Kurkuminas pagerina išraišką SCF /c-KIT per lengvinančių oksidacinį stresą ir NF-κB aktyvacijos skrandžio audinių diabetinės gastroparezę rats

kurkumino pagerina išraišką SCF /c-KIT per lengvinančių oksidacinį stresą ir NF-κB aktyvacijos skrandžio audinių diabetu gastroparezę žiurkių
Anotacija
faktai
cukrinis diabetas yra susijęs su daugelio rūšių komplikacijų. Naujausi tyrimai parodė, kad oksidacinį stresą ir uždegiminės reakcijos turi kritinių vaidmenis diabetinės gastroparezę patogenezėje. Kurkuminas yra žinoma, kad turi antioksidacinių ir anti-uždegiminių savybių. Šiame tyrime mes tyrė Kurkuminas apie diabetinės skrandžio motorikos efektas Sprague Dawley žiurkių modelį 1 tipo cukriniu diabetu.
Metodai
Vyras SD žiurkės buvo suskirstyti į kontrolinę grupę, kontrolinė grupė gauna kurkuminas, cukriniu diabetu grupė, ir cukriniu diabetu grupė gavimo kurkumino. Diabetas buvo sukeltas pilvo ertmę injekuojant streptozotocin. Kurkuminas (150 mg /kg kūno svorio) buvo suteiktas intragastrically 6 savaites, ir buvo matuojamas gliukozės kiekis kraujyje ir kūno masės. Skrandžiai buvo pašalintų analizei skrandžio ištuštinimą normos ir lygių oksidacinio streso. NF-κB I-κB ir kamieninių ląstelių faktoriaus (MMK) /c-KIT baltymų kiekis buvo vertinamas Vakarų dėmė analizės, o tarpin ląstelių Cajal (ICCS) apoptozė buvo įvertintas TUNEL dažymo.
Rezultatai
kurkuminas gydytų cukriniu diabetu žiurkė reikšmingai pagerino skrandžio ištuštinimą normos [(59,4 ± 7,5)%], palyginti su cukriniu diabetu žiurkių [(44,3 ± 5,7)%], taip pat sumažėjęs MDA [21,4 ± 1,8 (nmol /mg), prieš
27,9 ± 2,1 (nmol /mg)] ir padidino SOD aktyvumas [126,2 ± 8,8 (vnt /mg), lyginant su
107,9 ± 7,5 (vnt /mg)]. Kita vertus, skrandžio išsituštinimo lygis kontrolinės grupės nebuvo žymiai skiriasi nuo kontrolinės grupės, gaunančios kurkumino gydymą. Be to, kurkuminas gydytų cukriniu diabetu žiurkė žymiai didesnių MMK /c-KIT baltymų skrandžio audinių, slopinamas I-κB degradaciją ir NF-κB aktyvavimo ir sumažino TBT apoptozę indeksą [(26,2 ± 4,1)%, palyginti su
(47,5 ± 6,2)%], palyginti su diabetine grupei.
Išvada
Kurkuminas gydymas pagerėjo skrandžio ištuštinimą blokuoja oksidacinio streso gamybą, panaikinti NF-κB perduoti signalo ir stiprinti išraišką SCF /c-Kit žiurkės su diabetine gastroparezę.
Raktiniai žodžiai
Kurkuminas Diabetinė gastroparezę oksidacinis stresas NF-κB kamieninių ląstelių faktoriaus /c-kIT tarpinio puslapio ląsteles CAJAL Įvadas
Diabetinė gastroparezę yra virškinimo trakto liga, kuri apibrėžiama kaip uždelsto užsilieka kietas miltai, ir yra vertinamas 30-50% pacientų su 1 tipo arba 2 tipo cukrinio diabeto [1]. Pacientai dažnai turi viršutinės virškinimo trakto simptomai, pvz anksti sotumo, svorio netekimas, pilvo pūtimas, pilvo diskomfortas, pykinimas, vėmimas pasitaiko dažnai ir sutrikusi glikemijos kontrolę, ir liga rimtai paveikia pacientų gyvenimo kokybę.
Gastroparezę vis dažniau pripažįstamas kaip reikšmingas sveikatos problema. Nors gastroparezę paveikia daugelį diabetikams visame pasaulyje, ne tik yra gydymo galimybės labai ribotos, bet ir gydymo būdų, kurie yra prieinami diabetinės gastropatijos dažnai neveiksmingas. Tai apima medicininį gydymą, skrandžio elektros stimuliacija, chirurginis gydymas, ir maistinę pagalbą. Vaistai gastroparezę yra metoklopramido, domperidono, cisapridas, eritromicinas ir. Nors šie agentai buvo naudojami gydant gastroparezę, jie buvo pranešta, kad ribota veiksmingumą, ir daugelis pacientai negali toleruoti juos, nes jų šalutinį poveikį. Cukriniu diabetu sergančių pacientų gydymui atsparia gastroparezę, aukšto dažnio skrandžio elektros stimuliacija stacionariai implantuoto sistemos žymiai pagerėjo virškinamojo trakto viršutinės simptomus ir yra alternatyvus chirurginis gydymas pacientams. Chirurginės procedūros, pavyzdžiui, pašalintas skrandis ir antrectomy yra paskutinė galimybė gydyti, yra prieštaringas ir reikia daugiau tyrimu [2]. Pacientams, sergantiems sunkiu gastroparezę bet normalus plonojo žarnyno peristaltiką, gali būti taikomas jejunostomy vamzdis kūdikį. O tai suteikia maistinę palaikymo, ji negydo gastroparezę [3]. Diabetinė gastroparezę paprastai geriausia gydyti mediciniškai ir tik pacientams, sergantiems sunkia diabetine gastroparezę kurie nesugebėjo reaguoti į medicinos gydymą jokios kitos gydymo. Tokiu būdu, rasti vaistus, kurie rodo, veiksmingumo gydant diabetinė gastroparezė yra būtina.
Diabetinė gastroparezė yra susijęs su intersticinių ląstelių Cajal (ICCS) praradimo tiek žmonėms, tiek ir pavyzdinių gyvūnų [4]. ICCS gali būti identifikuojami audinio ženklinimo imuninius serumus į receptorių tirozino kinazės komplektas, baltymas išreikštas prieauginį. Rinkinys ir jo ligando kamieninių ląstelių faktoriaus (MMK) taip pat yra svarbūs išgyvenimo veiksniai prieauginį [5]. Padidėjęs oksidacinis stresas susijęs su diabetu, gali sukelti nuostolių ar žalos prieauginį pelių, o oksidacinis stresas sukelia sugadinti ir prarasti TBT tinklų ir uždelsto skrandžio plėtra ištuštinti [6]. Diabetas rezultatai išaugo oksidacinio streso ir vaidina svarbų vaidmenį diabeto komplikacijų [7] patogenezėje. Perprodukcija reaktyvių deguonies formų (ROS) rezultatų oksidacinio pažeidimo, įskaitant lipidų peroksidacijos, baltymų oksidacija, ir DNR pažeidimus, o tai gali sukelti ląstelių žūtį. Be to, ROS yra žinoma, kad veikia kaip antras pasiuntinius aktyvuoti transkripcijos veiksnius, kaip antai branduolinių faktoriaus kapa B (NF-κB). ROS susidaro streso skrandžio audinio metu gali sukelti apie NF-κB signalizacijos kaskados aktyvinimas; Iš tiesų, skrandžio išsituštinimo cukriniu diabetu žiurkių yra susijęs su aktyvavimo NF-κB medijuojamo uždegimas.
kurkumino (1,7-bis-(4-hidroksi-3-metoksifenil) -1, 6-heptadiene-3,5- dionas) yra pagrindinė veiklioji sudedamoji dalis ciberžolė, išskirtas iš augalų Curcumalonga L. kurkumino yra daugiafunkcinis molekulė su dideliais reguliavimo poveikį vėžio [8], uždegimas [9] ir cukriniu diabetu susijusių ligų, tokių kaip diabetinės retinopatijos [10], diabetinė nefropatija [11], ir diabeto kognityvinė disfunkcija [12]. Kurkuminas yra stiprus sugėriklis reaktyviųjų deguonies ir azoto rūšių, pavyzdžiui, kaip hidroksilo radikalų ir azoto dioksido radikalų [13]. Keletas tyrimų parodė, kad kurkuminas slopina aktyvacijos NF-κB prouždegiminių signalizacijos būdus [14]. Tuo tarpu, NF-κB transkripcijos veiksniai reguliuoja daugelį svarbių fiziologinių procesų, įskaitant uždegimą ir imuninės sistemos atsaką, ląstelių augimui ir išlikimui skaičių, todėl slopinamas NF-κB signalizacijos sudaro gyvybingą strategiją ligų gydymas [15]. Tačiau, ten buvo labai mažai tyrimų dėl Kurkuminas potencialo gydyti diabetinę gastroparezę arba jo farmakologiniu mechanizmo.
Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti, ar tam Sprague Dawley (SD) žiurkių modelį 1 tipo cukriniu diabetu diabetas, vidutinio dozės [16] kurkuminas gali apsaugoti ICCS cukriniu diabetu su žiurkėmis uždelstu skrandžio ištuštinimo, mažinant oksidacinį stresą ir slopina NF-κB aktyvavimo, didinant SCF /Kit išraiška, ir normalizuoja skrandžio išsituštinimą delsimo.
medžiagos ir metodai
Eksperimentiniai žiurkėms ir indukcija Diabetas
Vyras SD žiurkių (8 savaičių amžiaus) buvo veisiami eksperimentinių gyvūnų centras, Zhejiang Kinijos medicinos universiteto (Hangzhou, Kinija), kur konkretus patogenais neužkrėsti (SPF) -level laboratorija buvo įgaliotas Zhejiang provincijos valdžia. Visi žiurkės buvo laikomi tokiomis sąlygomis, kontroliuojamo drėgmės (50-60%). Jie buvo laikomi kontroliuojamo šviesos (12 val dienos /nakties ciklas) su laisvos prieigos prie vandens ir graužikų čiau. Visi bandymai su gyvūnais buvo atliekami nuoseklumo su licencija iš Zhejiang Province Mokslo ir technologijų tarnybos (Hangzhou, Kinija) ir su patvirtinimo iš gyvūnų etikos komiteto Zhejiang Kinijos medicinos universitete. Visi eksperimentai atitiko gaires etiško elgesio globos ir naudojimo gyvūnų. Visos pastangos, kad sumažintų streso gyvūnų.
Žiurkės badavusios 12 h buvo atliktas vieną injekciją į pilvą iš streptozotocin (STZ), 50 mg /kg kūno svorio, šviežiai, ištirpinto 100 mM natrio citrato buferis, kurio pH 4,5. Amžius atitikimo normalus žiurkės gavo tik citrato buferį. Plėtros diabeto buvo patvirtinta badavimo gliukozės kiekis kraujyje (FBG) lygius naudojant reagentą komplektas (Roche ", Šanchajus, Kinija). buvo laikomi Žiurkės su FBG koncentracija viršija 11,1 mm (200 mg /dl) po 72 h po STZ injekcijos būti diabetinės žiurkės. Kai žiurkės tapo diabetu, jų gliukozės koncentracija buvo matuojama kasdien. Eksperimentai prasidėjo po 8 savaičių diabeto vystymąsi leisti gastroparezę plėtoti.
Eksperimentinio projektavimo
aštuonias savaites po diabeto vystymąsi, gyvūnai buvo suskirstyti į keturias grupes, ty normalius kontrolė vyrų žiurkes (I grupė), diabetinė Vyras žiurkės (II grupė), kurkuminas papildyta diabetu vyrai žiurkės (III grupė) ir kurkuminas papildyta kontrolė vyrai žiurkės (IV grupė). Žiurkės III ir IV grupių (n = 10 kiekvienam) buvo gydomi kasdien kurkuminas (150 mg /kg; I.G.) 6 savaites. Kurkuminas (grynumas > 95%) iš Fusong County gamtos biotechnologijos UAB (Jilin, Kinijos), buvo sustabdytas 0,5% m /t natrio karboksimetilceliuliozė (CMC-Na) tirpalo. Žiurkių I ir II grupės (n = 10 kiekvienas) gavo tik 0,5% CMC-Na tirpalą. Po gydymo 6 savaites, kad gyvūnai buvo paaukotos pagal etilo eterio anesteziją, kraujo surinktos filtruojant po šlaunikaulio venų kraujavimo ir serumo buvo atskirtas. Skrandžiai buvo greitai pašalinami, ir surinkta iš gyvūnų, audinio mėginiai buvo laikomi -80 ° C temperatūroje, kol neparuoštų biocheminių tyrimų. Skrandžio ištuštinimą, oksidacinis stresas, NF-κB aktyvavimo, ICCS ir SCF /komplektas išraiška skrandžiai taip pat buvo studijavo šeštą gydymo savaitę pabaigos (14 -osios savaitės diabeto).
Skrandžio ištuštinimą studijas
Standartinis metodas ruošiant fenolio raudonasis žymeklis patiekalą buvo naudojamas kaip aprašyta anksčiau [17]. Skrandžio ištuštinimą buvo nustatomos naudojant keletą anksčiau pranešė procedūros [18] pakeitimus. Žiurkės buvo leista nemokamai naudotis vandeniu, kol 3 h prieš įvedant pro skrandžio zondą administravimo Kurkuminas. 0,1% (m /t) fenolio raudonasis, vandeninis natrio karboksimetilceliuliozės (1,5% m /v) buvo naudojamas kaip maisto mėginį. Kurkuminas buvo suteiktas 1 val iki peroralinio skystą maistą. Dvidešimt minučių po to, kai maisto mėginį administravimo, žiurkės buvo paaukotos. tada skrandžiai buvo veikiami laparotomija ir pašalintas. Žiurkėms, gavusioms su transporto priemonės (fiziologiniu tirpalu, 0,9% natrio chlorido tirpalas, 0,2 ml) buvo paaukotos iš karto po to, kai per burną bandymo miltų ir fenolio raudonojo kiekio skrandžio buvo laikoma, kad standarto (100%). Pašalinami skrandžiai buvo įpjauti 40 ml NaOH tirpalo (0,1 N) ir turinys buvo ištirpinta. 1-ml alikvotinė skalbimo sprendimų buvo įtraukta į 2 ml trichloracto rūgšties (7,5% m /t), kad susidarytų nuosėdos baltymus. Po centrifugavimo (2500 × g
) 20 min, 1 ml supernatanto buvo įtraukta į 1 ml NaOH (1 N) sukurti didžiausią spalvos intensyvumas. Absorbcija 558 nm bangos ilgiui, po to tirpalas buvo matuojamas naudojant spektrofotometrą (U-1080; Hitachi Ltd, Tokijas, Japonija). Skrandžio ištuštinimą buvo apskaičiuojamas pagal šią formulę: skrandžio ištuštinimą %
=
1
- CR.LT X
/
Y
×
100

kur X yra fenolio absorbcija raudona likę skrandžio 20 min po fenolio raudonojo administravimo ir Y yra tai absorbcija fenolio raudonojo atsigavo nuo kontrolinės pelių skrandžius karto po fenolio raudonojo administracija.
nustatymas MDA ir SOD lygių lygiųjų raumenų skrandžio antralinėje dalyje
skrandžiai buvo pašalintų, pasverti, ir iš karto užšaldyti -70 ° C temperatūroje. Sušaldytos audinių iš kiekvienos žiurkės buvo homogenizuoti ledinio fosfatinis buferis (KCl 140 mm, fosfatas 20 mM, pH 7,4) ir centrifuguojamas 3000 × g
10 min. Iš malonaldehyde kiekis (MDA), prašymas dėl lipidų peroksidacijos indeksas, apskaičiuotas pagal tiobarbitūro rūgštis (TBA) metodą su nežymiais pakeitimais [19]. Trumpai, 100 pL audinių homogenato buvo sumaišyti su 200 pL darbo tirpalas, kuriame yra 0,37% TBA. Mišinys inkubuojamas esant 100 ° C temperatūroje 15 min, o vėliau atvėsinta. Išgauti MDA, buvo įtraukta 375 mikrol, N-butanolio, o po to purtant energingai 10 s. Po centrifugavimo, viršutinė N-butanolio sluoksnis buvo perkeltas į stiklinį vamzdelį. Iš butanolio sluoksnio optinis tankis buvo matuojamas 532 nm bangos ilgiui. MDA kiekis išreiškiamas kaip nmol /mg baltymo. Matavimo SOD aktyvumo, 20 pL audinių homogenato buvo sumaišyti su 200 pL reakcijos tirpale, kurį sudaro nitrotetrazolio tetrazolio chlorido (NBT, 750 mikronų), ir inkubuojami už 20 min 37 ° C temperatūroje. Absorbcija esant 560 nm buvo matuojamas. Fermentinis aktyvumas yra išreikštas vienetų /g baltymų ir 1 vienetas fermento buvo apibrėžiamas kaip fermento kiekis, reikalingas slopina NBT sumažinti iki 50%.
Pusiau kiekybiniai RT-PGR matavimą SCF ir c-KIT
proksimalinė skrandžio (40-50 mg) buvo paruošta, ir gleivinė buvo pašalintas išpjaustymu. Audinių buvo mechaniškai homogenizuoti pagal RNazės-laisvųjų sąlygomis ir atskirti su Tripure izoliavimo reagento (Roche, Šveicarija) ant ledo 5 minutes, ir, kad bendras RNR buvo išskirta pagal gamintojo instrukcijas. Bendras RNR buvo įvertintas spektrofotometru prie 260 ir 280 nm bangos ilgiui, su A260 /A280 santykis svyruoja nuo 1,8 iki 2,0. RNR vientisumas buvo patikrinta agarozės gelyje elektroforezės, o po to etidžio bromido dažymo, ir RNR buvo naudojamas nedelsiant atvirkštinės transkripcijos arba laikomi -80 ° C temperatūroje, RNazės-laisvojo vandens. Dviejų etapų atvirkštinės transkriptazės polimerazės grandininė reakcija (PGR) buvo atliktas naudojant Revertra ace-α- Pirma dalis kDNR sintezės komplektas (Tiangen Biotech, Pekinas, Kinija) ir 2 × Taq PGR pagrindinį mišinį (Tiangen biotechnologijų), atsižvelgiant į gamintojo instrukcijas. Fiksuota suma RNR (0,5 mikrogramų) buvo atvirkštinis transponuoti. Gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH) buvo pasirinktas kaip vidinis etaloninis tirpalas. Visi PGR pradmenys buvo suprojektuoti ir sintetinamas Biosune (Šanchajus, Kinija). Grunto sekas ir ilgiai PGR produktai yra taip: GAPDH, pirmyn: 5 '- GACAACTITG-GCATCGTGGA-3 ', atvirkštinės: 5 '- ATGCAGGGATGATGT-TCTGG-3 ' 150 BP; SCF priekį: 5 '- GGA CTT CAT GGT GGC, ATC TG-3 ', atvirkštinės: 5 '- Persijos įlankos bendradarbiavimo tarybos CTT GTA AGA CTT GAA TG-3 ', 285 BP; c-Kit, į priekį: 5 '- GTG GTT "AAA GGA AAC GCT CG-3 ', atvirkštinės: 5 '- Katė PPK TTT PVG PVG GTG CG-3 ', 400 BP. Reakcijos sąlygos buvo optimizuotą pagal kiekvieno iš genų, keičiant atkaitinimo temperatūra (58 ° C GAPDH, 58 ° C SCF, ir 62 ° C c-KIT) ir skirtingais numeriais PGR ciklų [20]. PGR produktai buvo atskirtos nuo 2% agarozės gelyje 100 V 30 minučių. Gelio vaizdai buvo rodomas skystųjų kristalų monitoriaus su ultravioletine transillumination PhotoDoc-ite sistemos įrengta CCD kamera (Bio-Rad gelis Doc 2000, Bio-Rad Laboratories ", Hercules, ĮA) ir saugomi intensyvumo analizė. Santykiniai iRNR lygiai pasirinktų genų buvo apskaičiuojamas kaip santykis su GAPDH išraiška.
Lygiai SCF, C-Kit IκB ir NF-κB įvertino Vakarų dėmė analizė
apie 50 mg audinio buvo paimtas iš netoli proksimalinio skrandį. Audiniai buvo supjaustyti mažais gabaliukais maždaug 0,25 cm 3, homogenizuoti ir ištirpta radijo imunoprecipitaciją tyrimas lizės buferiniame tirpale (Hushang Biotechnologijos, Šanchajus, Kinija), kurių sudėtyje 50 mM Tris, 150 mm NaCl, 1% NP-40, 0,5% natrio deoksicholatas, 1% natrio laurilsulfatas, 1 mM PMSF natrio orthovanadate, natrio fluoridas, etilendiamintetraacto rūgštis, ir leupeptiną, esant 4 ° C temperatūroje 30 minučių. Homogenatai centrifuguojamas 12 000 × g
5 minutes, esant 4 ° C, ir supernatantų, buvo surinkti ir naudojamas kaip bendro baltymo. Lygios sumos baltymų buvo atliekama elektroforezė SDS-PAGE 10% arba 15% poliakrilamido gelyje. Baltymai buvo perkeliamas ant nitroceliuliozės membranos (Hushang Biotechnologijos) iki semidry sugeriamojo. Membranos buvo užblokuotas su tri-druskų buferinio tirpalo 0,1% Tween 20 (TBST), kuriame yra 5% masės pieno 60 minučių kambario temperatūroje, ir tada imuninės-pernešama su tinkamai atskiestų pirminių antikūnų, esant 4 ° C temperatūroje per naktį. Po plovimo tris kartus su TBST, kad dėmės buvo inkubuojamos su HRP-konjuguoto antrinio antikūno 60 minučių kambario temperatūroje. Tada kompleksai buvo ryškinamos naudojant iChemi XR vaizdo gavimo sistema (WD9431A, Bomeike biotechnologijos, Kinija) su cheminės liuminescencijos reagentų (Tigsun Biologinis Mokslas Technology, Tiandzinas, Kinija). Pusiau kiekybinis buvo atliekama naudojant kiekį One "programinė įranga, versija 4.6.2 (Bio-Rad). buvo naudojami šie antikūnai: anti-SCF, 1: 200, c-KIT, 1: 200, anti-IκB ir anti-NF-κB 65 psl ir GAPDH, 1:. 500 (Hushang biotechnologijos, Šanchajus, Kinija)
kiekybinis NF-κB -DNA privalomu elektroforezės mobilumas pamainos tyrimo pervežimas branduolinių ekstraktai, pagaminti iš skrandžio lizatuose kaip aprašyta anksčiau [21]. NF-κB aktyvacijos lėmė elektroforezės mobilumas pamainos tyrime (EMSA), ir branduolinės perkėlimas NF-κB buvo įvertintas kaip aprašyta anksčiau (GS009, Beyotime Biotechnologijos institutas, Šanchajus, Kinija) [22]. Už NF-κB privalomas reakcijas, 5 mikrogramų branduolinės baltymų ekstrakto buvo inkubuojamos kambario temperatūroje 20 min su reakcijos buferinio tirpalo, kuriame yra 20 mM HEPES, pH 7,9, 50 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 5% glicerolio, 200 mikrogramų /ml BSA, ir 2 mikrogramai iš poli (di-dC). Tada 32P žymėto dukart per dideles oligonukleotidas (1 ng ≥1 × 105 CPM), kuriame NF-κB įpareigojantį sutarimą seka (5 '- GGCAACCTGGGGACTCTCCCTTT-3 ') buvo įtraukta į reakcijos mišinį už kambario temperatūroje dar 10 min. Reakcijos produktai buvo frakcionuotas ant ne-denatūravimo 6% poliakrilamido gelyje 60 min 350 V, kuri tada išdžiovinama ir atlikti pagal autoradiografiją esant -70 ° C temperatūroje per naktį. Dėl konkurencijos tyrimai, perteklius oligonukleotidas (100 kartų molinis perteklius) konkurentas buvo iš anksto inkubuojami su branduolinių ekstraktų 20 min kambario temperatūroje. Mutantas NF-κB oligonukleotidas (5 '- GGCAACTGCTCACTCTCCCTTT-3 ') buvo naudojamas konkurencijos analizę. Signalai buvo densitometrically analizuojami.
Double immunofluorohistochemistry su terminalo deoksinukleotidiltransferazės tarpininkaujant dUTP-biotinas slapyvardį pabaiga ženklinimo tyrime (TUNEL) ir c-KIT dažymo pervežimas fluorescencijos imunohistocheminiu C-Kit (naudojant antikūnus nuo Santa Cruz) ir Tünel dažymo buvo atlikta 10-mikrometrai skyriuose naudojant paskelbtą pagal Tünel komplektas gamintojo (BLSK sTdT, Trevigen Inc, Gaithersburg, MD) tvarkos pakeitimą. TUNEL teigiami ląstelės buvo paženklinti fluoresceino (Ex 488, em 505-550), C-KIT-teigiami ląstelės buvo paženklinti Cy3 (Ex 543, J. 560-615), o branduoliai buvo paženklinti DAPI (Ex 364, Em 385 -470). Audinių mėginiai buvo įdėta fluorescencinės montavimo terpę ir tiria confocal skenavimo lazeriu mikroskopijos [23]. Maždaug 200 ląstelės buvo skaičiuojami už srityje, penki laukai buvo išnagrinėti už stiklelio ir penkios skaidrės išnagrinėjo vienai grupei. Į TUNEL- procentai ir C-KIT-teigiamas Apoptozinės ląstelės žymimi apoptozės indeksas (AI) (%).
Statistinė analizė
Visi duomenys yra pateikiami kaip reiškia ± SD. Norėdami palyginti duomenis tarp grupių gyvūnų, į vieną pusę dispersinė analizė (ANOVA) ir Duncan palyginimų buvo įdarbinti. Visi statistiniai bandymai buvo atliekami naudojant SPSS for Windows ", versija 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Skirtumai buvo laikomi statistiškai reikšmingi, kai p
< 0,05.
Rezultatai
poveikis Kurkuminas apie kūno svorį ir gliukozės diabetinės žiurkių
Plazminiai gliukozės koncentracija kraujyje buvo labai padidėjęs diabetu žiurkėmis (II grupė) [(322 ± 41) mg /dl], palyginti su įprastomis kontrolės žiurkių (I grupė) [(98 ± 12) mg /dl]. Ten buvo labai sumažėjusios kūno svoris II grupės žiurkių [(298 ± 16) g], palyginti su atitinkamo amžiaus I grupės žiurkių [(449 ± 21) g]. Lėtinis kurkuminas gydytų cukriniu diabetu žiurkės (III grupė) neparodė jokių reikšmingų patobulinimų kūno svorio ir Nr plazmos gliukozės kiekį kraujyje sumažėjimas, palyginti su II grupės žiurkių [III grupė, kūno svorio (324 ± 19) g ir gliukozės (302 ± 38) mg /dL] (1 lentelė) .table 1 Kraujo gliukozės lygis ir kūno svorio į keturias grupes
Grupės
I grupė

II
III grupė
IV grupė
Kraujo gliukozės kiekis (mg /dl),
98 ± 12
322 ± 41 *
302 ± 38 * #
100 ± 11
Kūno svoris ( g)
449 ± 21
298 ± 16 *
324 ± 19 *
476 ± 27
I grupė = normalus kontrolės žiurkės; II grupė = diabeto kontrolė žiurkės; III grupė = diabetinė + kurkumino žiurkes (150 mg /kg); IV grupė = normalus + kurkuminas žiurkes (150 mg /kg). Rezultatai pateikti kaip vidurkis ± SD. * P
< 0,05 (palyginti su I grupė), #P
> 0,05 (palyginti su II grupė)
poveikis Kurkuminas skrandžio ištuštinimo
skrandžio ištuštinimą buvo gerokai vėluoja SD žiurkėmis, kad turėjo diabetą 8 savaites. , Iš skrandžio ištuštinimo suma II grupėje buvo 44,3 ± 5,7%, kuris buvo gerokai mažesnis nei I grupės [(76,2 ± 4,3)%, P, pervežimas < 0.01], ir diabetinė žiurkės vyksta kurkuminas gydymas [(III grupė) ,; (59,4 ± 7,5)%, p
< 0,05]. Tačiau jokio reikšmingo skirtumo pasižymėjo tarp I grupės ir IV grupės žiurkių [(73,3 ± 5,2%), p
> 0,05] (1 pav). 1 pav poveikis Kurkuminas skrandžio išsituštinimą diabetu žiurkėms. Aš grupė = normalus kontrolės žiurkės (n = 10); II grupės = diabeto kontrolė žiurkės (n = 10); III grupė = diabetu + kurkuminas žiurkes (n = 10); IV grupė = normalus + kurkuminas žiurkes (n = 10). Visos vertės yra išreiškiamos kaip vidurkis ± SD. * P
< 0,01 (palyginti su I grupė), # p
< 0,05 (palyginti su II grupė), äp
>. 0,05 (palyginti su I grupė)
Kurkuminas gydymas sumažėjo MDA formavimas, didina SOD aktyvumas
Mes tyrėme oksidacinį stresą, naudojant keletą metodų, nes gliukozės sukeliamo oksidacinio streso buvo postuluojama, kad pagrindinis mechanizmas lėtinių diabeto komplikacijų. Diabetinė žiurkės eksponuojami padidėjo MDA lygiu [I grupės 15,7 ± 1,7 (nmol /mg) prieš pervežimas II grupės 27,9 ± 2,1 (nmol /mg), P
= 0,006] ir sumažėjęs SOD lygiai [I grupė 146,2 ± 9,3 ( u /mg) vs
II grupės 107,9 ± 7,5 (U /mg), P
= 0,008], molekulinis žymuo oksidacinio streso (Figure2). Šešias savaites kurkuminas gydymo sumažino MDA ląstelę laipsnį [III grupėje 21,4 ± 1,8 (nmol /mg), P
= 0,033, lyginant su I ir P GROUP UAB = 0,004, lyginant su II grupės] ir pagerino SOD žemyn -regulation [III grupė 126,2 ± 8,8 (vnt /mg) P
= 0,036, lyginant su I ir grupės P
= 0,001, lyginant su II grupės]. Kurkuminas gerokai sustiprinti SOD aktyvumą ir sumažinti MDA kiekį skrandžio homogenatai. Be to, nėra didelio skirtumo nebuvo pastebėta tarp I grupės ir IV grupės gyvūnų (P
> 0,05; Figure2). 2 paveikslas poveikis Kurkuminas apie MDA ir SOD cukriniu diabetu žiurkėms. Į MDA koncentracija sumažėjo po gydomi Kurkuminas, iš SOD lygiai buvo padidinta po gydomi Kurkuminas. : I grupė = Įprastą kontrolės žiurkes (n = 10); : II grupė = diabeto kontrolė žiurkės (n = 10); III grupė = diabetinė + kurkumino žiurkes (n = 10); IV grupė = normalus + kurkuminas žiurkes (n = 10). Visos vertės yra išreiškiamos kaip vidurkis ± SD * p
. ≪ 0,01 (palyginti su I grupė), # p
< 0,01 (palyginti su II grupė), äp
> 0,05 (palyginti su I grupė).
Kurkuminas padidina SCF c-kit baltymo koncentracija
Atstovybės vaizdus AT-PGR analizės SCF skrandyje audinių žiurkių kiekvienoje grupėje yra parodyta Figure3A. Palyginti su I grupės SCF buvo žymiai mažesnis II grupės [(0,44 ± 0,02) vs
(0,69 ± 0,03), P
= 0 0,002], o iš III grupės vertybių palyginimas parodė, kad SCF lygis kurkuminas gydytų žiurkių buvo didesnis nei II grupės [(0,58 ± 0,04) vs
(0,44 ± 0,03) P
= 0, 003]. Tačiau jokių skirtumų nebuvo pastebėta tarp I ir IV grupių [(0,69 ± 0,03) vs
(0,66 ± 0,03) P
= 0,56] (Figure3B). Vakarų dėmė analizė (Figure4A B) parodė, kad SCF lygis skrandžio audinių iš II grupė žiurkių buvo gerokai mažesnis nei I ir III grupės žiurkių [rodikliai (0,33 ± 0,02) vs
(0,47 ± 0,03) ir (0,41 ± 0,02), atitinkamai, p
< 0 0,05)]. Tačiau jokio reikšmingo skirtumo nerasta tarp IV grupės ir I grupės žiurkių [(0,45 ± 0,03) vs
(0,47 ± 0,03), P
> 0,05)], o tai rodo, kad kurkuminas intervencija galėtų efektyviai atkurti vietos SCF baltymų kiekį skrandžio audinių diabetu žiurkėms. 3 pav pokyčiai SCF /GAPDH ir c-KIT /GAPDH RT-PGR analizei. (A) atstovaujamoji vaizdai gelio elektroforezės GAPDH, SCF, ir C-Kit žiurkėms kiekvienai grupei. (B) Grupės lygis santykinis iRNR raiška SCF ir C-KIT, su produktais, kiekybiškai santykis GAPDH. : I grupė = Įprastą kontrolės žiurkes (n = 10); II grupės = diabeto kontrolė žiurkės (n = 10); III grupė = diabetu + kurkuminas žiurkes (n = 10); IV grupė = normalus + kurkuminas žiurkes (n = 10). Visos vertės yra išreiškiamos kaip vidurkis ± SD. * P
< 0,01 (palyginti su I grupės), # p
< 0,05 (palyginti su II grupė), äp
>. 0,05 (palyginti su I grupė)
4 pav pokyčiai SCF /GAPDH ir c-kIT /GAPDH Vakarų blot analizė. (A), atstovas baltymų band vaizdai SCF, C-rinkinys, o glyceraldehydes-3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH). (B) grupė lygiai santykinio SCF ir c-KIT baltymų išreikštą santykiu GAPDH, atitinkamai. : I grupė = Įprastą kontrolės žiurkes (n = 10); II grupės = diabeto kontrolė žiurkės (n = 10); III grupė = diabetu + kurkuminas žiurkes (n = 10); IV grupė = normalus + kurkuminas žiurkes (n = 10). Visos vertės yra išreiškiamos kaip vidurkis ± SD. * P
< 0,01 (palyginti su I grupė), # p
< 0,01 (palyginti su II grupė), äp
>. 0,05 (palyginti su I grupė)
AT-PGR analizė parodė, kad sąvoka lygiai c-KIT skrandžio audinių buvo 0.78 ± 0.04, 0,37 ± 0,02 ir 0.59 ± 0,03 grupių I, II ir III, atitinkamai. C-rinkinys ekspresijos lygis grupėse II ir III žiurkės buvo mažesnis nei I grupės žiurkių. Tačiau, iš grupių į II ir III palyginimas parodė, kad c-Kit lygis kurkumino-gavusių žiurkių buvo didesnis nei ta, negydomoje cukriniu diabetu žiurkių (P
< 0,05, Figure3B). Panašūs rezultatai buvo įrodyta Vakarų dėmė analizė (Figure4B). C-KIT baltymų kiekis (santykis 0,45 ± 0,03, 0,21 ± 0,02 ir 0,34 ± 0,02, atitinkamai, už kurios I, II ir III) buvo daug didesnis III grupės nei II grupėje (p
< 0 0,05, Figure4B), o III grupės lygis buvo žemesnis nei I ir IV grupes. Abu tyrimai rodo, kad 6 savaites kurkuminas intervencijos gali žymiai atkurti C-KIT lygių sumažėjimą diabetu žiurkėms.
Kurkuminas slopina I-κB degradacija ir NF-κB aktyvacijos
ataskaitos rodo, kad padidėjo ir lėtinis oksidacinis stresas gali įjungti ar jaudinti NF-κB veiklą [24]. Mes ištirti, ar kurkuminas gali sukelti aktyvavimo NF-κB signalizacijos keliu. Norėdami tai padaryti, mes išmatavo NF-κB lygius buvimą ar nebuvimą Kurkuminas nustatyti, ar NF-κB buvo aktyvuota. Pirma, mes įvertino baltymų lygius I-κB, kuriai inaktyvuotas NF-κB jungiasi. Mes nustatėme, kad I-κB lygis I grupės žiurkių buvo didesnis nei II grupės žiurkių, o III grupės žiurkių lygis buvo mažesnis nei II grupės žiurkių (p < 0,01), tačiau didesnis nei į lygių grupės I ir IV žiurkės (p < 0,05). Tada mes išnagrinėti, ar kurkuminas gali blokuoti NF-κB. Mes nustatėme, kad cukrinis diabetas (II grupė) lėmė NF-κB kraujyje padidėjimu [I grupės 75,5 ± 7,7 (pg /ml) vs pervežimas II grupės 102,8 ± 12,4 (pg /ml), P
= 0,001] , o gydymas su kurkumino [III grupė 91,3 ± 8,9 (pg /ml)] užkirstas kelias šį poveikį. Remdamasi šia išvada, mes pasiūlėme, kad kurkuminas slopina aktyvavimo NF-κB [IV grupė 70,9 ± 8,1 (pg /ml), P pervežimas = 0,026] (Figure5). Mes išnagrinėti, ar kurkuminas gali blokuoti NF-κB perkėlimas į branduolį, nes branduolinė translokacijos, yra apskaitomas kaip ląstelių reakcijos į ROS stimuliacijos ir, atrodo, kad jie koreliuoja su NF-κB sąlygojamą transkripcijos aktyvavimo. Norėdami tai įvertinti, mes matuojamas NF-κB lygį, kurį EMSA branduolį. Plėtros diabeto sukelta in NF-κB lygių branduolio padidėjimą, o gydymas Kurkuminas išvengti šio efekto (Figure6). Taigi, mes pasiūlėme, kad kurkuminas ne tik netiesiogiai slopina aktyvavimo NF-κB-DNR privaloma, tačiau ji taip pat slopina aktyvacijos prieš I-κB. 5 paveikslas poveikis Kurkuminas ant I-κB ir NF-κB. (A), juosta grafikas buvo aišku, atspindys I-κB ir NF-κB lygio tarp keturias grupes. (B) I-κB /GAPDH lygis sumažėjo II grupės, tačiau padidėjo Kurkuminas. I dalis: I grupė = Įprastą kontrolės žiurkes (n = 10); II: II grupė = diabeto kontrolė žiurkės (n = 10); III DALIS: III grupė = diabetu + kurkuminas žiurkes (n = 10); IV dalis: IV grupė = normalus + kurkuminas žiurkes (n = 10). Visos vertės yra išreiškiamos kaip vidurkis ± SD * p
. ≪ 0,01 (palyginti su I grupė), # p
< 0,01 (palyginti su II grupė), äp
> 0,05 (palyginti su Visi autoriai skaityti ir patvirtino galutinį rankraštį.

• Pancreaticogastrostomy gryno laparoskopinės pancreaticoduodenectomy-romano kasos-skrandžio anastomozės technika -
• Genų ekspresijos analizė Helicobacter pylori infekuotų ir aukštos druskos dietos gydytų pelių skrandžio naviko modelio identifikavimas CD177 kaip naują prognostinis faktorius pacientams, serga…