super-Sensitive Detection non biotine HRP (Biogenex). L'anticorps lié a été détecté en utilisant chromogène diaminobenzidine (Biogenex) et les cellules ont été contre l'hématoxyline (Dako). sections de paraffine de leucoplasie orale chevelue ont servi de contrôle positif pour EBV lytique, tandis que l'amygdale réactif et tissus de carcinome du nasopharynx ont servi de témoins pour les taches COX2. Les résultats ont été interprétés par la notation microscopique des cellules malignes dans ≥10 champs à un grossissement de 400x donnant un score de proportion moyenne (0 = aucun, 1 = < 1%, 2 = 1-10%, 3 = 10-33%, 4 = 33 -66%, 5 = > 66% des cellules) et le score d'intensité (0 = aucun, 1 = faible, 2 = intermédiaire, 3 = forte coloration). Détection de scores totaux ont été comparés en EBV positifs par rapport
tumeurs négatives en utilisant un test t non apparié de Mann-Whitney. Du génome de EBV
Une batterie de quantitative PCR en temps réel (Q-PCR) ciblant six disparates des régions du génome de l'EBV a été utilisé pour démontrer que l'infection virale des cellules AGS a réussi. Les produits amplifiés ont été détectés en utilisant l'instrument ABI Prism 7500 PCR en temps réel avec le logiciel Sequence Detection System (Applied Biosystems) tel que décrit précédemment en utilisant des amorces ciblant le
BamH1W, EBNA1
, LMP1
, LMP2
, et BZLF1
régions du génome de l'EBV [52] ou EBER1 d'ADN [53]. Pour vérifier la contamination de l'amplicon, chaque course contenait au moins deux commandes "pas de modèle" dans lequel H2O sans nucléase a été substitué pour le modèle.
ARN de faible densité ADNc Microarray analyse a été isolé à partir d'AGS et AGS-B95- hygB cellules en utilisant le kit RNeasy RNA Mini (Qiagen), après la première utilisation de la colonne QIAshredder ™ (Qiagen) pour lyser les cellules. Après confirmation de l'intégrité de l'ARN en utilisant un Bioanalyseur Agilent, l'analyse des microréseaux expression a été réalisée par SABiosciences Corporation (Frederick, MD) en utilisant leur GEArray Q Series Human transduction de signal dans le Cancer Gene Array. Cette microarray basse densité est constitué de 96 sondes qui testent l'activation de 15 voies de signalisation impliquées dans l'oncogenèse. (transcrits cibles sont répertoriés dans les résultats.) ADNc marqués à la biotine préparés à partir de 10 pg de chaque échantillon d'ARN en utilisant la méthode AmpoLabeling-(LPR SABiosciences) a été hybride à la matrice, et la détection de chimioluminescence a été réalisée en utilisant une caméra CCD. valeurs d'intensité premières intégrées pour chaque spot ont été générés par le logiciel GEArray Analysis Suite (SABiosciences), et une analyse plus approfondie et la normalisation a été réalisée en utilisant Microsoft Excel. La valeur de l'intensité du point le plus bas de chaque tableau a été considéré comme arrière-plan et a été soustraite de chaque valeur d'intensité brute pour chaque sonde, puis intensités ponctuelles ont été normalisées à celle du gène de ménage, déshydrogénase glyceraldehydephosphate (GAPDH
). Une comparaison appariée des niveaux d'expression des gènes a été faite entre les cellules EBV-positifs (AGS-B95-hygB) et les cellules AGS EBV négative des parents. Si le rapport était ≥2 ou ≤0.5, le gène a été considéré comme étant dérégulée ou régulée à la baisse dans les cellules infectées.
SYBR Green rtPCR
semi-quantitative Pour confirmer microarray sélectionné les résultats de l'expression des gènes, rtPCR a été réalisée en utilisant Real-Time RT <sup>2 amorces de PCR spécifiques du gène (SABiosciences). Le kit ReactionReady ™ First Strand cDNA Synthesis (SABiosciences) a été utilisé pour convertir 3 pg d'ARN en ADNc, et l'ADNc a été dilué à 1:10 avant l'analyse par PCR. Les 38 cDNA suivants ont été ciblés: GAPDH, A2M, ABCB1, BCL2L1, BIRC1, BIRC2, BIRC3, EN1, GADD45, HIF1A, ID2, IGFBP3, BRCA1, TMEPAI, IRF1, BCL2, BMP4, CDKN2A (p16), FN1, HK1, ICAM1, IL2, CCND1, MDM2, COX2 (PTGS2), TFRC, WISP1, TRAF1, CDK2, VCAM1, CDKN2C (p18), CDKN1A (p21), DUSP1, HSP70, NFKB1, TNFSF10, TRIM25
et FOSL1
. Les réactions ont été effectuées dans un volume total de 25 ul contenant 1X TaqMan ® Universal Mix (ABI), RT 2 spécifique du gène jeu de mélange d'amorces (10 uM de chaque amorce, SABiosciences), 2,5 pl 5X SYBR solution verte ( Molecular Probes, Eugene, OR), et 5 pi de matrice d'ADNc. conditions de thermocyclage étaient les suivantes: 50 ° C pendant 2 minutes, 95 ° C pendant 10 minutes, et 40 cycles de 95 ° C pendant 15 secondes et 60 ° C pendant 1 minute sur un appareil ABI 7500 avec le logiciel Sequence Detection System (Applied Biosystems). Le même seuil a été utilisé pour chaque gène et la plaque évaluée par le protocole "Quantification Relative Plate". Chaque réaction de PCR a été effectuée en triple pour chaque échantillon sur deux plaques à 96 puits distinctes, et les résultats ont été moyennées pour déterminer des différences relatives dans le niveau d'expression de chaque gène dans le EBV-positifs par rapport à
lignée de cellules EBV-négatifs.
Minor Groove Reliure sonde semi-quantitative rtPCR
Pour évaluer l'expression de cinq gènes sélectionnés qui ne sont pas sur la puce décrite ci-dessus, des tests semi-quantitatifs rtPCR ont été réalisées (Assays-on Demand, Applied Biosystems) en utilisant des sondes de liaison de gorge mineure ciblant hélicase-like transcription facteur (HLTF
), lotier factor-1 (TFF1
), fermeture éclair facteur de transcription de base-leucine ATF-like (BATF
), un inhibiteur de l'ADN de liaison protéine-4 (ID4
), et Nucleostemin (NU
). Ces cinq ont été choisis parce qu'ils seraient dérégulée dans une proportion substantielle des adénocarcinomes gastriques ou cancers liés à l'EBV [32, 54-59]. GAPDH
servi comme un contrôle endogène à des fins de quantification relatifs. L'ARN a été converti en ADNc en utilisant le High Capacity Kit Archive ADNc (Applied Biosystems), et l'ADNc a été dilué à 1:10 avec de l'eau sans nucléase. Chaque réaction de 50 ul de PCR contenait: 1X TaqMan ® Universal Master Mix, 1X gène cible test d'expression ou GAPDH de mix contrôle Endogène, et 10 ul d'ADNc. Pour vérifier la contamination de l'amplicon, chaque essai d'expression sur chaque plaque contenait au moins deux commandes "pas de modèle" dans lequel l'eau sans nucléase a été substitué pour le modèle. conditions et les données thermocyclage analyse ont été décrites ci-dessus pour le SYBR Green rtPCR traitement déméthylation
. et séquençage de l'ADN au bisulfite modifié
Pour étudier l'effet de déméthylation, les AGS et AGS-B95-hygB lignées cellulaires de cancer gastrique ont été cultivées à 75% de confluence, puis pendant trois jours consécutifs, 1 uM de 5-aza-2'-désoxycytidine frais (5Aza; Sigma) a été ajouté par jour. Le quatrième jour, l'ARN et l'ADN ont été récoltées à partir de cultures traitées et non traitées. L'ARN a été évalué pour les niveaux d'expression génique, et l'ADN a été examiné pour la méthylation après traitement au bisulfite de sodium (EZ Méthylation Kit ADN Zymo Research, Orange, CA) pour convertir les cytosines non méthylées en uracile, tout en conservant cytosines méthylées inchangé [60]. Le témoin positif était CpGenome ADN méthylé universel (Chemicon) soumis à la même conversion au bisulfite et des amorces de contrôle ciblant le promoteur du gène cellulaire du C8orf4 a confirmé la conversion au bisulfite réussie de chaque échantillon d'ADN [61]. îlots CpG ont été identifiées par CpG Plot pour chacune des cinq humaine ICAM1 genes--
(RefSeq # NM_00201), CDKN2A (p16)
(RefSeq # NM_000077.3), ID4
(RefSeq # NM_001546),
COX2 (RefSeq # NM_000963) et (la RefSeq225,2) de TFF1 - pour lesquels des séquences de promoteur (3000 paires de bases en amont du site d'initiation de la transcription par le biais de l'exon 1) ont été téléchargés à partir de GenBank. Les paramètres suivants pour l'identification d'îlot CpG ont été utilisées: longueur minimale de 200 paires de bases, le pourcentage moyen minimum de C + G de 50%, et le taux moyen minimum observé attendu C + G de 0,6 [62]. Pour identifier les CpG régions denses pour COX2
et TFF1
, le paramètre de longueur minimum a été réduit à 50 pb [61]. Les séquences des amorces sont présentées dans le tableau 1. Chaque réaction de PCR de 50 ul contenait: tampon PCR 1X, 2 mM MgCl <sub>2, une unité Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen, Carlsbad CA), 0,2 mM de dNTP (ABI), et 30 pmol de chaque amorce. conditions de thermocyclage étaient les suivantes: 94 ° C pendant 2 minutes, 40 cycles de 94 ° C pendant 30 secondes, 55 ° C pendant 30 secondes, et 72 ° C pendant 1 minute, 72 ° C pendant 10 minutes. Pour surveiller la contamination de l'amplicon, chaque course contenait un "pas de modèle" de contrôle dans lequel l'eau sans nucléase a été remplacé par templateTable 1 bisulfite Converti Gene-Specific PCR Primer Sequences
ICAM1

Transférer
5'-TGG GGG TTG TGG TTT TAG TT-3 'de
Inverser
5'-CTC CCT CCA CTA AAA AC-3'
taille amplicon
412 pb
CDKN2A (p16)
Forward
5'-AGA TGT TTT GTG GTT GTT GTG A-3 '
inverse
5'-CAA AAA TCT TCC ATT CTT CAA AC -3 '
amplicon taille
418 pb
ID4
Forward
5'-TTT TTT GGG TAT ATA TTA GTT TGG-3'
inverse
5'-TAT CCT AAT CAC TCC CTT C-3 '
taille amplicon
477 pb
COX2
Forward
5'-TAT GTG TTG TAT ATA GAG TAG A-3'
Inverser
5'-AAA AAA TAA TCC CCA CTC TC -3 '
taille amplicon
399 pb
TFF1 Forward
5'-TTA GGT TGG AGT GTA GTA GG-3'
Inverser
5'-CCT ACT CAT ATC TAA AAA ACC C-3 'amplicon
taille
489 pb
contrôle C8orf4
Forward
5'-GAA TTA AAA TAT AAG GAG AGT TTT-3 '
inverse
5'-AAC ATT ACC CAA ACA TAA AAC AA-3'
taille amplicon
328 pb
séquençage a été réalisé sur amplicons de modèles de bisulfite traités pour identifier CpG méthylés et non méthylés avec ou sans traitement 5Aza. D'abord, chaque produit de PCR a été cloné dans pGEM-T vecteur utilisant le pGEM-T Easy Vector System II (Promega) et transformé en JM109 cellules compétentes à haut rendement. les colonies blanches contenant les inserts ont été sélectionnées et cultivées pendant une nuit et l'ADN plasmidique a été extrait en utilisant le kit Miniprep QIAprep Spin (Qiagen). Le séquençage a été effectué sur un analyseur génétique 3100 ABI en utilisant le kit de réaction ABI PRISM ™ BigDye ™ Version 1.1 Terminator Cycle Ready avec AmpliTaq ADN Polymerase et une amorce M13R3. Les résultats ont été téléchargés dans le logiciel Sequencher (Gene Codes, Ann Arbor, MI) pour obtenir le complément inverse de chaque séquence, et les deux séquences avant et arrière ont été alignées et analysées afin de distinguer les cytosines non méthylés de cytosines méthylés.
Western Blot sur l'AGS lignée cellulaire
en raison du potentiel de la thérapie d'inhibiteur de la COX2 pour surmonter les effets de la COX2, les résultats basés sur l'ARN pour COX2 ont été choisis pour l'étude de suivi au niveau de la protéine. Les cellules confluentes AGS avec ou sans VEB ont été récoltées avec de la trypsine à 0,25%, lavées deux fois dans une solution saline tamponnée au phosphate, et sédimentées par centrifugation. Les cellules ont été remises en suspension dans 500 ul de tampon de lyse NP-40 de cellules (50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 1% de NP-40, pH 8,0), incubées sur de la glace pendant 30 minutes et on centrifuge à 12 000 tours par minute pendant 15 minutes à 4 ° C. Des aliquotes de lysat (50, 100, 150 ug de protéine par puits) ont été résolues par SDS-PAGE sur un gel à gradient de 4-20% de Tris-glycine (Invitrogen) et transférés sur une membrane de nitrocellulose. COX2 a été détectée avec une dilution 1: 5000 de l'anticorps monoclonal suivie d'une dilution 1: 10 000 d'anticorps secondaire conjugué à la phosphatase alcaline (Amersham Biosciences) et la visualisation avec un Phosphorlmager Typhoon (Molecular Dynamics). Les résultats de densité de la bande de mesure semi-quantitative et normalisées par rapport à la bêta actine (ACTB) a été comparée entre les cellules AGS infectées et non infectées. de l'infection par EBV des cellules du cancer gastrique AGS
infection à EBV réussie de cellules de cancer gastrique AGS a été confirmée en utilisant six dosages Q-PCR ciblant des segments disparates du génome de l'EBV. EBER
hybridation in situ de montré l'expression de pas EBER dans les cellules AGS "EBV négative" parentales, alors que plus de 90% des cellules AGS-B95-hygB étaient EBER
-positif et avait activé -appearing morphologie nucléaire (figure 1). Le taux de prolifération a été augmentée, comme indiqué par la confluence des cultures de cellules AGS-B95-hygB trois jours avant les cellules AGS parentales. L'infection a persisté pendant au moins 4 mois, comme indiqué par la GFP et EBER
taches histochimiques. VEB latente (LMP1 et LMP2A) et lytiques (BZLF1 et BMRF1) les protéines sont exprimées dans les cellules AGS non infectées, tandis que ~ 10% des cellules infectées exprimé LMP1, la moitié des cellules ont exprimé LMP2A et environ 35% exprimés BMRF1 et BZLF1 protéines impliquant actif la réplication virale (figure 1). Figure 1 cellules AGS-B95-hygB expriment des gènes viraux latents et lytiques. A) tache immunohistochimique pour la GFP suggère cellules hygromycine B traitées AGS ont été uniformément infectées par le génome B95.8 EBV conçu. B) EBER l'hybridation in situ de l'infection latente indique dans > 90% des cellules. La coloration de nucléaire EBER épargne les nucléoles et nucléoles agrandies sont un marqueur de l'activation cellulaire. Latent virale protéines LMP1 (C) et LMP2 (D) ont été exprimées focalement. les protéines virales lytiques, BMRF1 (E) et BZLF1 (F), ont été exprimées dans une fraction significative des cellules AGS-B95-hygB. (GFP et BMRF1 taches, 800x; LMP1, LMP2, EBER
et BZLF1 taches, 1200x)
Cellular Gene Différences d'expression dans les EBV-positifs par rapport aux cellules AGS EBV négative des niveaux de 96 gènes cellulaires d'expression ont été analysés dans les cellules AGS et AGS-B95-hygB utilisant peu l'analyse des microréseaux de densité avec détection chimioluminescente (Figure 2). Après normalisation de la GAPDH
, comparaison par paires des niveaux d'expression génique entre les cellules AGS EBV-positifs et EBV-négatifs ont révélé que des 96 gènes sur la puce à ADN, 43 ont été dérégulée au moins deux fois après l'infection par EBV. Étonnamment, une augmentation associée à l'EBV dans l'expression a été observée pour seulement 6 gènes (IGFBP3
, GADD45, IRF1, Grp78 /HSPB1, GLUT1 /SLC2A1, TMEPAI
), tandis que diminution de l'expression a été observée pour les 37 gènes dérégulés restants (ABCB1, BCL2L1, BIRC2, BMP2, CDKN2A, DUSP1, HIF1A, ICAM1, ID2, NFKB1, COX2, TFRC, VCAM1, WISP1, TRIM25, IL2, BMP4, MDM2, CCND1, CDK2, BAX, p57, p19, CSN2, CXCL9 , IL4, JUN, KLK3, LTA, MMP7, PPARG, TNFRSF10B, WIG1, WNT2, PTCH2
). Figure 2 profils d'expression de gènes sont modifiés par l'infection à EBV des cellules AGS. Les sondes d'ADNc marquées à la biotine disposées en quatre exemplaires sur une membrane en nylon hybrident à l'ARN isolé à partir des cellules AGS et AGS-B95-hygB. signaux chimioluminescents indiquent dysrégulation de gènes sélectionnés parmi les 96 sur la matrice par rapport aux gènes de contrôle dans les deux dernières lignes.
SYBR Green rtPCR a été utilisé pour vérifier les résultats de biopuces pour 26 des gènes dérégulés et pour 12 gènes supplémentaires dans lesquels aucun changement significatif n'a été observé sur la puce à ADN. Plus grand que la modification de deux fois dans le niveau d'ARNm dans infecté par rapport
cellules non infectées a été trouvé pour les 16/26 gènes (tableau 2). Les gènes les plus fortement touchés étaient IGFBP3
qui a été régulée à la hausse de 42 fois, et COX2, BMP4 et ICAM1
qui ont été downregulated par 35-, 32-, et 22 fois, respectivement. Les dix modifications à base de microréseaux restantes ne sont pas confirmées par rtPCR, suggérant que la dysrégulation lié à l'EBV de ces facteurs était inférieur à deux fois. Dans un cas, il y avait un écart important: les niveaux d'expression de BCL2L1
par l'analyse des microréseaux ont montré une diminution de deux fois
dans les cellules infectées tandis rtPCR a montré de façon répétée cinq fois plus
à BCL2L1 de l'ARNm les niveaux dans les cellules infectées. les écarts moins spectaculaires ont été observées lorsque un 12 gènes supplémentaires ont été analysés par rtPCR, avec significative (> 2 fois) ont trouvé des changements dans l'expression des gènes 5/12 pour lesquels aucune modification n'a été observée sur la puce à ADN (tableau 2) .Tableau 2 les gènes dérégulée dans EBV positives cellules AGS
Gene Nom
Gene Symbol
Fold Change *
Genes downregulated
base leucine-zipper facteur de transcription, ATF-like
BATF
-38
morphogénétique cyclooxygénase-2
COX2
-35
os protéine-4
BMP4
-32
molécule d'adhésion intercellulaire-1
ICAM1
-22
lotier factor-1
TFF1
-21
inhibiteur de choc de liaison-2
ID2
-14
chaleur ADN protéine-70
HSP70
-10
kinases cycline-dépendantes-2
CDK2
-9
cycline D1-
CCND1
-9
hypoxie inducible factor-1A
HIF1A
-9
cancer du sein 1
BRCA1
-7
Nucleostemin
NU
-7
kinases cycline-dépendantes inhibiteur-2A
CDKN2A /p16
-6
inhibiteur de la liaison à l'ADN-4
ID4
-6
Engrailed-1
EN1
-5
ATP-binding cassette, sous-famille B, membre 1
ABCB1
-3
MDM2 p53 protéine de liaison
MDM2
-3
Genes upregulated
liaison insulin-like growth factor protéine-3
IGFBP3
+40
facteur de nécrose tumorale associée au récepteur du facteur 1
TRAF1
+20
transmembranaire la prostate androgéno-induite protéines
TMEPAI
+10
facteur de nécrose tumorale, superfamille membre-10
TNFSF10
+8
B lymphome-2-like -1
BCL2L1
+7
baculoviral répétition IAP contenant 3
BIRC3
+5
hexokinase-1
HK1</sub></sup>