LNC RNA HOTAIR funkcionira kao natječu endogene RNA da regulira ekspresiju HER2 po spužvom Mir-331-3p u želučanom cancer

LNC RNK HOTAIR funkcionira kao natječu endogene RNA da regulira ekspresiju HER2 po spužvom Mir-331-3p kod raka želuca pregled Sažetak pregled Pozadina pregled Prikupljeni dokazi ukazuju da dugo nekodirajuće RNA HOTAIR igra ključnu ulogu u napredovanju raka i metastaze. Međutim, ukupna biološka uloga i klinički značaj HOTAIR u želučanom karcinogeneze ostaje nepoznanica.
Metode
HOTAIR izraz izmjerena je u 78 paru kancerozne uzorke i noncancerous tkiva u realnom vremenu PCR. Učinci na HOTAIR želuca kancerozne stanice su proučavali prekomjernom ekspresijom i RNA interferencije pristupa in vitro i in vivo. Uvid mehanizma konkurentnih endogenih RNA (ceRNAs) su stekli od bioinformatiku analize, analize luciferaze i RNA obvezujuća proteina imuno (RIP). Pozitivan HOTAIR /HER2 interakcija je identificiran i verificirani imunohistokemijski test i bivarijantnih analizu korelacije. Pregled Rezultati
HOTAIR ranijim koracima bila povezana s većom veličinom tumora, napredne patološkog pozornicu i veliko metastaza, a također u korelaciji s kraćim ukupnom preživljavanju želuca pacijenata oboljelih od raka. Nadalje, prekomjerna ekspresija HOTAIR promovirala proliferaciju, migraciju i invaziju stanica karcinom želuca, dok se HOTAIR omotača inhibirao oba invazije stanica i vijabilnost stanica i induciraju zaustavljanje rasta in vitro i in vivo. Konkretno, HOTAIR može djelovati kao Cerna, učinkovito postaje sudoper za Mir-331-3p, čime modulaciji derepression HER2 i nametanje dodatnu razinu nakon regulaciji transkripcije. Konačno, pozitivan HOTAIR /HER2 korelacija značajno povezana s uznapredovalim želučane raka.
Zaključci pregled HOTAIR prekomjerna ekspresija predstavlja biomarker lošom prognozom kod raka želuca, te mogu dati maligni fenotip na tumorske stanice. Cerna regulatorna mreža uključuje HOTAIR i pozitivnu interakciju između HOTAIR i HER2 može doprinijeti boljem razumijevanju patogeneze želučanog raka i olakšati razvoj lncRNA usmjerena dijagnostike i terapije protiv ove bolesti. Pregled Ključne riječi pregled Natjecanje endogene RNA HER2 HOTAIR rak želuca proliferacija i invazija Pozadina pregled, raka želuca je drugi vodeći uzrok raka izazvanog smrti, a najčešći je zloćudni tumor probavnog sustava u istočnoj Aziji, istočnoj Europi i dijelovima srednje i Južne Amerike. U većine bolesnika, raka želuca se dijagnosticira u poodmakloj fazi te je u pratnji maligne proliferacije, opsežan invazije i limfne metastaze. Uspješni terapijske strategije su ograničena, a smrtnost je visoka [1, 2]. Dugi kodiranja RNA (lncRNAs) nedavno stekli značajnu pozornost u opisivanje složenih mehanizama koji stoje iza malignih procesa, kao što su karcinogeneze, metastazama i otpornost na lijek. Stoga, ako želimo da u potpunosti razumiju želučane karcinogeneze, moramo uzeti u obzir tu obitelj regulatornih transkripata koje dodati novi sloj kompleksnosti na tumorske biologije.
Iako je samo mali broj funkcionalnih lncRNAs su dobro karakterizira do sada, oni pokazalo se da regulira ekspresiju gena, na različitim razinama, uključujući kromatina modifikacije, transkripcije i post-transkripcijsku obradu [3, 4]. Nedavno, novi regulatorni mehanizam je identificiran, u kojem preslušavanje između lncRNAs i mRNA nastaje natječu za zajedničke mikroRNA elemenata odgovor (miRNAs). U tom slučaju, lncRNAs može funkcionirati kao natječu endogene RNA (ceRNAs) spužvom miRNAs, čime modulaciji derepression Mirne ciljeva i određivanje dodatnu razinu nakon regulaciji transkripcije [5]. U prethodnim izvješćima, A lncRNA mišića specifičan, Linc-MD1, se navodi da je Cerna koji štiti MyoD RNK (mRNK) od degradacije Mirna posredovanog [6]. Pluripotency povezane LNC-RoR može funkcionirati kao ključni Cerna za povezivanje mreže miRNAs i ključnih faktora transkripcije, na primjer, Oct4, SOX2 i Nanog, u ljudskim embrionalnim matičnim stanicama. Osobito, lncRNA HULC visoko reguliran u karcinom jetre i igra važnu ulogu u nastanku tumora [7]. Konkretno, HULC može djelovati kao endogeni 'spužva' koji regulira prema dolje niz miRNAs aktivnosti, uključujući i Mir-372 [8]. Stoga predlažemo da neki lncRNAs također može imati uloge kao ceRNAs, povezujući miRNAs i post-transkripcijski mreže u želučanom patogenezi.
HOTAIR (Hox transkript negativna među-RNA
) je ~ 2,2 kb dug nekodirajuće RNA prepisana iz HOXC pregled lokusa koji može potisnuti transkripciju u trans Netlogu od HOXD pregled u prepucij fibroblasta [9]. Kao nove molekule u području biologije tumora, HOTAIR početku je postao poznat po svojoj umiješanosti u osnovnoj tumora dojke i metastazama raka dojke, pri čemu visina HOTAIR promovira invazivnosti i metastaziranje [10]. Nadalje, HOTAIR izraz pozitivno korelira s malignim procesima i lošim ishodom u kolorektalni karcinom, karcinom, rak gušterače i gastrointestinalnih strome tumora [11-14]. Nedavne studije su izvijestili da HOTAIR je reguliran u rakom želuca [15, 16]. Ipak, ukupna biološka uloga i temeljne molekularni mehanizam HOTAIR u želučanom karcinogenezi ostaje uvelike nedefinirana.
U ovoj studiji, javljaju se da HOTAIR regulaciju karakteristično je molekulska promjena kod karcinoma želuca i istražiti biološke uloge HOTAIR na fenotipova stanice raka želuca in vitro i in vivo. Štoviše, mehanički analiza otkriva da HOTAIR može funkcionirati kao Cerna se regulira ekspresiju receptora ljudskog faktora rasta epitela 2 (HER2) kroz natjecanje za Mir-331-3p, čime se igraju onkogeni ulogu u želučanom patogenezi. Ovaj rad pruža prve dokaze za pozitivnu HOTAIR /HER2 korelacije i preslušavanja između Mir-331-3p, HOTAIR i HER2, bacajući novo svjetlo na liječenju raka želuca. Pregled Rezultati
HOTAIR izražavanja je reguliran u ljudska tkiva raka želuca
razina HOTAIR izražavanja utvrđena je u 78 uparenih uzoraka raka želuca i susjednih, histološki normalnim tkivima QRT-PCR i normalizira na GAPDH. HOTAIR izražavanje bilo značajno reguliran u kancerogenih tkiva (znači odnos 14.35 puta, P < 0,01) u usporedbi s normalnim kolegama (Slika 1a). Ispitivanje povezanosti HOTAIR izražavanja i kliničkih patološke osobine su pokazali da HOTAIR regulaciju je povezana s većom veličinom tumora, napredne patoloških fazi, udaljenim metastazama (Slika 1B i C), limfnih čvorova metastaza i tumornih stanica diferencijacije (Tablica 1). Međutim, HOTAIR izraz nije bio povezan s položaja tumora i spolu bolesnika (Tablica 1). S obzirom na ukupno preživljavanje, bolesnici s visokim HOTAIR izražavanja imali značajno lošije prognoze od onih s niskim izražavanja HOTAIR (P < 0,001, log-rank testa, Slika 1D). Ovi rezultati pokazuju da prevelika ekspresija HOTAIR mogu biti korisni u razvoju novih prognostičke ili napredovanja markera za rak želuca. Slika 1 Odnosi HOTAIR izraz u želučanog tkiva raka i njegovo kliničko značenje. (A) Relativni ekspresija HOTAIR u želučanim tkivima raka (n = 78) u usporedbi s odgovarajućim ne-tumorske normalnog tkiva (n = 78). HOTAIR ekspresija je pregledao QRT-PCR i normalizira na GAPDH izražavanja. Podaci su prikazani kao višestruki broj promjena u tumorskim tkivima u odnosu na normalno tkivo. (B) Ispitivanje korelacije između HOTAIR izražavanja i kliničkih patološke osobine su pokazali da HOTAIR povećanje ekspresije u korelaciji s većim veličine tumora i napredne patoloških fazi. (C) HOTAIR izraz lica bio je značajno veći u bolesnika s udaljenim metastazama nego u onih s ne-udaljenim metastazama. krivulje ukupnog preživljavanja (D) Kaplan-Meier prema HOTAIR razine ekspresije. Cjelokupni opstanak visoke HOTAIR skupini (n = 39: HOTAIR omjer izraz ≥ medijan omjera) bila je značajno viša od one u Low-HOTAIR skupini (n = 39; HOTAIR omjer omjer izraz ≤ medijan P 0,001, log rank test). * P < 0,05, ** P < 0.01. Pregled Tablica 1. Korelacija ekspresije HOTAIR s kliničko značajkama
kliničko značajke
n (%)
Relativna izraz HOTAIRa
P-VALUE mlrd
Spol pregled P = 0,62 pregled Muški pregled 50 (64) pregled, 12,21 (0,97-17,53) pregled Ženski pregled 28 (36) pregled, 15,01 (7,34 -19,52) pregled stranice tumora pregled P = 0,910 pregled distalne trećine pregled 18 (23) pregled, 9,1 (1,37-14,12) pregled Srednji treći pregled 20 (26)
7,96 (2,55-9,72) pregled proksimalnog želuca pregled, 40 (51) pregled, 7,76 (1.24-13.58) pregled diferencijacije
P = 0.045 pregled Loše pregled 56 (72)
15,6 (6,25 - 20,36) pregled, visoke /umjereno pregled 22 (28) pregled, 8,1 (0,98-11,14) pregled limfnih čvorova metastaze pregled P = 0,005 pregled N0 pregled 10 (13)
1,14 (0,75-1,42) pregled N1 pregled 11 (14) pregled, 3,44 (1,15-4,85) pregled N2 pregled 29 (37) pregled 11.99 (7.15- 14.77) pregled, N3 pregled, 28 (36) pregled 32.58 (7,34-36,27) pregled, metastatske bolesti pregled P = 0,029 pregled M0
64 (82)
9,35 (2,53 -33,64) pregled M1 pregled 14 slika
28.82 (16.39-39.39) pregled aMedian relativne ekspresije, a 25.-75. percentile u zagradama. BP < 0.05 je smatrana značajnom (Mann-Whitney U pregled ispitivanje između 2 skupina i Kruskall-Wallis testa za 3 skupine). Pregled Manipulacija razina HOTAIR u stanicama raka želuca pregled Potom smo izvedenih QRT-PCR analiza ispitati razina ekspresije HOTAIR na razne stanične linije karcinoma, uključujući karcinom želuca, ne-malih stanica pluća (NSCLC) i stanice raka dojke izveden. Kao što je prikazano na Slici 2A, od četiri želučanih stanične linije raka istražuju (MGC-803, SGC-7901, BGC-823 i AGS) BGC-823 izraženi višu razinu HOTAIR (3.18-puta) nego normalne želučanog epitela stanice linija (GES-1). Slično tome, stanična linija NSCLC, SPC-A1, pokazala 3,73 puta doreguliranje HOTAIR iznad normalnog ljudskog bronhijalnog epitela stanične linije 16HBE. Visoko metastatskim stanična linija karcinoma dojke MDA-MB-231 pokazao je 4,77 puta doreguliranje HOTAIR odnosu MCF-7 (Slika 2A). Naši podaci ukazuju na to da HOTAIR može često reguliran u mnogim tumorskim stanicama. Slika 2 Razina HOTAIR ekspresije u stanicama raka želuca i njegovog efekta na proliferaciju stanica in vitro. (A) Rezultati QRT-PCR demonstriraju HOTAIR razine ekspresije želučane tumorskih staničnih linija (MGC-803, SGC-7901, BGC-823 i AGS) u usporedbi s normalnim želučanog epitela stanične linije (GES-1), NSCLC stanične linije ( SPC-A1), u usporedbi s normalnim ljudskim bronhijalnog epitela staničnu liniju (16HBE) i staničnim linijama tumora dojki MDA-MB-231 u usporedbi sa MCF-7. (B) QRT-PCR analize HOTAIR razini ekspresija nakon tretmana BGC-823 stanica sa iRNK ciljanja HOTAIR i tretmane SGC-7901 stanica sa pCDNA /HOTAIR vektora. (C) MTT test je izveden da se odredi proliferacija si-HOTAIR-transfektiranih BGC-823 stanice ili pCDNA /HOTAIR-transfektiranih SGC-7901 stanice. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± s.d. iz tri neovisna eksperimenta. (D) test rasta kolonija tvore je izveden da se odredi proliferacija si-HOTAIR transfektirane BGC-823 stanica. Kolonije su izbrojani i zarobljeni. * P < 0.05 i ** P < 0.01.
Za manipulaciju razine HOTAIR u želučanom stanicama karcinoma, pCDNA /HOTAIR vektor se transficira u SGC-7901 stanica i si-HOTAIR transficirana u BGC-823 stanice, pojedinačno. QRT-PCR analiza razina HOTAIR provedena je na 48 sati nakon transfekcije i otkriva da HOTAIR ekspresija povećan 98-puta u SGC-7901 stanice, u usporedbi s kontrolnim stanicama. Međutim, u BGC-823 stanicama, HOTAIR izraz je zapravo 75% srušen od strane SI-HOTAIR2, najučinkovitiji siRNA naknadno se koristi u sljedećim pokusima (slika 2b). Pregled Učinak HOTAIR na proliferaciju i apoptozu in vitro
značajan porast HOTAIR izražavanja u uzorcima karcinoma želuca potakla nas je na istraživanje mogući biološki značaj HOTAIR u nastanku tumora. MTT testa pokazala je da je rast stanica značajno umanjena u BGC-823 stanicama zaraženim s SI-HOTAIR, a proliferacija SGC-7901 stanica je povećan u pcDNA /HOTAIR transficirana stanica u usporedbi s odgovarajućim kontrolama (Slika 2c). Slično tome, rezultat testa stvaranja kolonija otkrila da klonogenskog preživljavanje smanjeno slijedi inhibicija HOTAIR u BGC-823 stanica (Slika 2D).
Bi se utvrdilo je li apoptoza je faktor stanične inhibicije rasta, proveli smo Hoechst bojenje i protočne citometrijske analize pročišćenih si-HOTAIR-BGC-823 stanicama. Podaci pokazuju da je broj stanica s jezgrom kondenzira i djelomično ukazuju dio ranih apoptotičnih stanica bila je značajno viša u-HOTAIR pomiješa si-BGC-823 stanicama u usporedbi s tretiranim si-NC-stanica (Slika 3A i B). Osim toga, otkrili smo da inhibicija HOTAIR poboljšane kaspaze-3-ovisna apoptoza, pokazalo je Western blot analizom aktivirane kaspaze-3 nakon si-HOTAIR transfekcijom (dodatne datotečne 1: Slika S1). Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da obaranje HOTAIR potiskuje proliferaciju stanica raka želuca, te potiče apoptozu in vitro. Slika 3 Učinak HOTAIR na želučane stanice raka apoptozom, migracije i invazije in vitro. BGC-823 stanice su transficirane sa si-HOTAIR ili Si-NC i SGC-7901 stanice su transfektirane sa pCDNA /HOTAIR vektor ili prazan kontrolu prijenosnika. (A) Hoechst pokus bojanja stanične apoptoze; postotak Hoechst-pozitivnih jezgri po optičkom području (najmanje 50 polja) određuje. (B) Na apoptotične stope stanica nađene su protočnom citometrijom. UL, nekrotične stanice; UR, terminal apoptotične stanice; LR, rani apoptotične stanice. (C i D) Transwell testovi su izvedeni istražiti promjene su migracija stanica i invazivnošću. * P < 0.05 i ** P < 0.01.
HOTAIR potiče migraciju i invaziju želučanih stanica raka in vitro
invazije stanica je značajan aspekt progresije raka koji uključuje migraciju tumorskih stanica u susjedna tkiva i raspad proteina izvanstaničnog matriksa. Ovdje smo ocijenili invazije stanica raka kroz transjažična testovima. Kao što je prikazano na slici 3C, transfekcije HOTAIR siRNA spriječile selica sposobnost BGC-823 stanice za oko 66%. Odgovarajući učinak na invazivnost je također zabilježena u paralelnom ispitivanju invazije. S druge strane, transfekcija SGC-7901 stanica sa pCDNA /HOTAIR vektor promovira migraciju stanica i invazivnosti ~ 1,9 puta (Slika 3d). Ovi podaci ukazuju na to da HOTAIR ima onkogene svojstva koja mogu promovirati selica i invazivni fenotip u želučanim stanicama raka.
HOTAIR promiče tumorigenezi želučanih stanica raka in vivo pregled Kako bi istražili da li je razina HOTAIR izražavanja utječe tumorigenezi, BGC-823 stanice transducirane s SH-HOTAIR /pENTR vektor (EV) se koristi u golih miševa modelu ksenografta. Do 16 dana nakon obaranje HOTAIR, došlo je do dramatičnog smanjenja volumena tumora i težina u SH-HOTAIR skupini u usporedbi s kontrolnom skupinom (Slika 4A, B i C). Sljedeći, imunobojanje Analiza markera proliferacije PCNA je provedena u reseciranih tumorskih tkiva. U usporedbi s onim kod tumora nastalih iz kontrolnih stanica, sh-HOTAIR izvedeni tumora pokazale značajno smanjena PCNA pozitivnost (slika 4D). Ovi rezultati sugeriraju da je razina ekspresije HOTAIR značajno je povezana s in vivo proliferacije svojstvu želuca stanica raka. Slika 4 Učinak HOTAIR obaranje na rast tumora in vivo. (A) Krivulje rasta tumora je izmjerena nakon injekcije BGC-823 stanicama zaraženim s SH-HOTAIR ili pENTR vektora. Izračunat je volumen tumora svaka 3 dana. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± s.d. (N = 5). (B) masa tumora. Vrijednosti su srednja vrijednost mase tumora ± s.d. (C) QRT-PCR analiza ekspresije HOTAIR u tkivima reseciranih tumora. (D) Tumori su se razvili iz BGC-823 /sh-HOTAIR stanica pokazuje nižu razinu PCNA proteina od tumora razvili iz BGC-823 /pENTR vektorske stanica. Gornja: H & E bojenje; Donja: imunološko. * P < 0.05 i ** P < 0.01.
HOTAIR je meta Mir-331-3P i Mir-124 pregled bioinformatiku analize Mirna prepoznavanje sekvenci na HOTAIR otkrila prisutnost 11 tumorom supresije miRNAs veznih mjesta. HOTAIR cDNA je kloniran nishodno od gena luciferaze i nazvan RLuc-HOTAIR (slika 5A), zatim transfektirane uz dodatak različitih Mirni kodiranje plazmida. rno-Mir-344 djelovao kao negativna kontrola. Rezultati su pokazali da je aktivnost luciferaze je smanjen za 48% i 31% u usporedbi s praznom kontrolu prijenosnika kad miR-331-3p i miR-124 su eksprimirani, respektivno. Ovi podaci pokazuju da su i Mir-331-3p i Mir-124 može izravno vezati za HOTAIR kroz odgovarajuće Mirna prepoznavanje sučelja (slika 5B lijevi dio). Slika 5 HOTAIR je meta Mir-331-3P ili MIR-124 i kontrolira Mir-331-3p cilj. (A) 11 pretpostavljenih vezna mjesta Mirne na HOTAIR nizu. HOTAIR cDNA sadrži potencijalni miRNAs prepoznavanje mjesta kloniran nizvodno od luciferaza gena i zove RLuc-HOTAIR. (B) Lijevo: Reporter plazmida luciferaze (RLuc-HOTAIR) bio ko-transfektiran u HEK-293 T stanica s 11 različitih Mirna kodiranje plazmida. Desno: reporter plazmida luciferaze sadrži divlji tip ili mutirani HOTAIR bio ko-transfektiran u HEK-293 T-stanice sa Mir-331-3p paralelno s praznim plazmida vektora. Aktivnost luciferaze je određena pomoću ispitivanja dual luciferaze i prikazan kao relativna aktivnost luciferaze je normalizirana na Renilla aktivnost. Histogram označava vrijednosti luciferazu mjerena 48 h nakon transfekcije. (C) s 3'-UTR HER2 je sjedinjen s lucifcrazc kodiranje regiji (RLuc-HER2 3'-UTR) i prenijeti u HEK293T stanica s Mir-331-3p za potvrdu HER2 je cilj Mir-331-3p. RLuc-HER2 3'-UTR i Mir-331-3p konstrukti su ko-transfektirane u HEK293T stanica s plazmida koji eksprimiraju HOTAIR (pCDNA /HOTAIR) ili s kontrolnim vektorom za provjeru aktivnosti Cerna od HOTAIR. rno-Mirni-344 je korišten kao negativna kontrola. Histogram označava vrijednosti luciferazu mjerena 48 h nakon transfekcije. (D) RIP s mišjim monoklonskim anti-Ago2, pre-IgG ili 10% ulaz iz BGC 823-staničnih ekstrakata. RNA u Imunoprecipitati su određeni QRT-PCR. Top: razina HOTAIR, miRNA331-3P i FOS RNA su predstavljeni kao višestruki obogaćivanje u Ago2 odnosu na IgG Imunoprecipitati. Dolje: Relativna razina RNA U1 snRNA u SNRNP70 odnosu na IgG Imunoprecipitati. Brojevi su srednja vrijednost ± S.D. (N = 3). (E) Western blot analiza razine ekspresije HER2 proteina nakon obrade BGC-823 stanica sa SI-HOTAIR ili pCDNA /HOTAIR i SGC-7901 stanica sa pCDNA /HOTAIR. GAPDH je korišten kao kontrola. * P < 0,05, ** P < 0,01 N.S. nije značajan.
su ovdje, odabrali smo Mir-331-3p kao model Mirna za daljnja istraživanja. Kako bi se dodatno potvrđuju da je smanjenje aktivnosti luciferaze iz RLuc-HOTAIR-WT vektor je zbog direktne interakcije između Mirne i njene pretpostavljene vezanja, mutirali smo Mir-331-3p vezno mjesto po ciljanom mutagenezom, što je rezultiralo RLuc -HOTAIR-Mut. Kao što se očekivalo, suzbijanje aktivnosti luciferaze u potpunosti je ukinuta u ovom mutantu konstrukta u usporedbi s divljim tipom vektora (slika 5B donji dio).
HOTAIR i Mir-331-3p oba vežu uz AGO2 u želučanim stanicama raka
miRNAs su poznato je da je prisutna u citoplazmi u obliku Mirna ribonukleoproteinskog kompleksa (miRNPs), koji također sadrže Ago2, osnovna komponenta RNA-inducirana utišavanje kompleks (RISC) [17, 18]. Za testiranje da li HOTAIR povezuje s miRNPs, RNA vezanje protein imunoprecipitacije (RIP) eksperimenti su provedeni na staničnim ekstraktima BGC-823 pomoću protutijela protiv Ago2. RNA u Imunoprecipitati su određeni QRT-PCR. HOTAIR je poželjno obogaćen (354 puta) u Ago2 sadržava miRNPs odnosu na kontrolu imunoglobulin G (IgG) Imunoprecipitati. Slično tome, Mirna-331-3p detektirano je na razini 840 puta veća od kontrole anti-IgG. Uspješno Imunoprecipitacija Ago2-povezana RNA je potvrđena QRT-PCR, bočnog primera protiv ljudskih FZS uključena u RIPAb + Ago2 kit (Slika 5D, gornja ploča). Štoviše, anti-SNRNP70 korišten je kao pozitivna kontrola za postupak RIP, a U1 snRNA također je detektirana na razini 206 puta veća od anti-IgG (Slika 5D, donji prikaz). Dakle, HOTAIR je prisutan u miRNPs Ago2 sadrže, vjerojatno kroz povezanost s Mirne-331-3p, u skladu s našim bioinformatika analiza i luciferaze testovima.
HOTAIR kontrolira Mir-331-3p cilj, HER2
među mnogim ciljevi Mir-331-3p, koncentrirani smo na HER2 jer kodira transmembranski protein s relevantnim funkcija u karcinogeneze i otpornost na trastuzumab-based terapije [19]. 3'-UTR HER2 je spojen luciferaze kodiranje regije (RLuc-HER2 3'-UTR) i transfektirane s plazmidima koji kodiraju Mir-331-3p i prazan plazmid vektor. rno-Mirna-344 djelovao kao negativna kontrola. Je test luciferaze je pokazalo da miR-331-3p značajno inhibira aktivnost luciferaze (~ 41% inhibicije) spoja iz RLuc-HER2 3'-UTR reportera, što potvrđuje da HER2 meta Mir-331-3p. RLuc-HER2 3'-UTR konstrukt toga bilo je ubačeno zajedno s plazmidi kodiraju Mir-331-3p i HOTAIR (pCDNA /HOTAIR). Luciferaze testovi pokazuju da, u prisutnosti HOTAIR, RLuc-HER2 3'-UTR represija obnovljena u usporedbi s kontrolnom skupinom (Slika 5C). To pokazuje da HOTAIR djeluje kao endogeni 'spužva' vezivanjem Mir-331-3p, tako ukidajući Mirne izazvanu potiskujući aktivnost na HER2 3 'UTR.
Nadalje, učinak HOTAIR izražavanja na endogene HER2 proteina u kombinacija s modulacijom Mirna ili lncRNA razinama praćena je različitim pristupima prikazanih na slici 5E: (1) mir-331-3p pojačanom ekspresijom HER2 protiv u BGC-823 stanicama; (2) HOTAIR obaranje protiv HER2 u BGC-823 stanicama; (3) HOTAIR pojačanom ekspresijom HER2 za u SGC-7901 stanica. Western blot analiza pokazala je da su nategnute izraz Mir-331-3p ili obaranje HOTAIR u BGC-823 stanice potiču značajno utišavanje učinak na endogene ekspresiju HER2 proteina. Nadalje, HER2 protein ekspresija značajno se regulira prema gore nakon transfekcije s HOTAIR u SGC-7901 stanica, koje pokazuje relativno nisku razinu endogenog HOTAIR izraz.
Zajedno ovi podaci pokazuju da se vezanjem Mir-331-3p, HOTAIR djeluje kao Cerna za meta HER2 mRNA, čime modulaciji derepression HER2 i nametanje dodatnu razinu nakon regulaciji transkripcije.
Mir-331-3p i Mir-124 potisnuti želučane stanice raka širenja pregled služiti kao endogeni sudoper za metu miRNAs, obilje HOTAIR trebali biti usporedivi s ili veća od Mir-331-3p /MIR-124. U našoj studiji, QRT-PCR analiza pokazala je da je Mir-331-3p /Mir-124 ekspresija obrnuto povezana sa HOTAIR izražavanja u 20 parova naprednih želučanog karcinoma (slika 6a). Da biste provjerili je li Mir-331-3p i Mir-124 također može spriječiti želučane proliferaciju stanica raka, prisiljeni smo svoj izraz u BGC-823 stanicama pomoću Mirna-kodiraju plazmidi. Razina ekspresije Mirne-331-3p i Mir-124 transfektirane u BGC-823 stanice bile su značajno porasla za 36 puta, a 29 puta, u usporedbi s kontrolnim stanicama (Slika 6b). Dalje, MTT i stvaranja kolonija testovi se izvode kako bi se utvrdilo stanica održivost. Rezultati testa i rasta krivulje MTT pokazala je da stanice transfecirane Mir-331-3p ili Mir-124 pokazali su značajnu usporavanja rasta u usporedbi sa stanicama koje su transfektirane s praznim vektorom (slika 6C). Ovi podaci pokazuju da prekomjerna ekspresija Mir-331-3p ili Mir-124 izražavanja može uhititi želučane proliferacije stanica raka, što je u skladu s rezultatima HOTAIR izražavanja obaranje u BGC-823 stanicama. Slika 6 pozitivna korelacija između HOTAIR i HER2 izražavanja i važnosti za Mir-331-3p /mir-124 razina ekspresije. (A) s dvije vrijednosti korelacijska analiza odnosa između HOTAIR izražavanja i Mir-331-3p, ili Mir-124 razini. (B) BGC-823 stanice transfektirane s plazmida koji kodiraju Mir-331-3p ili Mir-124, a QRT-PCR koristi za otkrivanje razine Mirna u usporedbi s kontrolnom skupinom (Mir-NC). (C) MTT test i test rasta kolonija tvorbu su provedena da se odredi proliferacija miR-331-3p ili miR-124 transfektiranih BGC-823 stanicama. (D) Lijevo: imunološko HER2 proteina u naprednim uzorcima želučane rak tkiva. Gornja: imunološko HER2 bio negativan u želučanim tkiva raka s relativno niskom ekspresijom HOTAIR. Donja: imunološko HER2 pozitivan u želučanim tkiva raka s relativno visokim HOTAIR izražavanja. Desno: bivarijantnih korelacijska analiza odnosa između HOTAIR i HER2 razini ekspresije. * P < 0,05, ** P < 0.01.
HER2 je coexpressed s HOTAIR u želučanim tkiva raka
Stopa ekspresiju HER2 je izvijestila da se 7-34% kod raka želuca, a bio je povezan s višim bolesti i lošije preživljenje u rakom želuca [19]. Otkrili smo ekspresiju HER2 u 50 naprednim želučanom tkivu karcinoma (faza III /IV) odabrana od prethodnih 78 želučanog tkiva raka imunohistokemijom (IHH) i QRT-PCR analize. Rezultati IHC bojenja pokazali HER2 proteina pozitivnost u 56% od odabranih 50 želučanog tkiva raka. Osamdeset i šest posto tih HER2 pozitivni uzorci bili iz poodmakloj fazi III /IV tumora, a 71% prikazuju visoku HOTAIR izraz (Slika 6D i dodatne datotečne 2: Tablica S2). Bivarijantnih korelacijska analiza pokazala je da je ekspresija HER2 je značajno korelira s HOTAIR razinu prijepisa u želučanog tkiva raka u usporedbi s normalnim kolegama (Slika 6D). Ovi podaci pokazuju da je ekspresija HER2 pozitivno povezane s upregulated HOTAIR u uzorcima tkiva raka želuca, što ukazuje da karakterizaciju interakcije HER2 /HOTAIR može biti biološki značajne ljudskog želučanog tumorogenezi. Pregled Značajno zbog trajnog faze III /IV suđenje, ekspresiju HER2 stopa otkrivenih u ovom istraživanju je veći od ranije objavljen medijana raspona. Ova povećana brzina ekspresiju HER2 snažno je povezan s lošim rezultatima za pacijente s metastatskim i visoko kvalitetni lokaliziran želučanog karcinoma, na taj način naglašavajući važnost HER2 u želučanom razvoju raka i metastaza. Pregled Rasprava
LncRNAs, koji su više od 200 nukleotida s ograničenim kapacitetom za kodiranje proteina, često se izražava u disease-, tkivno ili razvojnoj fazi specifičan način, što ukazuje na određene funkcije za lncRNAs u razvoju i bolesti, što te molekule atraktivne terapijske ciljeve [20-22]. Niz nedavnih radova su pokazali da deregulacija tih lncRNAs također može utjecati na regulaciju eukariotskih genoma i dati stanični prednost rasta, što rezultira progresivnim i nekontrolirani rast tumora [23-25]. Dakle, lncRNAs može pružiti nedostaje komad inače poznatog onkogeni i tumor supresor mreže slagalice.
U ovom istraživanju, testirali smo ekspresiju HOTAIR u uzorcima karcinoma želuca i njihovim okolnim ne-tumorskih tkiva. Također smo identificirali funkciju HOTAIR u stanicama karcinoma želuca primjenom koji stječu i gubitak-of-funkcije pristupi. Rezultati su pokazali da HOTAIR je reguliran u želučanom tkivu karcinoma u usporedbi sa susjednim normalnim želučanog tkiva, a to HOTAIR regulaciju korelaciji s većim veličine tumora, napredne patološkog fazi i opsežnim metastazama. Nadalje, ukupna vrijednost vremena preživljenja bolesnika s nižim razinama ekspresije HOTAIR bila je značajno veća od one bolesnika s umjerenim ili jakim razinama HOTAIR ekspresije. Nadalje, prekomjerna ekspresija HOTAIR promovirala proliferaciju, migraciju i invaziju stanica karcinom želuca, dok se HOTAIR omotača inhibirao staničnu invaziju i staničnu vijabilnost i induciraju zaustavljanje rasta i in vitro i in vivo. Osim toga, HOTAIR supresija dovelo do promicanju stanične apoptoze želuca. Ovi rezultati ukazuju na to da HOTAIR ima izravnu ulogu u modulaciji više onkogena svojstava i želučane progresije raka, potičući nove istraživačke pravce i terapijske mogućnosti s obzirom HOTAIR kao novi prognostički biljeg i terapijski cilj u raka želuca.
Važnost lncRNAs u humani bolest može biti povezano s njihovom sposobnošću da utjecati stanične funkcije putem različitih mehanizama. U ovoj studiji, jer se tiče mehanizam HOTAIR, vrijedno je spomenuti da subcelularni položaj analiza HOTAIR s RNA fluorescentne in situ hibridizacije pokazuje lokalizaciju HOTAIR na obje jezgre i citoplazme [24]. Očito je da je nuklearna HOTAIR mogu ciljati polycomb represivnu kompleks 2, mijenjajući H3K27 metilaciju i ekspresije gena uzorke preko genoma [10, 11]. Nedavni rad izvijestio je skela funkciju za HOTAIR u citoplazmi kao induktora ubikvitina posredovane proteolize [26]. Ipak, Tumorigenske svojstva i mehaničko heterogenost HOTAIR, a posebno one iz citoplazmatski obliku, daleko od toga da bude u potpunosti razjašnjen.
Inspiriran regulatorne mreže na 'konkurentskih endogenih RNA' i nastajanju dokazi koji navode da lncRNAs mogu sudjelovati u ovom regulatorni sklopove, pretpostavili smo da HOTAIR također može poslužiti kao Cerna pa smo tražili potencijalne interakcije s miRNAs. * P < 0.05. Svi autori pročitali i odobrili konačnu rukopis. Pregled

• Kvaliteta života, imunološkoj i sigurnost adjuvantne imele liječenja u bolesnika s želučanim karcinoma - randomizirano, kontrolirano pilot studija
• Dolje regulacija Thrombospondin2 predviđa lošu prognozu u bolesnika s karcinomom želuca