La valutazione del recettore toll-like 4 Asp299Gly, Thr399Ile e l'interleuchina-8 -251 polimorfismi nel rischio di sviluppo del cancro gastrico distale

La valutazione del recettore toll-like 4 Asp299Gly, Thr399Ile e l'interleuchina-8 -251 polimorfismi nel rischio di sviluppo del cancro gastrico distale
Abstract
sfondo
L'intensità dell'infiammazione indotta da Helicobacter pylori
colonizzazione è associato con lo sviluppo del cancro gastrico distale (GC). La risposta dell'ospite a H
. pylori
è stata correlata al polimorfismi genetici che influenzano entrambe le risposte immunitarie innate e adattative.
Il nostro obiettivo era quello di verificare se la presenza della
TLR4 Asp299Gly, TLR4 Thr399Ile
e IL-8-251
polimorfismi a /T hanno avuto alcuna influenza nello sviluppo di GC distale in una popolazione messicana
Metodi
abbiamo studiato 337 pazienti che sono stati divisi in due gruppi:. 78 pazienti con istologicamente confermato GC distale e 259 non-cancro controlli. La presenza di H. pylori
nella popolazione di controllo è stato definito da risultati positivi di almeno due dei quattro test diagnostici: esami sierologici, istologici, di test rapido dell'ureasi e della cultura. Il DNA umano è stato purificato e genotipizzati per TLR4 Asp299Gly
polimorfismo da pirosequenziamento, per TLR4 Thr399Ile
da PCR-RFLP e per IL8-251
dal sistema di amplificazione refrattaria mutazione (ARMS) -PCR.
Risultati
il gruppo di controllo non-cancro è risultato essere in Hardy-Weinberg al loci polimorfici studiato (chi-quadrato HW = 0.58 per IL8-251
, 0,42 per TLR4 Asp299Gly
e 0,17 per TLR4 Thr399Ile
). Le frequenze degli alleli mutati (omozigoti più eterozigoti) sono stati confrontati tra casi e controlli. Abbiamo trovato alcuna differenza significativa per TLR4- Asp299Gly
[il 7,7% dei pazienti CG distali e del 7,7% dei controlli non tumorali (p = 0.82)] e per TLR4 Thr399Ile
[il 1,3% dei pazienti GC e il 5 % della popolazione di controllo (p = 0,2)]. Al contrario, per IL-8-251
A /T, 80.77% dei pazienti GC e 66,4% nel gruppo di età di controllo e di genere abbinato avevano almeno una copia del allele mutato (OR = 2.12, 95% CI = 1,1-4,2) (p = 0.023).
Conclusione
questo studio ha dimostrato che il IL8-251 * Un
allele potrebbe essere legato allo sviluppo del cancro gastrico distale in questa popolazione messicana.
Sfondo
Helicobacter pylori
colonizzare quasi esclusivamente strato mucoso dello stomaco umano e di soggiornare nello Stato membro ospitante per anni, decenni o forse per tutta la vita. In circa il 10% dei casi, l'organismo è associata a esiti clinici diversi, tra cui dispepsia non ulcerosa, ulcera peptica e cancro gastrico distale [1].
Sia host e fattori ambientali sono stati associati a questa diversità clinica. Host fattori riguardano principalmente il riconoscimento dei batteri da parte del sistema immunitario e variazione del livello di risposta citochine [2, 3].
Riconoscimento di patogeni è mediata da una serie di recettori linea germinale-codificati che vengono denominati recettori di pattern-recognition (PRR). Questi recettori riconoscono conservati modelli molecolari, che sono condivisi da grandi gruppi di microrganismi. Un PRR importante è Toll-like receptor 4 (TLR4), un recettore transmembrana che riconosce una serie di ligandi, tra cui il lipopolisaccaride (LPS), che si trova nella parete cellulare di batteri Gram-negativi come H. pylori
[3 ]. Due polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) del gene TLR4
, ASP-299 → Gly e Thr-399 → transizioni Ile, hanno dimostrato di portare a iporesponsività a LPS, ridotta densità epiteliale TLR4 e ridotta risposta infiammatoria delle citochine di LPS [ ,,,0],4]. Inoltre, varianti genetiche di citochine sono anche fondamentali per la risposta infiammatoria, e diversi geni provenienti da diversi percorsi sono stati associati con il cancro gastrico, tra cui l'interleuchina (IL) -1B
, TNF
, IL-10 e

[5-7].
iL-8 funzioni di citochine come un potente fattore chemiotattico per i neutrofili e linfociti iL-8. E 'stato riportato che l'IL-8 livelli aumentati di 10 volte in campioni di cancro gastrico rispetto ai normali tessuti gastrici. A ben caratterizzato SNP T /A nella -251 locus è stata descritta e associata a più alta di IL-8 produzione e diverse malattie [8-11].
Il nostro obiettivo è stato quello di determinare se la
TLR4 Asp299Gly, TLR4 Thr399Ile
e la IL8-251 a /T
polimorfismi sono associati con cancro gastrico distale in una popolazione messicana ben definito
. Metodi
popolazione paziente
Abbiamo studiato 78 pazienti non imparentati con istologicamente confermati GC distale (età media = 58.6y, età media = 60, fascia di età: 22-84, F: M = 0.56). Abbiamo anche studiato 259 pazienti senza evidenza istologica di GC (età media = 57.1y, età media = 54, intervallo di età = 18-92, F: M = 1.17). Questa popolazione è stato descritto in precedenza [7]. Tutti i pazienti sono stati arruolati presso l'Ospedale Universitario "Dr. José González Eleuterio", Universidad Autónoma de Nuevo León. Il comitato etico locale ha approvato lo studio e il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i soggetti.
Esami istopatologici
da tutti i pazienti di controllo, otto campioni bioptici sono stati ottenuti per la valutazione istologica, due dalla curvatura minore, due dalla grande curvatura , due dalla angularis incisura, e due dalla regione prepyloric. Da pazienti con GC distale, almeno 8 biopsie sono state ottenute dal tumore per la valutazione istologica. Le biopsie di casi e controlli sono stati fissati, inclusi in paraffina e colorati con ematossilina-eosina. Un esperto patologo ha esaminato tutti i vetrini istologici.
H. pylori
stato
Il H. pylori
status della popolazione di controllo è stata determinata dalla istologia, il test rapido dell'ureasi (RUT), sierologia e cultura . Per il RUT, una biopsia antrale è stato analizzato da un test non commerciale convalidata [12]. La biopsia è stata posta in una fiala di prova, incubate a 37 ° C e leggere entro 24 h. Un cambiamento di colore da arancione a magenta era positiva. Per gli esami sierologici, un immunoenzimatico (ELISA) è stato utilizzato per dimostrare la presenza di anticorpi IgG come descritto in precedenza [13]
. Cultura è stata effettuata su due corpus e due biopsie dell'antro con metodi standard. Biopsie sono stati collocati in 10% agar sangue (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) e incubate a 37 ° C per almeno una settimana sotto condizioni microaerobiche. I ceppi sono stati identificati dalla colorazione di Gram, ossidasi, test catalasi e dell'ureasi
. Pazienti di controllo sono stati considerati H. pylori
infetto quando almeno due dei test diagnostici sono stati positivi.
La prevalenza di H. pylori
infezione nei pazienti affetti da cancro gastrico è stato determinato dal risultato di istologia solo
. genotipizzazione
DNA genomico è stato estratto da sangue periferico dall'alcol fenolo-cloroformio-isoamilico e precipitazioni con il metodo etanolo. Un sistema di mutazione refrattario di amplificazione (ARMS) -PCR metodo è stato utilizzato per il genotipo IL8-251
polimorfismo come descritto in precedenza [14].
Il TLR4 Thr399Ile
polimorfismo è stato determinato mediante PCR-RFLP [15] e il TLR4 Asp299Gly
polimorfismo è stato determinato con un metodo pyrosequencing progettato per questo studio. Inizialmente, una PCR è stata eseguita con i primer F-GAT TAG CAT ACT TAG ACT ACT ACC TCC ATG e R-CCC TTT CAA TAG TCA CAC TCA CCA GG con il primer inverso biotinilato. Le condizioni di PCR erano: 94 ° C per 5 min e 40 cicli di 94 ° C, 59 ° C e 72 ° C per 30 s ciascuno, e una estensione finale a 72 ° C per 5 min. Per pyrosequencing, modelli di PCR biotinilati sono stati immobilizzati su perline Sepahrose paramagnetiche rivestite di streptavidina in tampone di legame. I complessi bead-modello sono stati lavati per immersione in alcool al 70% e 0,5 M NaOH e quindi aggiunti a 45 ml di tampone di ricottura contenente 15 pmol del sequenziamento di primer 5'-CAT ACT TAG ACT ACT ACC TC 3 '. Ricottura avvenuta a 80 ° C per 2 min. In tempo reale pyrosequencing è stata eseguita in un'analisi automatizzata 96 pozzetti pyrosequencer PSQ SNP 96 (Pyrosequencing AB, Uppsala, Svezia) utilizzando enzimi e substrati consigliati dal produttore.
Statistica
Hardy-Weinberg di alleli a loci individuale è stata valutata dalle statistiche chi-quadrato. Differenze statisticamente significative sono state determinate mediante test t di Student
, chi-quadro o il test esatto di Fisher, due code. Una probabilità (P) Valore < 0.05 è stato considerato statisticamente significativo. Odds ratio (OR) con il 95% intervallo di confidenza (IC) sono stati calcolati utilizzando il software Epi-Info 2000 (Center for Disease Control and Prevention, Atlanta, Ga.). Tre analisi sono state effettuate, in cui tutti i casi e controlli sono stati inclusi, un secondo in quali casi sono stati confrontati soltanto con H. pylori
+ controlli e una terza analisi in cui i comandi di popolazione sono stati abbinati per età 5 anni di gruppo e di genere con i casi di cancro.
Risultati
gruppi di studio caratteristiche e H. pylori
stato
La distribuzione dei genotipi in base ai risultati istologici è indicato nella Tabella 1 1.Table genotipo e allele frequenze di iL-8 251
a /T e TLR-299
e -399
loci nel non-cancro e gruppi di cancro secondo i risultati istologici

IL8-251 A /T

TLR4 Asp299Gly
TLR4Thr399Ile
Group (n)
genotipo
allele
genotipo
allele
genotipo
allele
AA per
TT
* A * T

1,1
1,2
* 1 * 2

1 , 1
1,2
* 1 * 2

Gastrite (207)
42
97
68
0.44
0.56
190
17
0.96
0.04
196
11
0.97
0.03
PUD (29) 4
14
11
0.38
0.62
29
0
1 0
27 2
0.97
0,03
AG + IM (23)
5 10
8
0.43
0.57
20 3
0.93
0,07
23
0
1 0
cancro gastrico (78)
16
47
15
0.51
0.49
72
6
0.96
0.04
77
1
0.99
0.01
diffuse type
8
26
8
0.5
0.5
38
4
0.95
0.05
41
1
0.99
0.01
intestinal tipo
8
21 7
0.51
0.49
34 2
0,97
0.03
36
0
1
0
H. pylori
+ (191)
37
90
64
0.43
0.57
175
16
0.96
0.04
181
10
0.97
0.03
Age e genere abbinato (n = 189)
33
87
69
0,4 ​​
0,6
175
14
0.96
0,04
179
10
0.97
0.03
PUD: ulcera peptica; AG, gastrite atrofica; IM: metaplasia intestinale
Le frequenze genotipiche a loci individuale studiato erano in Hardy-Weinberg, con i non-significativi valori di chi-quadrato (0,58 per IL8-251
, 0,42 per TLR4 Asp299Gly
e 0,17 per il
TLR4 Thr399Ile). Tra il gruppo di controllo, il 80% ha avuto gastrite cronica (Tabella 1), 11,2% dei pazienti ha avuto PUD e 8,8% dei pazienti ha avuto gastrite atrofica e /o metaplasia intestinale. La proporzione di diffuso e intestinale cancro gastrico era 1.2:. 1
La prevalenza di H. pylori
nel gruppo di controllo era 73,7%. Questo è simile al valore riportato in precedenza per questa popolazione di studio [16]. La prevalenza di H. pylori
tra i pazienti affetti da cancro gastrico è stato del 53,8%
. Valutazione del rischio di IL8-251
A /T, TLR4 Asp299Gly
e TLR4 Thr399Ile
genotipi
abbiamo confrontato tutti i genotipi particolari per IL8-251
(AA, AT e TT), per TLR4 Asp299Gly
(1,1, 1,2 e 2,2) e TLR4 Thr399Ile
(1,1, 1,2 e 2,2) (Tabella 1). La frequenza del IL8-251
AT genotipo era più alta nei casi di cancro gastrico rispetto a tutti i controlli, solo H. pylori
controlli positivi e età e sesso abbinato controlli (Tabella 2) .table 2 odds ratio e 95 intervalli di confidenza% per l'analisi dei genotipi di distali casi di cancro gastrico vs
tutti i controlli non-cancro.

IL8-251 * Un
IL8-251 AT
TLR-299 * 2
TLR-399 * 2
tutti i casi vs
O
(95% CI)
p
OR (95% CI)
p
o 95% CI
p
o 95% CI
p
Tutti i controlli (n = 259)
2.12 (1,1-4,2)
0.023
1.73 (1-3)
0.049
1 (0,3-2,8)
.82
0,25 (0,01-1,8)
0,2
H. pylori
+ controlli (n = 191)
2.12 (1,1-4,2)
0,029
1.7 (0,96-3)
0,068
0.91 (0,3-2,6)
0.95
0,24 (0-1,8)
0,19
Età e sesso abbinati controlli (n = 189)
2.42 (1,2-4,8)
0,009
1.78 (1-3,2
0,035
1.04 (0,3-3,1)
0.86
0,23 (0-1,8)
0,1
Valutazione del rischio di IL8-251
* A, TLR4 Asp299Gly * 2
e TLR4 Thr399Ile * 2
alleli
Abbiamo poi hanno confrontato il trasporto del IL8-251 * un
allele (omozigote più eterozigote) per i casi di GC e tutti gastrite, più controlli normali. Abbiamo trovato un'associazione del IL8 -251 * Un
allele e lo sviluppo di GC (OR = 2.12, 95% cI = 1,1-4,2, p = 0,023) (Tabella 2). Quando abbiamo confrontato tutti i controlli gastrite più normali vS
tipi di cancro istologici , i rischi per la diffusa e tipi di cancro gastrico intestinale erano simili ma non significativa (OR = 2.15, p = 0,08 e OR = 2.1, p = 0,13, rispettivamente).
Quando abbiamo confrontato i casi di cancro gastrico con H. pylori
+ controlli abbiamo trovato un valore simile (OR = 2.12, 95% cI = 1,1-4,2, p = 0,029).
successiva, abbiamo confrontato la frequenza nel gruppo withage cancro gastrico e di genere abbinati controlli e abbiamo trovato un più forte associazione (OR: 2,42, 95% CI = 1,2-4,8, p = 0.0.009).
non abbiamo trovato alcuna associazione per TLR4 Asp299Gly * 2
e TLR4 Thr399Ile * 2
alleli hyporeactive.
discussioni e conclusioni
la diversità in risposta all'infezione da H. pylori
è stato attribuito a diversi fattori. La risposta immunitaria geneticamente regolato sembra giocare un ruolo cruciale nel determinare l'intensità dei danni per l'host [1-3].
Diversi autori hanno descritto l'aumento della produzione di IL-8 durante H. pylori
infezione. Un /T polimorfismo A alla posizione -251 del gene è stato associato ad una maggiore attività di questo interleuchina e recentemente, questo allele è stato collegato in due studi per lo sviluppo del cancro gastrico in giapponese popolazione [10, 11]. In uno di questi studi, il IL8-251 AA
genotipo tenuto un più alto rischio di gastrite atrofica (OR = 2.35; 95% CI = 1,12-4,94) e cancro gastrico (OR = 2.22; 95% CI = 1.08- 4.56) rispetto al genotipo TT. Hanno studiato 252 controlli sani, 215 pazienti con gastrite atrofica, e 396 pazienti con cancro gastrico. L'AA e AT genotipi sono risultati significativamente associati con i livelli più elevati di IL8 proteine, più grave infiltrazione dei neutrofili rispetto al genotipo TT. Nell'altro studio, la IL-8 -251
* Un allele era associata ad un più alto rischio di cancro gastrico (OR = 2.1, 95% CI = 1,38-2,92). I nostri risultati hanno mostrato alcuna associazione tra alti tassi di GC e il genotipo AA, ma un'associazione positiva è stato trovato per il genotipo AT e il trasporto di almeno una copia del * A allele (omozigote più eterozigote). È notevole che il valore RUP osservato nel nostro studio (2.12) è molto simile a quella osservata nella popolazione giapponese (2.1).
L'IL-1B-31 C /T
polimorfismo è stato associato con lo sviluppo del cancro gastrico e una differenza geografica-etnica è stato descritto per questo locus, con una forte associazione del polimorfismo in occidentale rispetto alla popolazione orientale. I risultati per l'/T polimorfismo IL-8-251
un correlato con i dati precedenti presentati per la popolazione giapponese, che mostrano alcuna tendenza a variazione geografica o etnica.
È attualmente irrisolto se un iporesponsività LPS via di segnalazione è utile o dannoso per l'host. Gli individui con il hyporeactive TLR4
polimorfismi hanno mostrato ridotti livelli di citochine infiammatorie, con un aumento del rischio di infezioni batteriche acute e una tendenza verso un aumento della mortalità in circolazione. Altri studi recenti supportano l'ipotesi che i TLR4
polimorfismi basso funzionamento possono provocare una risposta infiammatoria ridotta associata ad un'infezione a bassa danni che promuoverà una infezione persistente [17-20]. In questo studio, non abbiamo trovato alcuna associazione tra GC e polimorfismi TLR4, suggerendo che non contribuiscono allo sviluppo del cancro gastrico distale. Entrambi TLR4 Asp299Gly
e Thr399Ile
polimorfismi sono stati segnalati in linkage disequilibrium (LD) [21, 22], ma abbiamo deciso di genotipo sia perché non sapevamo se fossero in LD nella nostra popolazione.
in conclusione, i nostri risultati preliminari suggeriscono che IL8-251
è un polimorfismo modificante la malattia biologicamente plausibile. Se confermato in più popolazioni, come è stato in giapponese, e ora i gruppi messicani, questo sito polimorfico, in collaborazione con gli altri, potrebbe essere utilizzato per identificare i pazienti a maggior rischio per GC, che potrebbe essere necessario un più stretto monitoraggio.
Dichiarazioni
Conflitto di interessi
L'autore (s) dichiarano di non avere interessi in gioco.

• soci di infezione gastrica da Helicobacter pylori con un aumento del rischio di polipi del colon-retto in Africa Americans
• Fosforilata Smad2 in avanzata fase gastrico Carcinoma