A tanulmány összehasonlítja a mikrobiomkutatáshoz használt DNS -kivonási és amplifikációs módszereket

Nézzünk szembe a tényekkel, eredményorientált társadalom vagyunk. Túlságosan az eredményre koncentrálva, az emberek gyakran nem gondolkodnak a "hogyan" -on. Például, elgondolkodtál azon, hogy "hogyan" kerültél ma reggel dolgozni, vagy csak most értél oda? A mikrobiológiai vizsgálatokban az eredmények a grafikonok és az adatok, de a "hogyan, "mint az ingázás, gyakran csak egy rutin része.

Azonban, a mikrobiomák elemzésének alapvető szempontja (gazdától függetlenül) a DNS -kivonási és amplifikációs módszereken alapul. A jelenleg forgalomban lévő tucatnyi DNS -kivonási módszer mindegyike képes DNS kinyerésére és jó hírű eredmények előállítására, de mindegyiknek kicsit más a "hogyanja". A laboratóriumok gyakran választják a "go-to" készletet, amelyet a laborvezető választ ki, és nemzedékről nemzedékre továbbadja a végzős hallgatókat. És miután kiválasztott egy módszert, a legjobb, ha ragaszkodik ehhez a módszerhez, mert mindenki tudja, hogy egy másik készlet kissé eltérő eredményeket hoz. De melyik módszer a legjobb? Hogyan válasszon? A "hogyan" mennyire befolyásolja az eredményeket? És mikor kell váltani?

A kísérleti tervezést és a mintagyűjtést általában hosszasan tárgyalják minden projekt elején, mégis gyakran figyelmen kívül hagyják a DNS -kivonási módszereket. Ez a fenyegető elfogultság, amikor figyelmen kívül hagyják a DNS -kivonási módszer fontosságát, Cecelia Giangacomo kutató és tanácsadója, Jason G. Wallace legfőbb kérdésévé vált Phytobiomes Journal kiadvány, "A DNS-kivonás és a 16S rRNS-gén-amplifikációs módszerek összehasonlítása a növényekkel kapcsolatos baktériumközösségek számára." Wallace kijelenti, "Ez a kutatás lehetővé teszi számunkra, hogy megtudjuk a legjobb/leghatékonyabb módszereket a jövőben. Laboratóriumunk sok növényi mikrobiológiai munkát végez, így biztosak akarunk lenni abban, hogy jól használjuk ezeket az erőforrásokat. Valóban meglepődtem, hogy ezt még senki nem tette, ezért reméljük, hogy más laboratóriumok hasznosnak találják. "

A DNS -extraháló készleteket széles spektrumra tervezték, hogy mind a mikrobák, mind a gazdaszervezetek számára működjenek. A legtöbb növény-mikrobiom projektben egy percnyi mikrobiális DNS lesz a gazdához képest. És így, A mikrobiom szekvenálás legnagyobb kihívása a mikrobiális DNS kinyerésének optimalizálása a gazdaszervezet DNS -jében a mintában.

A DNS kivonása után a kutatók gyakran egyetlen DNS -darabot erősítenek a minta összes organizmusából. Ez a DNS -darab különböző érdekelt fajokban konzerválódott, de elég eltérő a fajok között, hogy jellemezze a mintán belüli sokféleséget. A baktériumok felmérésének egyik leggyakoribb célpontja; a 16S riboszómális RNS-gén; jelen van a növényi kloroplasztokban is. Tehát bár ez az amplifikációs módszer jól működik a gazdaszervezetek és a mikrobák elválasztásában emberi és környezeti mintákban, a növényi mintákban továbbra is gazdaszervezet -szennyeződést okoz (a kloroplasztisz amplifikációja révén).

Wallace és csapata négy, a kereskedelemben kapható általános DNS -kivonási módszert hasonlított össze:DNeasy Plant (Qiagen), Gyors DNS (Zymo), Extract-N-Amp (Sigma-Aldrich), és Power Soil Kit (Qiagen). Négy különböző amplifikációs módszert is megvizsgáltak, amelyek a 16S riboszómális RNS gén specifikus régióit célozzák meg annak meghatározására, hogy melyik módszerrel sikerült a legjobban kizárni a gazda DNS -t, miközben megőrizte a mikrobiális DNS -t.

Az egyik módszer, amellyel a kutatók választhatnak a gazda DNS ellen, az amplifikációs folyamat módosítása. Wallace és munkatársai molekuláris bilincsek hozzáadását vizsgálták, amelyek lefogják a kloroplasztist és a mitokondriális DNS -t, lényegében gátolja a nem kívánt DNS amplifikációját. Megpróbálták a 16S gén egy másik régiójának felerősítését is, amely megkülönbözteti a kloroplasztist és a mitokondriumokat, ami a mikrobióma fokozott DNS -éhez vezet. A végső módszerük az amplifikációs folyamat optimalizálására olyan szekvenciákat használt, amelyek "megmérgezik" a nem kívánt DNS -t, így azt nem lehet tovább erősíteni.

Ez a folyamat analóg azzal, hogy több útvonalat választ az ingázás során. Mindegyiknek lehetnek átfedő díszletei, de egyedi tulajdonságai is; az egyik lehet festői, eggyel gyorsabb, egy másik stresszesebb. Wallace kutatásában a különböző kivonási és amplifikációs útvonalakat használhatták annak összehasonlítására, hogy a módszerek „hogyan” hogyan befolyásolják az általános eredményeket. Bár a legtöbb kutató tudja, hogy módszereik elfogultak, ez egy közvetlen egymás melletti összehasonlítás volt, amely megmutatta, hogy az egyes módszerek hogyan eredményeztek különböző eredményeket és hogyan változtatták meg a minta általános összetételét.

Ennek a tanulmánynak segítenie kell az embereket abban, hogy a legjobb döntéseket hozzák abból a szempontból, hogy miként fordítsák idejüket és pénzüket a mikrobiológiai kutatásokra. "

Jason G. Wallace

Wallace hangsúlyozta, hogy nincs "tökéletes módszer", és még a tanulmányukon belül is néhány módszer jobban működött egyes mintatípusoknál, másoknál azonban nem. Ezek az adatok ismereteket adnak a kutatóknak ahhoz, hogy jobban megalapozott döntéseket hozzanak módszereikkel kapcsolatban. Lehet, hogy még a legjobb módszer sem a legjobb módszer bizonyos projektekhez, minták, típusok, vagy költségvetések. A vállalatok folyamatosan próbálják optimalizálni termékeiket, így ahogy haladunk előre, ez a kihívás remélhetőleg könnyebb lesz a kutatók számára.

A legfontosabb, ez a kutatás arra enged következtetni, hogy az eredményeket befolyásoló módszerek között vannak különbségek. Nincs "tökéletes módszer". A kutatók feladata, hogy megértsék mintáik árnyalatait, és kiválasztják a legjobb módszert a tudományos kérdésre, amelyet remélnek megválaszolni. Tehát bár minden út eredményhez vezethet, a „hogyan” kísérletezése megéri a fáradságot, hogy megtaláljuk a legjobb utat a mikrobiómák kutatásához. "Ez nem paradigmaváltás, de ez az egyik kicsi, növekvő változások, amelyek segítenek nekünk egy kicsit jobb kutatást végezni, és idővel ezek jelentős javulásokat eredményeznek, - magyarázza Wallace.

• A családok társadalmi-gazdasági helyzete befolyásolhatja a gyermekek bél mikrobiom összetételét
• Az érzelmi támogatás és az ellenálló képesség segíthet enyhíteni a járvány pszichológiai hatásait