MicroARN-144 inhibe la métastase du cancer gastrique en ciblant MET expression

microARN-144 inhibe la métastase du cancer gastrique en ciblant l'expression MET
cancer gastrique de résumé (GC) reste l'un des types les plus communs de cancer malin, et le mécanisme moléculaire qui sous-tend ses métastases est encore largement incertaine. Les microARN ont émergé comme des régulateurs importants de la métastase en raison de leur capacité à agir sur de multiples voies de signalisation. Dans notre étude, nous avons constaté que miR-144 est sensiblement downregulated dans les deux lignes et les tissus cellulaires de GC hautement métastatiques. Les résultats des deux gain de fonction et des expériences de perte de fonction montrent que l'augmentation de miR-144 expression réduit de manière significative la migration des cellules de GC, alors diminué miR-144 expression considérablement amélioré la migration des cellules de GC. Le proto-oncogène met (MET), qui est souvent amplifié dans les cancers et les fonctions humaines comme un régulateur important de la croissance cellulaire et l'invasion tumorale, a été identifiée comme une cible directe de miR-144. En outre, le silençage du MET en utilisant des petits ARN interférents (siRNA) récapitulé la fonction anti-métastatique de miR-144, alors que la restauration de l'expression MET atténué la fonction de miR-144 dans les cellules du GC. En outre, nous avons découvert que miR-144, en opérant dans les conditions de ciblage, supprime la phosphorylation de Akt. Enfin, nous avons observé une corrélation inverse entre l'expression de miR-144 et MET ARNm dans GC tissus métastatiques. En résumé, miR-144 inhibe la progression de la CG par la régulation négative de l'expression directe MET, ce qui empêche par la suite l'activation de l'Akt pro-oncogène. Réintroduction de miR-144 expression dans les cellules du GC présente une approche thérapeutique attractive pour bloquer les métastases du cancer gastrique.
Mots-clés
microARN miR-144 MET Gastric cancer Métastases Présentation
Globalement, le cancer gastrique (GC) est un des types les plus courants de la maladie maligne. En 2008, environ 989.600 nouveaux cas de GC ont été diagnostiqués. De plus, GC a été impliqué comme cause de 738.000 décès, ce qui rend GC le quatrième cancer le plus fréquent et la principale cause de décès par cancer dans le monde [1]. Que la tumeur progresse, il se développe la capacité d'envahir les tissus environnants et métastaser. Le récepteur du facteur de croissance des hépatocytes, MET, est connue pour favoriser la mobilité et la capacité invasive des cellules tumorales [2]. MET est un membre de la famille tyrosine kinase du récepteur et il a été démontré que la régulation positive dans de nombreuses tumeurs [3-5]. Il est suggéré que le niveau d'expression est augmentée par MET, soit une amplification de gène ou par l'intermédiaire d'une hypoxie HIF1α. Chez les patients avec GC métastatique, MET amplification et l'expression des protéines forte ne sont pas rares. Ces événements semblent être associés de façon significative avec le résultat clinique défavorable [6]. Environ 10% des patients blancs abritent un gain de cinq ou plusieurs copies du MET. En outre, ce gain de MET nombre de copies est significativement associée à un pronostic défavorable [7]. En outre, les microARN miR-34a /c ont été montrés pour moduler négativement l'expression MET dans des lignées cellulaires dérivées de cancer de la prostate, le carcinome hépatocellulaire et GC [8-10].
MicroARN (miARN) sont codantes non des molécules d'ARN, environ 21-23 nucléotides de long, qui régulent l'expression des gènes au niveau transcriptionnel ou post-transcriptionnel [11-13]. Les analyses de profilage d'expression de miARN ont mis en évidence une régulation à la baisse globale des niveaux de miARN matures dans des tumeurs humaines par rapport aux tissus normaux [14]. En outre, les miARN peut fonctionner soit dans un gène suppresseur de tumeur ou d'un rôle oncogene, en fonction de la fonction de leur cible. Par exemple, miR-133b était significativement régulée à la baisse dans les tissus GC et exerce son rôle de suppresseur de tumeur dans les cellules du GC [15]. L'expression de miR-337-3p était significativement régulée à la baisse dans les tissus lymphatiques métastatiques noeud de patients atteints de GC, et l'induction de l'expression de miR-337-3p a réduit la capacité d'invasion des cellules du cancer gastrique [16]. miR-25 favorise la progression de la GC directement par régulation négative de l'expression de TOB1; Par conséquent, l'augmentation de l'expression de miR-25 présente un biomarqueur non invasif potentiel pour le pronostic des patients atteints de GC [17]. En outre, miR-7 est significativement régulée à la baisse dans les deux lignées cellulaires hautement métastatiques GC et les tissus métastatiques. La surexpression de miR-7 inhibe fortement les métastases GC en ciblant l'expression de l'oncogène insuline-like growth factor-1 receptor (IGF1R) [18]. Dans les lignées cellulaires GC, la réintroduction des résultats d'expression de miR-144 dans la répression de la ZFX, ce qui augmente modérément la sensibilité des cellules cancéreuses à la chimiothérapie 5-fluorouracile. Dans 93 cas de GC primaire, diminué l'expression de miR-144 a été associée à un mauvais pronostic [19]. Ces exemples ont mis en évidence le rôle clé des miARN dans GC malignance et la progression du cancer.
Dans cette étude, nous avons caractérisé les objectifs et défini le mécanisme d'action de miR-144 en GC. En induisant l'expression ectopique de miR-144, nous avons découvert MET est une nouvelle cible de miR-144 règlement. Cette constatation a été confirmée sur les deux niveaux d'ARNm et de protéines, et des essais de luciférase du gène rapporteur vérifié liaison directe de miR-144 au site de liaison réglementaire dans le 3'UTR du MET. De plus, nous avons constaté que l'expression MET inversement corrélée à miR-144 niveaux dans un petit mais bien documenté cohorte de GC. Nous présumons que miR-144 inhibe GC métastase, et que certains de cette inhibition est médiée par l'expression de ciblage MET. Matériaux et méthodes
A échantillons de tissus humains et des lignées cellulaires
échantillons de GC ont été recueillies auprès de patients ayant subi une chirurgie au Cancer Center de l'Université Fudan de Shanghai entre 2012 et 2013. le protocole a été approuvé par le Comité d'éthique de la recherche clinique de l'Université Fudan, et la recherche a été effectuée conformément aux dispositions de la Déclaration d'Helsinki de 1975. Tous les échantillons ont été obtenus avec le consentement éclairé des patients. La lignée cellulaire de GC humaine AGS (ATCC® CRL-1739 ™), SNU-1 (ATCC® CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC® CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC® 5974 ™ CRL) , NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™), et KATO III (ATCC® HTB-103 ™) ont été maintenues dans DMEM contenant 10% de sérum de veau fœtal. Toutes les lignées cellulaires ont été maintenues dans des milieux contenant de la pénicilline (100 UI /ml) et de la streptomycine (100 mg /ml) à 37 ° C avec 5% de CO2. Les mimiques et les inhibiteurs de miRNA ont été achetés chez Ambion (Austin, TX, USA).
Extraction de l'ARN et en temps réel L'ARN total de PCR a été extrait des cellules en utilisant Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Pour l'analyse des miARN, le poly (A) ont été ajoutés à la queue de l'ARN total en utilisant le poly (A) polymérase (Ambion, Carlsbad, CA) avant la transcription inverse. Le kit de détection MiRcute miRNA qPCR (TIANGEN, Beijing, Chine) a été utilisé pour quantifier les niveaux de miR-144 expression selon le protocole fourni. Les conditions de PCR suivantes ont été utilisées: 95 ° C pendant 30 s, suivie par 40 cycles de 95 ° C pendant 5 s et 60 ° C pendant 31 s. Le montant de la cible (MET /miR-144), normalisé au gène de ménage endogène GAPDH /U6snRNA et par rapport à un échantillon de référence, est donnée par l'équation suivante: quantité de target = 2- △△ CT
Microarray hybridation.
bref, des échantillons d'ARN ont été utilisés pour synthétiser l'ADN double brin complémentaire (ADNc), et double brin d'ADNc a été marqué et hybride à la Microarray (Arraystar, Rockville, MD). Après hybridation et de lavage, les lames traitées ont été numérisées avec le Axon GenePix 4000B microarray scanner (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). P valeur a été calculée en utilisant le test t apparié. Le seuil fixé pour le haut et le bas-gènes régulés était un facteur de changement > 2.0 et une valeur de p < 0,05. classification hiérarchique a été réalisée sur la base de gènes et miARN exprimés de manière différentielle en utilisant le logiciel Treeview Cluster de l'Université de Stanford (Palo Alto, CA).
réseau MiRNA gène
Nous avons construit la contiguïté de réseau entre deux gènes, i et j, définie comme une puissance de corrélation de Pearson entre les profils d'expression génique correspondant, xi et xj. La matrice d'adjacence, M (i, j), a été visualisée sous la forme d'un graphique, et des propriétés topologiques de ce graphique ont été examinés. Pour faire une représentation visuelle, seules les plus fortes corrélations (> 0,98) ont été établis dans ces rendus. Dans les réseaux miARN gènes, chaque gène correspondant à un noeud. Deux gènes sont reliés par un bord, ce qui indique une forte corrélation. Dans l'analyse de réseau, un degré est la plus simple, la mesure la plus importante de la centralité d'un gène dans un réseau et détermine l'importance relative. Un diplôme est défini comme étant le nombre de voisins directement liés
Prévision de miR-144 site de liaison
sites de liaison putatifs miR-144 dans la région non traduite de l'ARNm MET 3 'ont été prévus par le programme de numérisation cible (http:. //www.targetscan.org). Position 1430-1436 du MET 3 'UTR a un site de liaison conservé pour miR-144 ciblage plasmide de transfection.
Les séquences ORF de MET ont été amplifiés à partir d'ADN génomique isolé à partir de la lignée cellulaire SNU-5 et ont ensuite été sous-clonés dans le vecteur plenti. Le plasmide a été transfecté dans des cellules SNU-5 en utilisant de la Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Après 24 h, les cellules ont été utilisées pour une expérience de sauvetage
. Oligonucleotide transfection
miR-144 imite, miR-144 inhibiteur (anti-miR-144), et MET siRNA (siRNA-MET) ont été synthétisés par Genepharma , Shangai, Chine. Oligonucleotide transfection a été réalisée avec Lipofectamine 2000 réactifs (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). La concentration finale de miR-144 imite, anti-miR-144 ou siRNA-MET dans le système de transfection a été de 100 nM. L'efficacité de transfection pour les études uniques et cotransfectées a été déterminée par un microscope à fluorescence. Des quantités équivalentes de ce membre immunoempreinte des lysats cellulaires ont été résolus par 7% de SDS /PAGE et ont été transférées sur des membranes de fluorure de polyvinylidène. La membrane a été incubée avec un anticorps de lapin polyclonal anti-MET (1: 500, Abcam, ab47431), un anticorps anti-ADAM12 polyclonal de chèvre (0,3 pg /ml, Abcam, ab28747) et un anticorps polyclonal de lapin anticorps anti-versicane (1 ug /ml Abcam, ab19345). IRDye-anticorps secondaires marqués ont été utilisés pour la quantification du signal de immunoblotting, et les signaux ont été analysées à l'aide d'un scanner Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).
Test ARN-ChIP
interactions ARN-protéine sont fixées avec du formaldéhyde, et le cisaillement de la chromatine est combiné avec un traitement à la DNase pour obtenir des complexes ARN /protéines qui peuvent être immunoprécipités avec des anticorps dirigés contre des protéines MET. Les liens croisés sont ensuite inversés; L'ARN est récupéré et traité de nouveau avec de la DNase pour assurer l'absence d'ADN. L'ARN précipité à partir du complexe immun ensuite être analysés par PCR en temps réel. Dans cet essai ARN-ChIP, la formule suivante est utilisée:% d'entrée (récupération) = AE (Ct échantillon d'entrée-Ct) * Fd * 100%. Ici, AE est l'efficacité d'amplification (10 (-1 /pente)) et Fd est un facteur de dilution de l'ARN d'entrée pour équilibrer la différence entre les quantités d'ARN-ChIP échantillon et entrée ARN utilisés pour PCR en temps réel.
luciférase test
Le plein MET 3'UTR a été amplifié par PCR en utilisant SNU-5 ADNc comme matrice et clone dans le vecteur de contrôle pGL3. Nous avons utilisé Quick Change mutagenèse pour muter le site putatif de liaison miR-144 (Stratagene, Santa Clara, CA, USA). SNU-5 et les cellules AGS ont été transfectées avec miR-144 imite /inhibiteurs et pGL3 rapporteur de la luciférase constructions abritant le MET 3'UTR. Après 24 h, les activités de la luciférase de luciole et de Renilla luciférase dans les lysats cellulaires ont été mesurées avec le Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA).
Essais de migration
Pour les essais de migration Transwell, 1 x 105 cellules ont été ensemencées dans la chambre supérieure contenant une membrane non revêtue. Les cellules ont été étalées dans du milieu exempt de sérum et un milieu additionné de 10% (v /v) de sérum a été utilisé comme agent chimio-attractif dans la chambre inférieure. Les cellules ont été incubées à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire avec 5% (v /v) de CO2. Au bout de 16 h, les cellules non migrées ont été retirées des faces supérieures des éléments filtrants à membrane Transwell. Les cellules ayant migré sur les côtés inférieurs des inserts ont été colorées avec Coomassie bleu brillant, et les cellules ont été comptées. Test
de prolifération cellulaire
Les cellules transfectées ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité de 1 x 104 cellules /bien. Un test de prolifération cellulaire a été réalisée en utilisant le kit de comptage de cellules 8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) selon les instructions du fabricant. Avant l'ajout de CCK-8, les cellules ont été lavées avec un milieu de culture chaud en faisant tourner la plaque à 500 rpm pendant 3 m, puis jeter le surnageant
Amorces
Les amorces suivantes ont été utilisées pour la PCR-Temps réel.: miR-144: 5-TACAG TATAG ATGAT GTACT-3; U6snRNA: 5-CGCAA GGAUG ACACG CAAAU UCGUG AAGCG UUCCA UAUUU UU-3; SKIL amorce sens: 5-GTTAA GCGAA CCTGT ACTTC TGT-3, amorce inverse: 5- GTAGG CGACA TGCTT TCTTG G-3; MET amorce sens: 5-GTCGG AGTAG AGCGT CGAGA-3, amorce inverse: 5-CAGCG CGATC AGGTA GAGC-3; TOP2A amorce sens: 5-ACCAT TGCAG CCTGT AAATG A-3, amorce inverse: 5-GGGCG GAGCA AAATA TGTTC C-3; ADAM12 amorce sens: 5-TCAAC CTGGA TACCC GATTC C-3, amorce inverse: 5-GCTCT GTCTG CCGAT GGAG-3; VCAN amorce sens: 5-GTAAC CCATG CGCTA CATAA AGT-3, l'amorce inverse: 5-GGCAA AGTAG GCATC GTTGA AA-3. Les amorces suivantes ont été utilisées pour la pleine application MET 3UTR: MET 3'UTR amorce sens: 5-TCACT GCCTG ACCTT TA-3, MET 3'UTR amorce inverse: 5-ATCAC TTACT CCCAC AAT-3. Le nucléotide de siRNA pour MET a été utilisé comme suit: siRNA-MET avant: 5-GUGCC ACUAA CUACA UUUAU U-3, siRNA-MET inverse:. 5-UAAAU GUAGU UAGUG GCACU U-3 Analyse statistique

Les résultats sont présentés comme des moyens ± SEM, et les données ont été analysées avec le test t de Student. Une valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
Résultats de profil d'expression de microARN en comparaison de cancer gastrique métastatique des tissus péritonéale avec des échantillons de foyers primaires appariées de GC en utilisant une analyse de classification hiérarchique a révélé une variation systématique dans l'expression des miARN et des gènes (Figure 1A et B). Nos données suggèrent qu'un ensemble de miARN et des gènes est souvent exprimé de manière aberrante dans les tissus métastatiques péritonéale de GC. En outre, nous avons également constaté que certaines molécules déjà bien prouvé, comme miR-7 [18], miR-25 [17], TOB1 et IGF1R, ne sont pas identifiés dans nos microréseaux. Nous avons pensé que peut être induite par la diversité des échantillons cliniques ces différences provenaient de différentes régions. Figure réseau miRNA-gène 1 de base, y compris 8 miARN clés et leurs cibles. Hiérarchique analyse de la concentration de 27 miARN (A) et 32 ​​gènes (B) qui ont été exprimés de manière différentielle entre les tissus métastatiques dans les échantillons primaires péritonéale et appariés de GC (supérieure à 2,0 fois; p < 0,05). Les valeurs d'expression sont représentés dans les tons de rouge et vert, ce qui indique l'expression ci-dessus et en dessous de la valeur de l'expression médiane dans tous les échantillons. (C) Le réseau miRNA-gène montre les relations entre 8 miARN clés et les gènes associés aux tumeurs qu'ils sont prédits à réglementer. Les couleurs indiquent les niveaux d'expression annotées des miARN et des gènes.
Le miARN-gène-réseau a été assemblé dans le but d'identifier les miARN clés qui régulent l'expression des gènes associés à une tumeur au cours de la progression des métastases tumorales. Parce que les modules de coexpression correspondent probablement à des voies biologiques, nous nous sommes concentrés sur les modules de coexpression qui sont associés à un nombre élevé de gènes codant pour des protéines. En outre, NCBI RefSeq détaille les fonctions de nombreux gènes, qui a permis notre identification de gènes associés au GC. En utilisant cette méthode, nous avons caractérisé le rôle de miR-144 dans les foyers métastatiques peritoneale du CPG. Dans le réseau de la coexpression du cancer, miR-144 est reliée à 6 gènes codant pour des protéines qui sont impliquées dans la croissance tumorale et les métastases (figure 1C).
Rôle de régulation de miR-144 dans l'estomac de métastases cancéreuses
Pour étudier Mir- 144 fonction, nous avons d'abord examiné les niveaux miR-144 dans un panel de 6 lignées de cellules GC humaines. Comme le montre la figure 2A, nous avons choisi AGS, caractérisé par upregulated miR-144 et SNU-5, caractérisé par miR-144-régulée, pour une étude plus approfondie. La lignée de cellules AGS a été dérivée de fragments de tumeur gastrique qui ont été réséquées à partir d'un patient qui avait reçu aucun traitement préalable, tandis que SNU-5 a été dérivé de l'ascite d'un patient ayant un cancer mal différencié de l'estomac. La figure 2 miR-144 inhibe la migration des cellules GC. niveaux de miR-144 (A) Expression ont été vérifiées dans un panel de 6 lignées de cellules humaines GC en utilisant la méthode PCR en temps réel. (B) La migration des SNU-5 cellules traitées avec miR-144 imite a été vérifiée à l'aide non-matrigel traité Transwell chambre. (C) La migration des cellules AGS traitées avec un inhibiteur de miR-144 a été vérifiée à l'aide non-matrigel traité Transwell chambre. (*** P < 0,001).
Dans notre étude, nous avons observé une association étroite entre miR-144 et la perte des métastases dans GC (Figure 1A et C). De ce fait, des études antérieures ont démontré une inhibition à base de miR-144 de la migration des cellules tumorales et l'invasion dans le carcinome à cellules squameuses épithéliale. Nous avons supposé que la réintroduction de l'expression de miR-144 supprimerait la migration des cellules cancéreuses. De manière appropriée, l'introduction de l'expression de miR-144 a inhibé la migration des cellules dans SNU-5 (figure 2B). Par rapport à SNU-5, les cellules AGS ont un niveau relativement plus élevé de endogène expression miR-144. Sans surprise, l'inhibition de miR-144 a augmenté la migration des cellules AGS (figure 2C). En fait, nous avons également procédé à l'essai d'invasion en utilisant Transwell matrigel traité, et il n'y a pas de différence pour la capacité invasive du SNU-5 /AGS cellules après traitées avec miR-144 /anti-miR-144 (données non présentées). Ces résultats ont montré que miR-144 joue un rôle important dans la migration, mais pas dans l'invasion des cellules du GC.
MiR-144 affecte l'expression MET
Par l'expression ectopique de miR-144 dans le SNU-5 cellules, nous avons déterminé ADAM12 , VCAN et MET sont putatifs miR-144 cibles. Comme on le voit sur la figure 3A, l'expression de miR-144 affectées de manière spectaculaire les taux d'ARNm de ADAM12, VCAN et MET. ADAM12, VCAN et MET niveaux d'expression de protéines ont également été détectées par western blot dans les cellules cancéreuses transfectées avec miR-144 imite. Comme on le voit sur la figure 3B, seuls les taux de protéine MET ont été régulés à la baisse par miR-144. Ceci indique que miR-144 affects MET expression au niveau de la transcription, peut-être par le clivage ou la déstabilisation de la structure de l'ARNm. Cependant, nous avons également constaté que les niveaux de protéine ADAM12 et VCAN ne sont pas diminuées par l'introduction exogène de miR-144. Nous avons pensé que les niveaux de protéine ARNm et ne peuvent pas être directement corrélées à cause de la demi-vie différente. Nous avons également pensé ils ont montré que peut-être due à la présence de miR-144 qui a été continuellement réprimait traduction dans un cas mais pas dans l'autre. Le MET: interaction miR-144 a également été démontrée dans des cellules vivantes par dosage de l'ARN-CHIP. En effet, miR-144 endogène a été trouvée associée au MET endogène dans la lutte anti-MET mais pas immunoprécipités anti-IgG à partir de cellules (figure 3C). Figure 3: Expression du MET a été réglementé par miR-144. niveaux (A) ARNm de putatifs miR-144 cibles ont été examinés par PCR en temps réel dans SNU-5 cellules transfectées avec miR-144 imite ou miR-NC. niveaux de putatifs miR-144 cibles (B) protéines ont été examinés par western blot dans SNU-5 cellules transfectées avec miR-144 imite ou miR-NC. (C) Les recouvrements d'entrée% des réactions d'ARN-ChIP illustre l'enrichissement par l'anticorps MET. test ARN-ChIP pour miR-144 réalisée sur l'anticorps anti-MET à partir de lysats de cellules. ARN-ChIP avec une IgG non liée ont servi de témoins. (D) Une représentation schématique du site miR-144 de liaison prévue dans le 3'UTR du MET. (E) SNU-5 cellules ont été transitoirement co-transfectées avec GCU-MET 3'UTR et miR-144 mimique. (F), les cellules AGS ont été transitoirement co-transfectées avec GCU-MET 3'UTR et un inhibiteur de miR-144. (G) la mutation du site de liaison miR-144 en opérant dans les conditions 3'UTR a supprimé la suppression de l'activité de la luciférase miR-144-induite. L'activité luciférase a été mesurée après 24 heures et normalisées par rapport à la Renilla de cotransfectés. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Utilisation de l'analyse bioinformatique basée, nous avons identifié un seul site de liaison pour miRNA miR-144 dans la 3 'UTR du MET l'ARNm (figure 3D). Pour tester si miR-144 se lie directement l'extrémité 3 'UTR du MET ARNm, nous avons effectué des dosages de rapporteur luciférase dans SNU-5 cellules. fragments PCR dérivés de MET 3'UTR ont été insérés dans le vecteur de contrôle pGL3 à Xba1 place (GCU-MET 3'UTR). La co-transfection de Luc-MET 3'UTR et miR-144 dans mimétiques SNU-5 cellules conduit à un signal de luciférase diminuée (par rapport à miR-NC), ce qui confirme que la liaison de miR-144 pour la 3'UTR de MET a effet inhibiteur direct (Figure 3E). L'expérience inverse, accompli en bloquant la production endogène miR-144 avec un inhibiteur de miR-144 dans les cellules AGS, a entraîné une augmentation de signal de la luciférase (figure 3F). Un journaliste de luciférase muté au site de liaison miR-144 a également été construit (Figure 3D). La mutation du site de liaison des miARN a aboli l'inhibition de miR-144 à médiation par l'activité de la luciférase (figure 3G). Ces données suggèrent que la position de 1430 à 1436 du MET 3'UTR est critique pour la régulation des gènes miR-144-médiée.
MET médie la résistance miR-144 induite par la migration
Utilisation PCR en temps réel, MET les niveaux d'expression ont été déterminées pour six lignées cellulaires humaines GC. Comme on le voit, les lignées cellulaires avec des "régulation négative" miR-144 ont des niveaux plus grandes quantités de MET par rapport aux lignées cellulaires avec des «surexprimés» miR-144 niveaux (figure 4A). L'utilisation de tests non paramétriques, nous avons déterminé une corrélation inverse significative entre MET ARNm et l'expression de miR-144 dans les échantillons GC métastatiques (figure 4B). représente la figure 4 MET modulation de l'effet anti-métastatique de miR-144. (A) Western blot montrant l'expression MET dans un ensemble de lignées de cellules GC humaines. (B) Une corrélation inverse significative est observée entre les niveaux d'expression miR-144 et MET dans les tissus GC (n = 52). (C) Le MET et Akt phosphorylée ont été inhibées par l'expression forcée de miR-144 ou de l'ARNsi-MET. (D, E) Les effets de miR-144 ou siRNA-MET sur la migration et la prolifération ont été déterminées dans SNU-5 cellules. (F) Le MET et phosphorylée Akt ont été restaurés par la surexpression du MET dans miR-144 imite-traités SNU-5 cellules. (G, H) Les effets de miR-144 combiné avec MET-ORF sur la migration et la prolifération des cellules SNU-5. (I) Le MET et phosphorylée Akt ont été régulés à la hausse par le blocage de miR-144 dans les cellules AGS. (J, K) Les effets des anti-miR-144 sur la migration et la prolifération des cellules AGS.
Les fonctions de la protéine MET comme un récepteur tyrosine kinase et joue un rôle central dans la promotion de la croissance cellulaire et la migration par transduction extracellulaire stimuli aux circuits de signalisation intracellulaires. Un élément important du mécanisme de signalisation intracellulaire est la PI3K (phosphoinositide 3-kinase) voie [20,21]. Parce que miR-144 inhibe MET expression, nous avons supposé que miR-144 pourrait finalement diminuer la phosphorylation de Akt et de l'activation par la signalisation MET diminué. Par conséquent, nous avons examiné les niveaux de phosphorylation Akt après miR-144 surexpression et observé une diminution significative de la phosphorylation de Akt (figure 4C).
Nous avons décidé d'étudier si miR-144 induite par régulation négative MET a eu un effet sur la migration des cellules tumorales et la prolifération. Nous transfecté miR-144 et siRNA pour MET (siRNA-MET) dans SNU-5 cellules. La migration cellulaire a été évaluée 16 heures après la transfection par Transwell dosage, tandis que la prolifération des cellules a été déterminée par la CCK-8. Comme cela est représenté sur les figures 4D et E, la transfection avec miR-144 a inhibé la migration cellulaire et la prolifération par rapport au témoin. De même, la diminution de l'expression de la protéine MET utilisant siRNA a également diminué la migration des cellules tumorales et la prolifération.
Pour déterminer si MET est le médiateur critique de l'effet de miR-144 sur la migration et la prolifération cellulaire, nous avons construit deux vecteur d'expression MET. Un qui ne contient que la séquence cadre ouvert de lecture du gène MET (MET-ORF), et un autre vecteur contient la longueur nucléotidique complète du gène MET, y compris la séquence 3'UTR (MET-plein de long). Nous avons ensuite effectué une analyse Western blot 48 h après la transfection du MET-ORF /MET-plein longtemps dans miR-144 imite-traités SNU-5 cellules (Figure 4F). Par rapport au groupe témoin négatif (vecteur vide), l'expression ectopique de MET-ORF a augmenté de manière significative l'expression totale du MET et phosphorylée Akt. En outre, l'expression de l'ORF-MET favorisé la migration et la prolifération des cellules GC (figure 4G et H). La surexpression du MET a aboli l'inhibition de miR-144 induite par la migration et la prolifération cellulaire. En revanche, le niveau de MET et phosphoryle AKT protéine accrue dans les cellules AGS traitées avec l'anti-miR-144 (figure 4E), et le blocage de miR-144 a également favorisé la migration et la prolifération des cellules AGS (figure 4J, et K). Ces résultats indiquent que MET est une cible critique pour l'effet anti-migration de miR-144 dans les cellules GC humaines. Discussion de la
Dans cette étude, nous avons identifié les signatures d'un petit nombre de miARN et des gènes non-chevauchement qui sont exprimées de manière aberrante dans les tissus métastatiques péritonéaux de GC, comparativement aux tissus primaires jumelés. L'analyse des miARN et des profils d'expression génique dans le gène de miARN-réseau identifié miR-144 en tant que régulateur des principales voies oncogenes, tels que la prolifération et la migration. patients du GC avec métastases péritonéales avaient inférieurs miR-144 niveaux d'expression que les patients sans métastases. Cette constatation implique miR-144 comme un suppresseur de tumeur potentiel dans GC. En outre, miR-144 est associée aux mécanismes de métastases. Nos résultats correspondent aux résultats des études antérieures sur le rôle de miR-144 dans la prolifération du cancer, la migration et l'invasion [22,23]. miR-144 inhibe le cancer métastase de cellules en ciblant le A disintégrine et métalloprotéinase (ADAM) famille de protéines membre ADAMTS5. Les microARN dysrégulation est associée à une augmentation invasivité des tumeurs et des métastases, ainsi que le pronostic des patients réduit dans certains cancers épithéliaux [24]. Nous avons également étudié le rôle de miR-144 déréglementation GC. Nous avons étudié l'effet de l'expression de miR-144 dans la lignée de cellules SNU-5, telle qu'elle est caractérisée par une faible expression de miR-144. L'expression ectopique de miR-144 dans le SNU-5 cellules entraîne des changements phénotypiques profonds, comme la baisse de la migration. L'expérience inverse, le blocage de miR-144 expression, a été menée dans la lignée de cellules AGS, qui a un niveau relativement élevé endogène d'expression miR-144. L'inhibition de l'expression de miR-144 a entraîné une migration accrue des cellules AGS.
Pour étudier le mécanisme derrière miR-144 dépendante diminué migration de GC, nous avons identifié les cibles potentielles pour miR-144 comme prédit par miRNA-gène-réseau. miR-144 surexpression peut réduire l'expression MET à la fois les taux de protéines et de l'ARNm, et en conséquence, la luciférase des dosages de rapporteur a révélé que miR-144 peut interagir directement avec le MET 3'UTR. Nous avons ensuite évalué les niveaux d'expression MET dans une cohorte de 52 patients du GC et a constaté que miR-144 niveaux sont inversement corrélés à l'expression MET. Pour cette raison, nous avons supposé que miR-144 inhibe GC tumorigenèse en ciblant l'expression MET. MET a également été décrit comme une cible miR-34a /c dans d'autres modèles cellulaires et est connu pour favoriser la mobilité et la capacité invasive des cellules tumorales. La surexpression du MET est étroitement corrélée avec l'invasion de la tumeur et le pronostic des patients en GC [6]. En GC, MET surexpression est un facteur pronostique indépendant et cible potentielle de la drogue. En outre, la surexpression MET peut prédire quels patients peuvent bénéficier d'une thérapie ciblée avec des inhibiteurs de MET [25]. Dans notre étude, l'expression MET était significativement associée à la différenciation des GC, TNM et les métastases [26]. Nous avons déterminé que les changements dans la prolifération cellulaire et la migration à travers miR-144 pourraient être exercées par la régulation de l'expression MET. miR-144 répression conduit à des niveaux accrus de MET, ce qui peut expliquer le phénotype de la métastase des cellules miR-144 appauvries. Il est intéressant de miR-144 a influencé le facteur de croissance des hépatocytes (HGF) de signalisation. HGF, le ligand du MET, peut induire l'activation du MET dans les cellules épithéliales. Alors que MET surexpression ne pouvait pas restaurer complètement GC qualités tumorigènes, la migration cellulaire GC et la prolifération ont été partiellement restaurés après MET surexpression. Par conséquent, miR-144 peut réguler d'autres gènes dans les cellules du GC. Des études antérieures ont montré que MET peut induire GC tumorigenèse par l'activation de la voie PI3K. Dans cette étude, nous avons constaté que miR-144 a significativement atténué la phosphorylation de Akt, et que la phosphorylation de Akt a été entièrement restauré avec surexpression de MET. Nos résultats suggèrent que miR-144 régule la phosphorylation de Akt par la réglementation MET en GC.
En conclusion, notre étude a identifié une base pour le niveau diminué de miR-144 vu dans GC tissus métastatiques. miR-144 a été identifié comme étant un gène suppresseur de tumeur potentielle GC et elle a été associée à des mécanismes de GC métastases. En outre, miR-144 inhibe GC tumorigenèse en ciblant MET, et par la suite, la voie PI3K /Akt. À notre connaissance, ceci est la première fois miR-144 a été montré pour cibler MET dans les cellules du GC. REMERCIEMENTS des Déclarations de Notes de conséquence, de nouvelles études explorant le rôle anticancéreux de miR-144 peuvent contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour GC.
Jun Liu et Hui Xue ont contribué également à ce travail.
Cette étude a été soutenue par le national Natural science Foundation de Chine (Grant No. 81201897). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.
Intérêts concurrents
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts. Les contributions des auteurs

JL a réalisé les études de biologie moléculaire. HX a rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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